巨球百合無菌播種影響因素的研究

馬怡迪，李岳，李丹青，任梓銘，夏宜平

(浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 杭州 310058)

巨球百合(Lilium brownii F. E. Brown ex Miellez var.giganteum) 是野百合(L. brownii)的變種。野百合鱗莖直徑2 ～4.5 cm，而巨球百合在野生狀態(tài)下鱗莖直徑可達10 ～12 cm，鱗片100 余枚，花冠淡黃色，通常有5 ～8 朵花，因其鱗莖特大，富含礦質(zhì)元素硒，花多而美麗，可供藥用、食用及觀賞，是百合育種的優(yōu)良基因材料，具有較高的開發(fā)利用價值[1–2]。

無菌播種獲得組培苗是一種有效的保存珍稀植物的方法，成功的離體組織培養(yǎng)能夠在短時間內(nèi)獲得大批量的植物材料[3]。有關(guān)光照、溫度等因子對百合屬種子萌發(fā)的影響已有較多報道[4–11]，而有關(guān)種子無菌播種的研究主要集中在蘭科植物[12–18]，百合屬植物此方面的研究報道較少。吳昀等[19]、崔祺等[20]和向地英等[21]經(jīng)研究得出了藥百合(L. speciosum Thunb. var.gloriosoides Baker)、淡黃花百合(L. sulphureum Baker)和百合雜交種子無菌播種的最適培養(yǎng)基配方。杜方等[22]認為巨球百合與野百合的聚類很近。百合屬植物種子無菌播種已有報道，說明其種子無菌播種可行性強。巨球百合鱗莖資源珍稀，不易獲得種球，屬需保護的稀有野生種質(zhì)資源，因此，其種子無菌播種的研究具有理論和實踐意義。

本試驗以巨球百合種子為材料，比較不同激素配比的培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響，旨在找出巨球百合種子萌發(fā)的最適激素配比，為保護巨球百合野生種質(zhì)資源，加快無性繁殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2014年8月下旬于浙江省溫州市海島采集的已成熟野生巨球百合蒴果。選擇飽滿、胚清晰(胚長≥1/2 種長)的種子為試驗材料(圖1)。種子千粒重為4.689g。

圖1 巨球百合種子 Fig. 1 Seeds of L. brownie F. E. Brown ex Miellez var.giganteum

試驗所用基本培養(yǎng)基均為MS 培養(yǎng)基，并添加9 種不同配比的6–BA 及NAA，以不添加任何激素的MS 培養(yǎng)基(空白培養(yǎng)基)為對照，培養(yǎng)基的pH 值為5.9。培養(yǎng)基在121℃滅菌20min。具體配方見表1。

表1 培養(yǎng)基配方 Table 1 The formula of different culture mediums

1.2 方法

試驗于2014年9月至2015年2月在浙江大學觀賞植物生長發(fā)育與分子生物學實驗室進行。無菌培養(yǎng)室光照度約2 000 lx，每天光照14 h，溫度(25±2 )℃。試驗參考吳昀等[19]的藥百合種子無菌播種的方法進行。將種子置于添加吐溫–20 及洗潔精各1 ～2 滴的水溶液中浸泡 30min，去除浮起的干癟種子，流水下沖洗 2 h，75%乙醇消毒30 s，2% NaClO 振蕩處理6min，無菌重蒸水沖洗5 ～6次，放濾紙上吸干水分。將經(jīng)過處理的種子平均分成2份：1 份作剝皮處理；另一份種子不剝皮。之后，分別接種于10個培養(yǎng)基(表1)上，每個處理接種10粒種子，重復(fù)4次。

1.3 觀察與統(tǒng)計方法

種子接種試驗開始后每天觀察1次，記錄種子開始萌發(fā)時間，之后每隔3 d 觀察和統(tǒng)計1次。接種至第45天時統(tǒng)計萌發(fā)率、誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)芽數(shù)等，并于第45天時將萌發(fā)種子轉(zhuǎn)入含空白培養(yǎng)基的柱形瓶中，每瓶轉(zhuǎn)接5 粒，在柱形瓶中生長45 d 后統(tǒng)計小鱗莖數(shù)，測量小鱗莖寬度及小鱗莖高度等指標，其中，種子萌發(fā)以胚根和幼芽突破種皮為準[23]。

萌發(fā)率=(發(fā)芽種子數(shù)/總接種種子數(shù))×100%；

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出芽的種子數(shù)/總接種種子數(shù))× 100%；

誘導(dǎo)芽數(shù)=誘導(dǎo)芽總數(shù)/分化芽的種子數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS 20對數(shù)據(jù)進行方差分析和因素內(nèi)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 剝皮處理對巨球百合種子萌發(fā)的影響

無菌播種45 d 時統(tǒng)計的萌發(fā)率(表2)表明，10個不同培養(yǎng)基處理中有8個剝皮處理種子的開始萌發(fā)時間早于不剝皮處理；8個剝皮處理種子高峰期延續(xù)時間均短于不剝皮處理種子；9個不剝皮處理種子的萌發(fā)率在70.0%以上，不同編號培養(yǎng)基之間差異不顯著，而10個剝皮處理種子的萌發(fā)率均在77%以上，且大部分剝皮處理種子的萌發(fā)率略高于不剝皮處理。綜合來看，剝皮處理較不剝皮處理更有利于巨球百合種子的萌發(fā)。

