Kex2蛋白酶在畢赤酵母中的表達(dá)、純化和性質(zhì)研究

劉穎穎,王之可,李素霞

(生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)，上海 200237)

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Kex2蛋白酶在畢赤酵母中的表達(dá)、純化和性質(zhì)研究

劉穎穎,王之可,李素霞Δ

(生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)，上海 200237)

目的 研究Kex2(EC.3.4.21.61)蛋白酶在畢赤酵母中的重組表達(dá)、純化和部分性質(zhì)。方法 Kex2基因整合進(jìn)pPIC9K質(zhì)粒中，通過電轉(zhuǎn)構(gòu)建重組畢赤酵母GS115-Kex2，G418篩選多拷貝子，甲醇誘導(dǎo)得到目的蛋白。通過強(qiáng)陰離子交換層析Q-FF對重組蛋白進(jìn)行純化，對純化后的蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果 通過畢赤酵母表達(dá)可以得到具有活性的重組Kex2蛋白酶，以Boc-Gln-Arg-Arg-pNA(叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-對硝基苯胺，Boc-QRR-pNA)為底物檢測酶的活性，發(fā)酵外液活性達(dá)270U/L，SDS-PAGE檢測目的蛋白的分子量為67kDa，經(jīng)Q-FF純化后，目的蛋白的活性回收率為84%。重組Kex2蛋白酶在pH 5.0～6.0之間穩(wěn)定，pH 9.0時活性最高。在25 ℃，pH 5.0條件下放置12 h活力可保持88.2%。以Boc-QRR-pNA為底物，測得重組Kex2蛋白酶的Km值為0.0167 mmol/L，Vmax值為333.3 μmol/min。結(jié)論 利用畢赤酵母可成功表達(dá)分泌Kex2蛋白，經(jīng)Q-FF純化后可得到較純的Kex2蛋白酶。

Kex2;畢赤酵母；表達(dá); 純化; 穩(wěn)定性

Kex2蛋白酶是酵母自身編碼的一種前體加工酶，是一個鈣離子依賴型的絲氨酸蛋白酶，屬于枯草桿菌蛋白酶家族,其專一性地切割Lys-Arg, Arg-Arg, Pro-Arg的C末端肽鍵[1-3]。Kex2負(fù)責(zé)在畢赤酵母中重組表達(dá)蛋白的分泌和成熟，通過在酵母表達(dá)的外源蛋白前體中加入Kex2的識別位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對外源蛋白前體進(jìn)行加工的目的。如王秀青[4]等研究在畢赤酵母中表達(dá)抗菌肽天蠶素及其串聯(lián)體，在串聯(lián)體中間插入Kex2識別的雙堿基氨基酸殘基，可得到分泌表達(dá)的單體抗菌肽。Screenivas[5]等在畢赤酵母中，將單鏈甘精胰島素前體和Kex2蛋白酶共表達(dá)，可得到分泌表達(dá)的甘精胰島素。 由于Kex2蛋白酶識別位點(diǎn)的特異性，其在重組蛋白的后加工中具有潛在的用途，如在甘精胰島素Lantus的制備過程中使用Kex2蛋白酶取代胰蛋白酶，可以提高甘精胰島素回收率，而大量獲得較純的Kex2是其應(yīng)用的前提。但目前為止，對于活性Kex2蛋白酶高表達(dá)和性質(zhì)的研究報道還相對較少。

天然Kex2蛋白酶由814個氨基酸殘基組成，包括信號肽(1-19殘基)，前肽(20-113殘基)，催化結(jié)構(gòu)域(114-410殘基)，P結(jié)構(gòu)域(411-624殘基)，Thr/Ser富集區(qū)(625-679殘基)，跨膜區(qū)(679-699殘基)，C端尾巴(700-814殘基)[6]。研究表明[7]，缺少Thr/Ser富集區(qū)的Kex2分子活性與天然分子相同。Kex2在釀酒酵母和昆蟲細(xì)胞中已得到成功表達(dá)，但表達(dá)量均很低[8-10]。艾敏榕等[11]研究了去除C端201個氨基酸殘基(跨膜區(qū)和C端尾巴)的Kex2肽段在甲醇酵母中的分泌表達(dá)，在發(fā)酵上清液中檢測到酶活，并且觀察到該Kex2肽段在培養(yǎng)基中的自降解，但未成功純化得到Kex2蛋白。

