丙氨瑞林對子宮內(nèi)膜癌Chk1/2和Plk1蛋白表達的影響研究

劉韻,蘭艷麗

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 襄陽 441021)

?

丙氨瑞林對子宮內(nèi)膜癌Chk1/2和Plk1蛋白表達的影響研究

劉韻,蘭艷麗

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 襄陽 441021)

目的 本文分析子宮內(nèi)膜癌患者Chk1/2和Plk1蛋白的表達變化及其相關性，并探討丙氨瑞林治療相關機制。方法 本文采用Real-time PCR及Western blot分析本院2009年5月～2013年5月診治的40例子宮內(nèi)膜癌患者接受丙氨瑞林治療后腫瘤組織中Chk1、Chk2、Plk1、Bcl2和Bax蛋白及caspases 3表達的差異性，并采用Spearman對plk1,Chk1,Chk2進行等級相關性分析。并以30例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織及癌旁組織為對照。結果 研究顯示Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax及caspase3表達明顯低于癌旁組織中的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而丙氨瑞林治療后子宮內(nèi)膜癌組織的上述蛋白異常表達均得到部分恢復。相關性分析顯示PIk1表達與Chk1和Chk2的表達具有正相關性。結論 丙氨瑞林通過抑制子宮內(nèi)膜癌組織上調(diào)的Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及下調(diào)的Bax及caspase3發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌的作用。

子宮內(nèi)膜癌；丙氨瑞林；細胞凋亡；細胞周期檢測點激酶

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)于絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性上皮組織，是僅次于卵巢癌和宮頸癌的引起死亡的婦科腫瘤[1-3]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病原因尚不明確，根據(jù)生物學行為特點一般分為雌激素依賴型和非雌激素依賴性[4-5]。細胞周期檢測點激酶(checkpoint kinase 1 and 2，Chk1/2)可對腫瘤放療及化療過程導致的DNA損傷進行修復，是細胞周期檢測點發(fā)揮主要作用的蛋白激酶[6-8]。Polo-like激酶(polo-like kinasel,PIk1)也可促使DNA修復，其主要在細胞分裂的M期發(fā)揮作用。細胞凋亡是細胞的程序化死亡過程，與腫瘤的生長、分化、增殖及轉(zhuǎn)移和侵襲過程密切相關[9-11]。目前對細胞周期檢測點蛋白在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病中的研究報道較少。本研究采用Real-time PCR及Western Blotting方法分析子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中Chk1/2和Plk1 蛋白及其mRNA的表達變化及其相關性，并探討丙氨瑞林治療子宮內(nèi)膜癌的相關機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究對本院2009年5月～2013年5月期間診治的40例接受丙氨瑞林治療后的子宮內(nèi)膜癌患者行手術切除，術后經(jīng)病理科檢查證實均為子宮內(nèi)膜癌樣本。研究中剔除內(nèi)分泌疾病患者、代謝疾病患者及自身免疫性疾病患者。40例患者中Ⅰ期26例，Ⅱ期10例，Ⅲ期4例，Ⅳ期0例。并以30例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織及癌旁組織為對照。2組患者在性別比例、年齡及腫瘤分期方面無統(tǒng)計學差異性。

1.2 Real-time PCR檢測相關蛋白的表達 熒光定量PCR(qRT-PCR)的擴增體系為2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。反應條件：95 ℃10 s，60 ℃ 40 s，共28個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳及熔解曲線鑒定qRT-PCR產(chǎn)物，并用公式(ΔCt)進行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。Real-time PCR引物序列如下：β-actin forward 5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’；Reverse 5’-CAGGAGGA-GCAATGATCTT-3’； Bax forward 5’-CCCGAGAGGTCTTTTTC-CGAG-3’；Reverse 5’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3’；Bcl2 forward 5’-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’;Reverse 5’-ACAG-TTCCACAAAGGCATCC-3’； caspase3 forward 5’-GACTCTGGAA-TATCC-CTGGgACAACA-3’;Reverse 5’-AGGTTTGCT-GCATCG-ACATCTG-3’。

1.3 Western blot檢測相關蛋白的表達 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織于冰水浴中進行充分勻漿，考馬斯亮藍法蛋白定量后以等量蛋白進行SDS-PAGE和半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后以1% BSA封閉2 h。然后與一抗溫孵24 h，PBS緩沖液漂洗3次后與HRP標記二抗 (1:200)室溫反應4 h，顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以β-actin作為參照，進行蛋白表達的定量分析。

2 結果

2.1 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織Chk1及Chk2的表達變化 本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中Chk1及Chk2的表達均明顯高于癌旁組織中的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而丙氨瑞林可以顯著抑制上調(diào)的Chk1及Chk2蛋白，且其表達與腫瘤組織相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織Chk1及Chk2的表達變化**P<0.01，與癌旁組織相比；##P<0.01，與腫瘤組織相比Fig.1 Changes of expression of Chk1 and Chk2 in endometrial carcinoma and adjacent tissue**P<0.01，compared with adjacent tissues；##P<0.01，compared with tumor tissue

