阿霉素殼寡糖納米粒的制備及體外抗腫瘤研究

劉歡,江靜怡,王麗靈,劉志輝

(1.南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥學部，江蘇 南京 210036)

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阿霉素殼寡糖納米粒的制備及體外抗腫瘤研究

劉歡1,江靜怡1,王麗靈1,劉志輝2Δ

(1.南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥學部，江蘇 南京 210036)

目的 制備負載阿霉素的殼寡糖納米粒，并研究其理化性質和體外抗腫瘤細胞毒性。方法 采用離子凝膠法制備負載阿霉素的殼寡糖納米粒；透射電鏡觀察納米粒形態(tài)，激光粒度儀測定粒徑和表面電位，紫外分光光度法測量包封率、載藥量，考察載藥納米粒的體外釋藥特性；采用MTT法對載藥殼寡糖納米粒在體外乳腺癌細胞株MCF-7的細胞毒作用進行評價。結果 制得的阿霉素殼寡糖納米粒呈球形或類球形，形態(tài)較為完整，平均粒徑為(136.77±1.21)nm，表面電位為(20.53±0.31)mV，包封率為(56.99±1.40)%，載藥量為(15.49±0.38)%，168 h的累積釋放率為72.15%；阿霉素和載藥納米粒對MCF-7細胞增殖的抑制作用存在明顯的濃度和時間依賴性，且載藥納米粒對MCF-7細胞增殖的抑制作用隨時間增加而逐漸強于游離阿霉素。 結論 此方法制備的阿霉素殼寡糖納米粒粒徑較小，藥物釋放具有明顯的緩釋作用，并具有較好的抗腫瘤作用。

殼寡糖納米粒；阿霉素；抗腫瘤作用

殼聚糖(chitosan，CS)由于具有良好的生物相容性、生物降解性而被廣泛用作抗腫瘤藥物載體[1]，但殼聚糖分子量大，只能溶解于酸性水溶液[2]；此外，消化道內殼聚糖酶的缺乏也導致CS在消化道吸收的困難。這些性質已成為了殼聚糖作為納米藥物載體應用的限制性因素。然而，殼寡糖(chitosan oligosaccharide，CSO)即殼聚糖的降解產物卻可以克服這些局限性。CSO分子量低、粘度低，既保留了殼聚糖的優(yōu)點，又在一定程度上提高了其在生理條件中的溶解度[3-4]，且由殼寡糖分子組成的納米粒其細胞攝取作用明顯高于等濃度的殼寡糖分子，并存在明顯的濃度和時間依賴性，揭示殼寡糖納米粒作為生物大分子藥物載體有著潛在功能[5]。本文以阿霉素(doxorubicin，DOX)為模型藥物，通過研究負載阿霉素的殼寡糖納米粒的制備、表征、體外釋放規(guī)律及對人乳腺癌腫瘤MCF-7細胞株的體外生長抑制效果，探討殼寡糖納米粒作為抗腫瘤藥物載體的潛在價值，為進一步深入研究其體外細胞靶向和體內分布奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 殼寡糖(20131207,肇慶長龍生物科技有限公司，Mw=2000Da，脫乙酰度>90%)、三聚磷酸鈉(TPP,20130809,成都市科龍化工試劑廠)、鹽酸阿霉素(M131023,浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、四甲基偶氮噻唑鹽(MTT，Biosharp公司)、人乳腺癌細胞MCF-7(中國科學院上海細胞庫)、MEM培養(yǎng)基(Wisent公司)、胎牛血清(1133067,Gibco公司)、0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA(3250430010,Wisent公司)、透析袋(MWCO=1000Da，美國3M公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器(江蘇城西曉陽電子儀器廠)、Zetasizer Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)、BP-211D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)、5430R高速冷凍離心機(德國艾本德股份公司)、ZQTY-70振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)、Cary50紫外分光光度儀(美國Varian有限公司)、JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)、LGJ-10冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)、Epoch全自動酶標儀(美國Biotek公司)、HF90/HF240CO2培養(yǎng)箱(上海力新公司)。

1.2 納米粒的制備

1.2.1 空白殼寡糖納米粒的制備：取2 mL的殼寡糖溶液(濃度為14 mg/mL)，用醋酸溶液調節(jié)pH值至5，室溫下磁力攪拌，將3.89 mL的TPP水溶液(濃度為0.4 mg/mL)以1秒/滴的速度逐滴滴入攪拌中的殼寡糖溶液中，反應10 min，即得殼寡糖納米粒(CSO-NPs)混懸液。

1.2.2 阿霉素殼寡糖納米粒的制備：精密稱取0.5 mg的阿霉素使之溶解于TPP溶液中，混勻，置于50 ℃恒溫水浴中保溫5 min，阿霉素即與TPP能形成較為穩(wěn)定的復合物。