本文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，選擇了含有Kex2前肽，催化結(jié)構(gòu)域和P結(jié)構(gòu)域的20-599位氨基酸殘基序列，同時利用畢赤酵母α-因子的信號肽取代原Kex2的信號肽(1-19殘基)，對Kex2(20-599殘基)進(jìn)行表達(dá)，獲得了較高表達(dá)量的活性Kex2，并通過純化獲得電泳純的Kex2，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，為其應(yīng)用和大量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、和試劑 含有Kex2基因的重組質(zhì)粒pPIC9K，宿主細(xì)胞畢赤酵母GS115均由本實(shí)驗(yàn)室保存，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Takara，檢測蛋白酶活性所用底物Boc-Gln-Arg-Arg-pNA購自Sigma，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組Kex2蛋白酶的表達(dá)和鑒定 按照常規(guī)方法構(gòu)建Kex2的表達(dá)菌株GS115-Kex2。取-80℃的菌株在YPD(1%酵母提取物, 2%蛋白胨, 2%葡萄糖)平板上劃線，挑取單菌落到Y(jié)PD試管中培養(yǎng)16～18 h，轉(zhuǎn)接到BMGY培養(yǎng)基(1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 1.34% YNB,100 mM 磷酸鉀緩沖液pH 5.0，1%甘油)中，培養(yǎng)16～18 h，3000 r/min離心20 min去上清，菌體轉(zhuǎn)移到BMMY培養(yǎng)基(1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 1.34% YNB,100 mM 磷酸鉀緩沖液pH 5.0，1%甲醇)中，每隔24 h添加1%的甲醇，誘導(dǎo)72 h。3000 r/min離心20 min，上清液進(jìn)行下一步純化。

1.3 重組Kex2蛋白酶的純化 上清液對10 mM NaAc-HAc pH 5.0緩沖液透析，每4h更換透析外液，共透析4次。透析后的樣品利用Q-FF(3 cm×30 cm)離子交換柱純化，用10 mM NaAc-HAc pH 5.0平衡柱子至基線，之后用含0～500 mM的NaCl的緩沖液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，分部收集。洗脫后測定各收集管中液體的A280和蛋白酶活性，繪制洗脫曲線。SDS-PAGE鑒定蛋白純度，根據(jù)電泳結(jié)果，合并蛋白條帶單一的收集管，超濾除鹽，-20 ℃保存。

1.5 重組Kex2蛋白酶性質(zhì)研究

1.5.1 最適pH和 pH穩(wěn)定性 分別配制緩沖液如下： 50 mM的NaAc-HAc(pH 3～6)，Tris-HCl(pH 7～8)，Gly-NaOH(pH 9～11)，所有緩沖液均25 ℃配制。

最適pH的測定方法：用上述pH 3～11的緩沖液分別配制底物Boc-QRR-pNA溶液，測定純化后的Kex2蛋白酶在不同pH下的活性，結(jié)果表示為占最高酶活的百分比。

考察學(xué)習(xí)中，考察團(tuán)一行先后來到長治市武鄉(xiāng)八路軍紀(jì)念館和平順縣，進(jìn)行重溫入黨誓詞，并聽全國勞動模范申紀(jì)蘭老人上黨課，接受愛國主義教育。同時結(jié)合此行考察重點(diǎn)，考察團(tuán)還對長治市幾個鄉(xiāng)、縣的種植、養(yǎng)殖合作社、集體經(jīng)濟(jì)示范村、鄉(xiāng)村旅游示范點(diǎn)的運(yùn)營管理、農(nóng)村“兩委”建設(shè)、民主管理、村委會民主監(jiān)督等典型經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了學(xué)習(xí)和交流。對長治市城區(qū)相關(guān)社區(qū)基層黨建和社會管理工作進(jìn)行了深入了解。

pH穩(wěn)定性的測定方法：Kex2純酶液分別在pH 3～11 緩沖液中稀釋20倍，于25 ℃下溫浴，分別在1、2、4、8、12 h取樣按常規(guī)方法測定酶活，以水浴前酶液的初始活性作為100%，計算殘余率。

1.5.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 最適溫度：將底物Boc-QRR-pNA分別置于4 ℃、16 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、60 ℃水浴中溫育30 min，測定Kex2純酶液在不同溫度底物溶液中的反應(yīng)速率，結(jié)果表示為A405隨時間的變化曲線。