2.2 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織PIk1的表達變化 本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中PIk1的表達均明顯高于癌旁組織中的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而丙氨瑞林可以顯著抑制上調(diào)的PIk1蛋白，且其表達與腫瘤組織具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織促凋亡蛋白Bax及caspase3的表達變化 本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中促凋亡蛋白Bax及caspase3的表達均明顯低于癌旁組織中的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而丙氨瑞林可以顯著抑制下調(diào)的Bax及caspase3蛋白，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織Bax及caspase3的表達變化。**P<0.01，與癌旁組織相比；##P<0.01，與腫瘤組織相比Fig.3 Changes in expression of Bax and caspase3 in endometrial carcinoma and adjacent tissue**P<0.01，compared with adjacent tissues；##P<0.01，compared with tumor tissue

2.4 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織抑制凋亡蛋白Bcl2蛋白的表達變化 本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中抑制凋亡蛋白Bcl2的表達均明顯高于癌旁組織中的表達，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而丙氨瑞林可以顯著抑制上調(diào)的Bcl2蛋白，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織Bcl2的表達變化**P<0.01，與癌旁組織相比；##P<0.01，與腫瘤組織相比Fig.4 Changes in expression of Bcl2 in endometrial carcinoma and adjacent tissue**P<0.01，compared with adjacent tissues；##P<0.01，compared with tumor tissue

2.5 子宮內(nèi)膜癌PIk1與Chk1和Chk2的相關性分析 本研究發(fā)現(xiàn)，在不同分期的子宮內(nèi)內(nèi)膜癌組織中，PIk1和Chk1/2的表達具有正相關性，且在III期子宮內(nèi)膜癌中的相關系數(shù)為1，見表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織中PIk1與Chk1和Chk2的相關性分析

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是多發(fā)于絕經(jīng)期女性子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，是婦科腫瘤中導致死亡的重要種類。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢，但是其發(fā)病機制尚未完全闡明。子宮內(nèi)膜癌在極早期無明顯癥狀，隨后便出現(xiàn)陰道不規(guī)則出血、陰道排液增加和陣發(fā)性下腹痛[12-13]。本研究采用實時定量PCR和Western blot方法分析子宮內(nèi)膜癌患者Chk1/2和Plk1蛋白的表達變化及其相關性，并探討丙氨瑞林治療相關機制，結果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及mRNA的表達明顯高于癌旁組織(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax及caspase 3表達明顯降低(P<0.01)。同時，丙氨瑞林治療后子宮內(nèi)膜癌組織的上述蛋白異常表達均得到部分恢復，且相關性分析也顯示PIk1表達與Chk1和2的表達具有正相關性。因此，丙氨瑞林通過抑制子宮內(nèi)膜癌組織上調(diào)的Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及下調(diào)的Bax及caspase 3發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌的作用。

細胞周期檢測點激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期檢測點激活途徑的終端蛋白。當細胞受到外界不利刺激時，細胞周期檢測點激酶可以激活細胞DNA的損傷檢測點，阻滯細胞處于非分裂期，完成DNA損傷的修復[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中的Chk1、Chk2表達明顯高于癌旁組織(P<0.01)，而丙氨瑞林可以顯著下調(diào)增強的Chk1、Chk2表達(P<0.01)，提示子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中存在較強的自我修復能力，能夠抵抗化學治療藥物或放射治療效果，而丙氨瑞林下調(diào)2者的表達，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。這與本文中發(fā)現(xiàn)的子宮內(nèi)膜癌組織中促凋亡蛋白Bax及caspase 3表達下調(diào)而抑制凋亡蛋白Bcl2表達上調(diào)抑制。以往的研究中也證實，化療藥物可以通過增強促凋亡蛋白如Bax及caspase家族表達、下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl2等表達發(fā)揮抗腫瘤的作用。本文中發(fā)現(xiàn)丙氨瑞林也具有增強促凋亡蛋白Bax及caspase 3、抑制Bcl2蛋白表達的作用，提示丙氨瑞林除了減弱腫瘤細胞DNA自我修復能力外，還可以直接抑制腫瘤上生長、促進腫瘤細胞凋亡的作用。PIk1也是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要參與了細胞分裂過程中心體的成熟以及染色體的分離過程，即主要作用于細胞分裂的M期[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中的PIk1表達也明顯高于癌旁組織，而丙氨瑞林可以顯著下調(diào)增強的PIk1表達。腫瘤放療或化療過程中，腫瘤細胞由于PIk1的作用而停留于M期，客觀上減弱了放療或化療對腫瘤細胞的殺滅作用。本研究中也發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中PIk1的表達明顯高于癌旁組織，而丙氨瑞林可以明顯降低增強的PIk1表達，提示丙氨瑞林也可以通過抑制PIk1表達、影響腫瘤細胞分裂周期而發(fā)揮抗腫瘤作用。這與以往的研究結論相一致[17-18]。

因此，丙氨瑞林通過抑制子宮內(nèi)膜癌組織上調(diào)的Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及下調(diào)的Bax及caspase 3發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌的作用。

[1] 劉杰，陶敏芳.子宮內(nèi)膜癌相關基因的研究進展[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版)，2014，34(3)：385-388.

