UPLC測(cè)定丹七片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量

孫英英,郭玉海,林華慶,余楚欽,張倫,羅程佳

(1.廣東藥學(xué)院 藥物研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)院 骨一科，廣東 廣州 510006)

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UPLC測(cè)定丹七片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量

孫英英1,郭玉海2,林華慶1,余楚欽1,張倫1,羅程佳1

(1.廣東藥學(xué)院 藥物研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)院 骨一科，廣東 廣州 510006)

目的 建立超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)分離測(cè)定丹七片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量。方法 采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫30 ℃，以乙腈(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣體積2 μL。結(jié)果 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別在0.0300～0.3000，0.1201～1.2009，0.1200～1.1997 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法重復(fù)性及回收率均符合要求，平均加樣回收率(n=6)分別為100.43%、100.65%、98.74%，RSD值分別為1.51%、1.30%、1.03%。按測(cè)定的方法測(cè)定市售2種丹七片的含量相近。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，分析速度提高近8倍，可以用于測(cè)定丹七片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量。

丹七片；ULPC；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；含量測(cè)定

丹七片為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的品種，由丹參和三七兩味藥材組成，功能為活血化瘀，臨床上用于血瘀氣滯，心胸痹痛，眩暈頭痛，經(jīng)期腹痛[1]。據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，現(xiàn)有丹七片生產(chǎn)批號(hào)41個(gè)，對(duì)丹七片中三七成分的質(zhì)量控制，藥典[2]及許多雜志收載了采用高效液相色譜法[3-8,10-12]和薄層掃描色譜法[9]測(cè)定三七中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量，但分析速度慢，溶劑消耗量。超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比，不僅比傳統(tǒng)HPLC具有更高的分離能力，而且結(jié)束了人們多年不得不在速度和分離度之間取舍的歷史。使用UPLC可以在很寬的線速度、流速和反壓下進(jìn)行高效的分離工作，并獲得優(yōu)異的結(jié)果。已有學(xué)者采用UPLC法[13]測(cè)定三七藥材中3種皂苷的含量，但未見采用此法對(duì)丹七片中3種皂苷同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。因此，為高效控制丹七片的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，為丹七片的質(zhì)量控制提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 三七皂苷R1對(duì)照品(廣州齊云生物科技有限公司；批號(hào)140629、130410)；丹七片樣品1(北京某制藥廠，批號(hào) 12121276)；丹七片樣品2(福州某藥業(yè)有限公司，批號(hào)13070111)；人參皂苷Rg1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)131210)；人參皂苷Rb1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所批號(hào)，140316)。乙腈 (MERCK，HPLC級(jí))，水(屈臣氏蒸餾水)，其他試劑均為分析純。

Acquity UPLC System，包括四元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器及Empower色譜工作站(Waters公司)；超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100，100 W，40 KHz)。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照儲(chǔ)備溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含人參皂苷Rg11.6013 mg、人參皂苷Rb11.5996 mg、三七皂苷R10.3998 mg的混合儲(chǔ)備溶液，即得。

2.1.2 混合對(duì)照溶液的制備：精密量取混合儲(chǔ)備溶液適量，加甲醇制成每1 mL分別含人參皂苷Rg10.4003 mg、人參皂苷Rb10.3999 mg、三七皂苷R10.1000 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取本品(批號(hào)12121276)10片，去包衣，研細(xì)，取粉末(過4號(hào)篩)約0.3 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，超聲溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取丹參藥材10 g，用90%的乙醇提取2次，第1次用6倍量的乙醇提取1 h，第2次用4倍的乙醇提取0.5 h，將提取液減壓濃縮至稠膏。藥渣用6倍量的水提取2次，每次120 min，提取液濃縮至稠膏。向稠膏中以1:1量加入淀粉，混勻后放入60 ℃的烘箱中烘干，研磨成粉末，加入0.3%的硬脂酸鎂混勻，過四號(hào)篩，取粉末0.3 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱溫30 ℃，以乙腈(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫[乙腈-水體積比(下同)，0～5 min, 20:80～40:60; 5～7 min, 40:60～20:80; 7～10 min, 20:80]，流速0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm[2]，進(jìn)樣體積2 μL。分別精密吸取混合對(duì)照品和供試品溶液2 μL，按上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1與相鄰峰的分離度分別為56.98、4.67、31.71，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的理論塔板數(shù)分別為25043、30043、73979。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照溶液0.1、0.3、0.5、1、2、3、4 μL7份，注入超高效液相色譜儀，依法測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。見表1。