將2 mL的殼寡糖溶液的pH值調為5，在磁力攪拌下，將上述形成的阿霉素-TPP復合物以1秒/滴的速度逐滴滴入殼寡糖溶液中，室溫下反應10 min，即得負載阿霉素的殼寡糖納米粒(DOX-CSO-NPs)混懸液。由于阿霉素易發(fā)生光解反應，故有阿霉素的操作均須避光操作。

1.3 納米粒的表征

1.3.1 納米粒的平均粒徑和表面電位的測定：取DOX-CSO-NPs混懸液適量，過0.45 μm濾膜，用適量蒸餾水稀釋后用馬爾文納米粒度儀測定。

1.3.2 表面形態(tài)觀察：取少量阿霉素殼寡糖納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置5 min后滴加2%磷酸鎢染色，自然晾干后，于透射電鏡上觀察納米粒的形態(tài)。

1.4 包封率和載藥量的測定

1.4.1 阿霉素溶液標準曲線的制備：精密稱取阿霉素適量，加蒸餾水配置成100 μg/mL的儲備液。分別精密量取不同體積儲備液，用蒸餾水配置成濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL的阿霉素溶液。以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計在阿霉素最大吸收波長480 nm處測定吸光度，以阿霉素濃度對吸光度作標準曲線。

1.4.2 包封率與載藥量的計算[6]：在4 ℃條件下，將阿霉素殼寡糖納米?；鞈乙焊咚匐x心(15000 r/min)30 min，分離上清液。納米粒沉淀用水洗滌，冷凍干燥后稱重。上清液用蒸餾水稀釋至10 mL，用標準曲線法在紫外-可見分光光度計上于480 nm處測定上清液中阿霉素的含量。所有的吸光度值均以相同條件下制得的空白納米粒的上清液為參比。

納米粒的包封率(encapsulation efficiency，EE%)和載藥量(Drug loading，DL%)的計算公式如下：包封率(EE%)=(DOX總藥量-上清液中游離的DOX藥量)/DOX總藥量×100%；載藥量(DL%)=(DOX總藥量-上清液中游離的DOX藥量)/納米粒質量×100%。

1.5 載藥納米粒的體外釋放實驗 精密移取阿霉素殼寡糖納米?；鞈乙? mL，放入預先處理好的透析袋中，用透析夾把透析袋兩端扎緊，懸浮于80 mL PBS緩沖溶液中，將其置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行動態(tài)透析(振蕩頻率為100 r/min)，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168 h取透析袋外液4 mL，在480 nm處測定吸光度，同時補充等量新鮮的磷酸鹽緩沖液。吸光度值以未載藥的空白殼寡糖納米粒在同等條件下透析的PBS緩沖液為參比。

1.6 納米粒對MCF-7細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞(1×105cells/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μL。置于37 ℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁過夜。實驗分3組：游離阿霉素組(游離DOX)、空白納米粒組(CSO-NPs)和載阿霉素的納米粒組(DOX-CSO-NPs)，各組阿霉素藥物的濃度分別為0.25、0.5、1、2、4μg/mL，同時設置空白對照孔與空白凋零孔，每個濃度設3個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min使結晶物充分溶解。用酶標儀于570nm處測定各孔吸光度，計算細胞生長抑制率，抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)× 100%。

采用直線回歸法可以算出藥物干預24、48、72h后，游離DOX和DOX-CSO-NPs對MCF-7細胞的IC50。

2 結果

2.1 在阿霉素-TPP復合物的形成過程中影響阿霉素包封率的因素 阿霉素結構中帶有氨基，與TPP中的磷酸根離子的結合是靜電相互作用，不同的用量以及溫度、時間對結合的程度有著不同的影響，從而造成包封率的不同。一般來說，阿霉素與TPP結合的越緊密，與殼寡糖凝膠化后形成的納米粒中藥物的含量越高，從而包封率越高。

2.1.1 阿霉素用量對包封率的影響：稱取不同量的阿霉素溶于TPP溶液中，于50 ℃恒溫水浴中保溫5min，與殼寡糖溶液反應制得載藥殼寡糖納米粒，測定其包封率，結果如圖1所示。

圖1 阿霉素用量對包封率的影響Fig.1 Effect of the dosage of DOX on encapsulation efficiency

由圖所見，隨著阿霉素用量的增加，包封率呈上升的趨勢，但阿霉素用量達到0.6 mg時，阿霉素不能完全溶解于TPP溶液中，這可能說明阿霉素與TPP的結合存在飽和性，故阿霉素的用量定為0.5 mg。