[2] 劉涓.皮膚血管瘤組織中CHFR和PIK1的表達及意義[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2014，14(2)：111-116.

[3] 周文燕.胃腺癌中細胞周期檢測點激酶1、2和DNA雙鏈斷裂修復蛋白51的表達及意義[J].中國老年學雜志，2014，9(10)：2735-2736.

[4] 魏琳琳，王蕊，關淑梅.老年宮頸鱗癌患者癌組織中細胞周期檢測點激酶1、2和DNA雙鏈斷裂修復蛋白51的表達及意義[J].中國老年學雜志，2014，21(12)：3266-3268.

[5] 唐云強，何璐，唐輝，等.細胞周期檢測點激酶1在肝細胞癌中的表達及意義[J].中華肝臟外科手術學電子雜志，2014，11(4)：247-251.

[6] 劉子瑜，張潔清，莫哲倫，等.胰島素抵抗與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生相關性研究[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2014，7(9)：706-709.

[7] 祁昔琴，徐輝，李紅，等.子宮內(nèi)膜癌組織中腫瘤芽的表達與臨床病理特征及預后的關系[J].臨床與實驗病理學雜志，2014，16(9)：987-990.

[8] 王水英.中藥誘導腫瘤細胞凋亡的最新研究進展[J].臨床合理用藥雜志，2013，6(2)：165-167.

[9] 于志娟，馬曉欣，賈玖麗，等.HER-2/neu對雌激素依賴性子宮內(nèi)膜癌細胞信號通路(MAPK/ERK，PI3K/Akt)調(diào)控的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2013，12(2)：242-247.

[10] 房冰，王晶.年輕子宮內(nèi)膜癌保留生育功能的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2013，8(6)：1401-1404.

[11] 李敏，孟會彥，李紅艷，等.內(nèi)皮抑素對雌激素刺激下子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2013，11(2)3：2512-2513.

[12] 余佳文，程斌.欖香烯誘導腫瘤細胞凋亡分子機制研究進展[J].中國藥房，2013，7(35)：3348-3350.

[13] 盤昱良.腫瘤細胞凋亡檢測及腫瘤細胞檢測新方法研究[D].湖南大學，2013.

[14] 郝素威.子宮內(nèi)膜癌178例臨床特點及復發(fā)因素分析[D].河北醫(yī)科大學，2012.

[15] 王寧，王雅杰.細胞周期檢測點激酶2在調(diào)節(jié)DNA損傷以及維持染色體穩(wěn)定中的作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2012，9(2)：224-228.

[16] 殷玉峰，王慧，付金棟.CHFR及CHFR/PIK1途徑與胃癌發(fā)生的關系[J].山東醫(yī)藥，2011，12(41)：53-54.

[17] 張玉泉，曹斌融，張惜陰，等.丙氨瑞林治療后子宮內(nèi)膜癌細胞有絲分裂指數(shù)、細胞周期及超微結構的變化[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2000，7(4)：243-245.

[18] 仲建新，曹新平，王迪，等.丙氨瑞林對卵巢癌細胞增殖及凋亡的影響[J].天津醫(yī)藥，2008，13(7)：499-502.

(編校：譚玲)

Study on effect of alarelin on the expression of Chk1/2 and PIk1 in endometrial cancer

LIU Yun,LAN Yan-Li

(Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei College of Arts and Science, Xiangyang 441021, China)

ObjectiveTo investigate the expression and relationship of Chk1/2 and PIk1 in endometrial cancer as well as the therapeutic mechanism of alarelin.Methods40 cases of endometrial cancer patients who treated with alarelin in our hospital from May 2009 to May 2013 were analyzed in this research.The expression of Chk1, Chk2, PIk1 and Bcl2 as well as Bax and caspase were detected by Real-time PCR and Western blot.The relationship of Chk1, Chk2 and PIk1 was analyzed by Spearman.ResultsThe results showed that the expression of Chk1, Chk2, PIk1 and Bcl2 was up-regulated while the expression of Bax and caspase3 was down-regulated greatly in tumor tissue.The alarelin can normalize those parameters greatly with a statistical difference.Correlation analysis showed that the expression of PIk1 had positive correlation with Chk1 and Chk2 expression. ConclusionAlarelin suppresses the endometrial cancer by increasing Chk1, Chk2, PIk1 and Bcl2 and decreasing Bax and caspase3 expression.

endometrial cancer; alarelin; apoptosis; checkpoint kinase

劉韻，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科疾病診斷與治療，E-mail：liuy12u@163.com；蘭艷麗，通訊作者，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科疾病診斷與治療，E-mail：lan9yl@163.com。

R737.33

A

1005-1678(2015)01-0103-04