溫度穩(wěn)定性：取Kex2純酶液分別置于16 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、60 ℃水浴中溫育，在1、2、4、8、12h取樣按常規(guī)方法測定酶活，以水浴前酶液的初始活性作為100%計算活性殘余率。

1.5.3 Km值和Vmax的測定 用測活緩沖液(50 mM的Tris-HCl，pH 8.0,2 mM Ca2+)溶解不同濃度的測活底物Boc-QRR-pNA ，[S]:2×10-5、5×10-5、8×10-5、1×10-4、2×10-4mol/L，在405 nm波長下分別測定重組Kex2蛋白酶在不同底物濃度下的反應(yīng)速率，按雙倒數(shù)作圖法，以1/V～1/[S]作圖，得出一條直線，橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/Vmax。

2 結(jié)果

2.1 重組 Kex2蛋白酶的制備 GS115-Kex2菌株按照常規(guī)方法培養(yǎng)誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測上清液中的蛋白，結(jié)果如圖1A所示，泳道1為含有pPIC9K空載的GS115菌株培養(yǎng)外液，可見無目的蛋白，且外液中無Kex2蛋白酶活性。泳道2為GS115-Kex2菌株培養(yǎng)外液，可見目的蛋白為分泌型表達(dá)，在培養(yǎng)液中得到富集，表觀分子量約為67 kDa。

圖1 Kex2蛋白酶的表達(dá)鑒定和純化A：重組GS115-Kex2 SDS-PAGE表達(dá)鑒定 M:marker; 1:GS115含pPIC9K空載質(zhì)粒誘導(dǎo)后細(xì)胞培養(yǎng)外液；2:GS115 -Kex2誘導(dǎo)后細(xì)胞培養(yǎng)外液; B：SDS-PAGE鑒定純化樣品 M：marker；1:上樣液；2:流出液；3:平衡液；4～14:洗脫流出液; C：Kex2蛋白酶的洗脫曲線Fig.1 Identification and purification of Kex2 A：Identification of recombinant GS115-Kex2 by SDS-PAGE M:marker;1: contrast ; 2: GS115-Kex2; B: Detection of purification SDS-PAGE M:maker; 1:sample solution; 2: flow solution; 3: equilibrium solution; 4～14:NaCl elution; C: elution curve of Q-FF

步驟活性U/mL體積mL總活性U總蛋白mg比活U/mg回收率%純化倍數(shù)上樣液0.215032.67.183.88純化后1.815.327.51.9314.2843.65

2.2 重組 Kex2蛋白酶性質(zhì)研究

2.2.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH檢測結(jié)果見圖2A。在pH 5.0以下，重組Kex2蛋白酶沒有活性，pH 5.0～pH 6.0之間活性升高65%。在pH7.0～9.0之間能夠保持較高的活性，在pH 9.0時活性達(dá)到最高，隨后活性開始降低，在pH11仍有20%以上的活性。

pH穩(wěn)定性結(jié)果見圖2B。過酸或過堿都會造成Kex2蛋白酶的嚴(yán)重失活。重組Kex2蛋白酶在pH 3.0、10.0、11.0下1 h內(nèi)均完全失活。在pH 4.0～8.0之間，酶失活較慢，1h內(nèi)酶活殘余率都保持在80%以上。溫浴12 h之后，Kex2在pH≤4,pH≥8時，酶活的殘余率均低于20%，幾乎全部失活。在pH5.0～7.0之間，Kex2蛋白酶較為穩(wěn)定，在pH 6.0時Kex2在25 ℃可以保持12 h活性不降低，這一條件適合酶液的保存。

圖2 重組Kex2蛋白酶最適pH(A) 和pH穩(wěn)定性(B)Fig.2 Optimal pH of recombinant Kex2(A) and its pH stability (B)

2.2.2 重組 Kex2蛋白酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性 將底物分別置于4 ℃、16 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、60 ℃水浴中溫育30 min,加入Kex2的純酶液測活。結(jié)果顯示，隨著底物溫度的升高，測得酶的反應(yīng)速率增大。在測活的5 min內(nèi)，均能保持良好的線性關(guān)系。

溫度穩(wěn)定性研究結(jié)果見圖3。16 ℃條件下Kex2蛋白酶相對最為穩(wěn)定，12 h內(nèi)酶活幾乎不損失；25 ℃溫育12 h后活性尚能殘余88.2%；隨溫度的升高，重組Kex2蛋白酶分子的活性降低速率也隨之加快，這可能與Kex2蛋白酶在溫度高的情況下，產(chǎn)生自降解所致；45 ℃條件下12 h內(nèi)酶活殘余有40%。