表2 不同培養(yǎng)基與種子剝皮與否對種子萌發(fā)的影響 Table 2 Effects of different culture mediums and peeling treatments onseedgermination

2.2 不同激素配比對剝皮種子萌發(fā)的影響

剝皮處理種子生長45 d 時，1 號和6 號培養(yǎng)基上的種子的萌發(fā)率均達到100%(表3)，顯著高于3、5、9、10 號培養(yǎng)基處理；1 號培養(yǎng)基上的種子誘導(dǎo)率達90.0%，顯著高于2、3、5、6、7、8、9 號培養(yǎng)基處理，且其莖和根也較長，生長勢良好(圖2)；對誘導(dǎo)芽數(shù)而言，不同編號培養(yǎng)基之間并無顯著差異。綜合分析，1 號培養(yǎng)基激素配比更有利于巨球百合種子的萌發(fā)。

表3 不同培養(yǎng)基對剝皮種子萌發(fā)的影響 Table 3 Effects of different culture mediumson thegermination of seeds with peeling treatment

圖2 不同培養(yǎng)基上生長45 d 的巨球百合種子(剝皮處理) Fig.2 Seeds(with peeling treatment)after 45 days'growthon different culture mediums

2.3 萌發(fā)種子轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基后生長45 d 的情況

從表4 和圖3 可知，不同編號培養(yǎng)基上的萌發(fā)種子轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基生長45 d 后，在小鱗莖數(shù)、小鱗莖高度、小鱗莖寬度、葉片數(shù)以及生根數(shù)等指標上表現(xiàn)出了差異，其中3 號培養(yǎng)基上的小鱗莖個數(shù)較多(圖4)，平均達3.57個，顯著高于其他處理，2、6 和8 號培養(yǎng)基上的小鱗莖個數(shù)亦較多，顯著高于對照。

表4 萌發(fā)種子轉(zhuǎn)接后生長45 d 的各項生長指標 Table 4 Thegrowth ofgermination seeds after transferred to MS basal medium for 45 days

圖3 萌發(fā)種子轉(zhuǎn)接后生長45 d 的觀察結(jié)果 Fig. 3 Thegrowth ofgermination seeds after transferred to MS basal medium for 45 days

圖4 3 號培養(yǎng)基上的種子轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基45 d 后獲得的叢生小鱗莖 Fig.4 Clumping bulblets from seeds in No.3 Medium after transferred to MS basal medium for 45 days

3 結(jié)論與討論

百合屬種子具有堅厚的種皮，會對種子萌發(fā)形成較大的機械阻礙，使其不能吸收足夠水分，導(dǎo)致生長停滯、萎縮甚至死亡[19,24]。有研究[19–20,24–25]表明，通過預(yù)冷、預(yù)熱處理擦破種皮，或直接剝除種皮，可以顯著提高種子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率，本試驗結(jié)果與其結(jié)論接近。孫葉等[18]發(fā)現(xiàn)，利用NaClO 溶液預(yù)處理蘭花雜交種子，能明顯提高其萌發(fā)率。在本試驗中，采用NaClO 溶液振蕩處理巨球百合種子，既能對種子進行消毒，又能腐蝕種皮，同時溶解一些種皮內(nèi)含有的酸性抑制物，且在實際操作中，延長無菌水沖洗時間，可一定程度軟化種皮，去除種皮表層的蠟質(zhì)和油脂，增強皮透性，減輕剝皮處理難度，提高萌發(fā)率[18–19]。

吳昀等[19]得出藥百合種子無菌播種最適培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6–BA + 0.1mg/L NAA；向地英等[21]和周曉杰等[25]均認為MS+1.0mg/L 6–BA +0.01mg/L NAA 為百合雜交種子無菌播種的最適培養(yǎng)基。綜合考慮各因素，巨球百合種子萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6–BA+ 1.0mg/L NAA。此培養(yǎng)基培養(yǎng)巨球百合種子，種子萌發(fā)率為100.0%，誘導(dǎo)率為65.0%，平均誘導(dǎo)不定芽1.28個，轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基生長45 d 后，平均形成小鱗莖2.35個，平均生成3.6片葉，生根6.7 條，萌發(fā)種子轉(zhuǎn)接后的各項生長指標均優(yōu)于1 號培養(yǎng)基，且植株生長比1 號培養(yǎng)基的植株健壯，說明1.0mg/L 6–BA 的培養(yǎng)基較適合百合屬種子萌發(fā)，這與前人的研究結(jié)果相符。當細胞分裂素與生長素的比值高時，6–BA 和NAA 的不同配比可誘導(dǎo)芽的分化；比值低時，則促進根的生成[26]。從吳昀等[19]、向地英等[21]、周曉杰等[25]和本試驗結(jié)果來看，最適培養(yǎng)基中的細胞分裂素與生長素的比值均較高，所對應(yīng)的誘導(dǎo)芽數(shù)也較多，充分印證了這一觀點。

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