表1 3種皂苷對(duì)照品溶液的回歸方程

2.6 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)樣2 μL，依法測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，見圖1。

圖1 對(duì)照品、陰性對(duì)照品和供試品溶液的UPLC圖譜1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1Fig.1 UPLC chromatogram of reference substance,negative reference substance and sample substance solution1.notoginsenoside R1; 2.ginsenoside Rg1; 3.ginsenoside Rb1

2.7 精密度 取同一濃度的對(duì)照品溶液和供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的峰面積，照上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，對(duì)照品溶液的RSD分別為 0.28%、0.14%、0.19%，供試品品溶液的RSD分別為0.78%、0.84%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批丹七片樣品(批號(hào)12121276)粉末，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件分別在0、2、4、6、8 h測(cè)定。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的RSD分別為1.56%、0.41%、1.08%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別取同一批號(hào)樣品(批號(hào)12121276)6份，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果, 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的平均含量分別為4.82900、25.19850、18.22495 mg/g, RSD分別為 0.33%、0.60%、0.63%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品 (批號(hào)12121276 )，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，于25 mL量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液，其中三七皂苷R10.80458 mg、人參皂苷Rg12.38287 mg和人參皂苷Rb12.40933 mg，搖勻，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果。

表2 丹七片中3種皂苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品的含量測(cè)定 取2批丹七片，按測(cè)定方法操作，測(cè)定3次，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量，批號(hào)12121276丹七片3種皂苷的平均含量分別為24.9923 mg/g、18.2749 mg/g、4.9826 mg/g，批號(hào)13070111丹七片3種皂苷的平均含量分別為25.8095 mg/g、18.3795 mg/g、4.6716 mg/g。本文所測(cè)的2個(gè)批號(hào)的丹七片含量接近，且符合含量標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

與HPLC法相比，UPLC在不影響分離效果的情況下可顯著提高丹七片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的分析速度，6 min之內(nèi)即可將丹七片中3種待測(cè)成分完全分離，分析速度提高近8倍，改善分析效果，同時(shí)可減少溶劑的消耗。該方法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。表明UPLC適合中藥成分復(fù)雜體系的分離分析，是一種值得推廣應(yīng)用的綠色環(huán)保檢測(cè)技術(shù)。

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(編校：王冬梅)

Content determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Danqi tablets by UPLC

SUN Ying-ying1,GUO Yu-hai2,LIN Hua-qing1,YU Chu-qin1,ZHANG Lun1,LUO Cheng-jia1

(1.Drug Research Institute,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2.Department of Orthopedics,Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a method to determine the content of notoginsenoside R1,ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Danqi tablets by ultra performance liquid chromatography(UPLC).MethodsACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)column was used with mobile phase consisted of acetonitrile (A)-water(B)by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min and a column temperature of 30 ℃,the wavelength of detector was 203 nm,the injection volume was 2 μL.ResultsNotoginsenoside R1,ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1had good linearity within the range of 0.0300-0.3000,0.1201-1.2009,0.1200-1.1997 μg respectively.The average recoveries(n=6)were 100.43%,100.65%,98.74% and RSDs were 1.51%,1.30%,1.03%，respectively.According to the content determination method for the determination of two Danqi tablets sample were similar. ConclusionUPLC method is more convenient,efficient,accurate and excellent repeatability,analysis is nearly eight times faster,can be used for determination of notoginsenosideR1,ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Danqi tablets.

Danqi tablet; ULPC; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; content determination

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271625)

孫英英，女，在讀碩士，研究方向：藥劑學(xué)研究，E-mail：18814099672@163.com；林華慶，通訊作者，男，教授，研究方向：藥物新劑型研究，E-mail：huaqing_@vip.tom.com。

R914.1

A

1005-1678(2015)01-0148-03