圖3 Kex2蛋白酶溫度穩(wěn)定性Fig.3 The temperature stability of Kex2

2.2.3 重組Kex2蛋白酶Km值和Vmax的測定 依據(jù) 1/[S]～1/V 雙倒數(shù)作圖法，得到直線方程y=5×10-5x+0.003，其中直線的R2=0.995，橫軸截距為-1/Km，重組Kex2蛋白酶對底物Boc-QRR-pNA的Km值為0.0167 mmol/L，Vmax值為333.3 μmol/min。

3 討論

我們曾嘗試在大腸桿菌體系中表達(dá)Kex2，表達(dá)方式為不溶性的包涵體，嘗試?yán)米儚?fù)性的方法得到有活性的Kex2蛋白酶，但均未成功。進(jìn)一步分析Kex2蛋白的氨基酸序列和高級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，Kex2蛋白分子中含有7個半胱氨酸，其中僅4個形成了二硫鍵，其他3個半胱氨酸為自由的半胱氨酸，這可能對復(fù)性過程中二硫鍵的正確形成造成阻礙[13]，使得很難通過復(fù)性得到有活性的Kex2蛋白酶。

本研究利用畢赤酵母的α因子的信號肽取代原Kex2的信號肽，獲得了較高的外分泌表達(dá)的可溶的活性Kex2，培養(yǎng)外液活性高達(dá)270U/L。SDS-PAGE電泳檢測細(xì)胞內(nèi)無未分泌的重組蛋白(SDS-PAGE結(jié)果未給出)。與之前艾敏榕[11]所得到的培養(yǎng)外液中活性最高為140 U/L相比，增加了約2倍。相對于Brenner[14]報道的在釀酒酵母中獲得外分泌型可溶的活性蛋白酶，表達(dá)量很低的Kex2的1-614位肽段,我們的研究結(jié)果顯示在畢赤酵母中的表達(dá)量和活性均顯著提高，這可能與畢赤酵母的α因子的信號肽取代原Kex2的信號肽，并且畢赤酵母的甲醇誘導(dǎo)型的強(qiáng)啟動子[15]等有關(guān)。

本文成功表達(dá)了Kex2蛋白，并對其進(jìn)行純化和部分性質(zhì)研究，結(jié)果表明其有活性，且穩(wěn)定的pH 為6.0,因此該pH也是該酶的最適pH使用范圍，pH 5.0條件下穩(wěn)定，但沒有活性，可以在pH 5.0保存該酶，這一研究結(jié)果為重組Kex2蛋白酶的應(yīng)用提供了參考。

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(編校：吳茜)

Expression,purification and properties of recombinant Kex2 inPichiaPastoris

LIU Ying-ying，WANG Zhi-ke, LI Su-xiaΔ

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

ObjectiveTo study Kex2(EC.3.4.21.61)expression, inPichiaPastoris, purification and properties of the purified recombinant Kex2 proteinase. MethodsThe gene encoding Kex2 was cloned in pPIC9K plasmid and transformed into GS115 by electroporation.After screened recombinant yeast strain with G418, induced yeast strain with methanol and analyzed with SDS-PAGE and activity detection, the recombinant Kex2 was successfully obtained. The secreted protein was purified with anion exchange chromatography (Q-FF), and some properties of the purified recombinant Kex2 was investigated. ResultsMolecular weight of Kex2 was about 67 kDa in SDS-PAGE, total activity recovery rate of Q-FF purification was 84%. The recombinant Kex2 was stable from pH 5.0 to pH 6.0, and optimal pH of recombinant Kex2 was pH 9.0. 88.2% activity was remained at 25 ℃，pH 5.0 for 12 h .Km was 0.0167 mmol/L and Vmax was 333.3 μmol/min with Boc-Gln-Arg-Arg-pNA as substrate. ConclusionThe recombinant Kex2 is expressed successfully in Pichia yeast, and purified Kex2 is obtained after purification with anion exchange chromatography.

Kex2;PichiaPastoris; expression; purification; stability

劉穎穎，女，碩士，研究方向：分子生物學(xué)，E-mail：xsliuyingying@126.com；李素霞，通訊作者，女，副教授，研究方向：酶學(xué)及重組蛋白的變性、復(fù)性研究，E-mail：lisuxia@ecust.edu.cn。

Q 566+.9

A

1005-1678(2015)01-0037-04