2.1.2 保溫溫度對包封率的影響：稱取0.5 mg阿霉素溶于TPP溶液中，于不同的恒溫溫度下保溫5 min，待冷卻至室溫后，與殼寡糖溶液反應形成納米粒，測定其包封率，結果如圖2所示。

圖2 保溫溫度對包封率的影響Fig.2 Effect of the holding temperature on encapsulation efficiency

由圖可知，保溫溫度在50 ℃以下時，包封率比較低，當溫度高于50 ℃時，包封率變化較小，這說明阿霉素與TPP的結合需要在一定的溫度范圍內才能結合的較為緊密。雖然阿霉素對熱比較穩(wěn)定，但高溫長時間對穩(wěn)定性畢竟有一定的影響，以及從節(jié)能角度考慮，故選擇50 ℃為最佳的保溫溫度。

2.1.3 保溫時間對包封率的影響：將0.5 mg的阿霉素溶解于TPP溶液中，于50 ℃恒溫水浴中保溫不同的時間，再與殼寡糖反應凝膠化制得納米粒，測定其包封率，結果如圖3所示。

圖3 保溫時間對包封率的影響Fig.3 Effect of the holding time on encapsulation efficiency

從圖中可以看出，隨著保溫時間的增加，納米粒的包封率很快就從1 min的15%上升到5 min的51%，但時間大于5 min后，包封率基本不再上升。說明了阿霉素與TPP的結合這一過程比較快速，反應了5 min后包封率基本達到最大值，故阿霉素與TPP溶液的保溫時間確定為5 min。

2.2 納米粒的表征

2.2.1 納米粒的平均粒徑和表面電位的測定：結果DOX-CSO-NPs納米粒的平均粒徑為(136.77±1.21)nm，平均PDI為0.202±0.02，平均電位為(20.53±0.31)mV，表明載藥殼寡糖納米粒的粒度分布較為均勻，體系較穩(wěn)定。

2.2.2 表面形態(tài)觀察：制得的DOX-CSO-NPs納米粒的形態(tài)見圖4，可見納米粒形態(tài)比較完整，呈球形或類球形。

圖4 納米粒透射電鏡圖Fig.4 TEM of DOX-CSO-NPs

2.3 包封率和載藥量的測定 阿霉素溶液的線性回歸方程為：A=0.01797C+0.00436(r=0.9995)，表明阿霉素溶液的濃度在1.25～40 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系良好。

制備3批阿霉素殼寡糖納米粒，測定其包封率和載藥量，平均包封率為(56.99±1.40)%，RSD為2.46%，平均載藥量為(15.49±0.38)%，RSD為2.46%。

2.4 載藥納米粒的體外釋放實驗 載藥殼寡糖納米粒和阿霉素水溶液在PBS緩沖鹽中的釋放結果如圖5所示。

圖5 阿霉素溶液與載藥殼寡糖納米粒體外釋放曲線Fig.5 Release profiles of DOX from solution and DOX-CSO-NPs in vitro

由圖可知，DOX-CSO-NPs與阿霉素溶液相比具有明顯的緩控釋作用，對照組阿霉素水溶液在4 h內基本完全釋放，而載藥納米粒組阿霉素的釋放可分為3個階段：初始階段阿霉素快速釋放，呈突釋現(xiàn)象，4 h內累積釋放量為41.06%；中期階段為緩釋階段，阿霉素的釋放非常緩慢，96 h內累積釋放量為54.20%；最后階段，藥物釋放速度稍微加快，到168h累積釋放達72.15%，但仍然緩慢。

2.5 納米粒對MCF-7細胞增殖的抑制作用 各組藥物對MCF-7細胞增殖的抑制作用結果見圖6。

圖6 3組藥物對MCF-7細胞作用24、48、72h后的抑制率*P< 0.05，**P< 0.01，與CSO-NPs 組比較；#P< 0.05 ，##P< 0.01，與DOX 組比較Fig.6 Inhibitory rate of MCF-7 cells after 24 h, 48 h and 72 h treatment with different drugs*P< 0.05,**P< 0.01,compared with CSO-NPs group;#P< 0.05,##P< 0.01,compared with DOX group

從圖6可以看出，空白納米粒對MCF-7細胞幾乎沒有細胞毒作用，而游離DOX和載藥納米粒對MCF-7細胞增殖有明顯的抑制作用，提示DOX-CSO-NPs是主要通過阿霉素起抗腫瘤作用，而非載體。而且，游離DOX和DOX-CSO-NPs對MCF-7細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的量效和時效關系，同時，隨著藥物干預時間延長至72h，DOX-CSO-NPs對MCF-7細胞增殖抑制作用顯著高于游離DOX(P<0.05)。

經(jīng)藥物作用24 h后，載阿霉素的殼寡糖納米粒的毒性作用略強于游離阿霉素，而隨著作用時間的延長，載藥殼寡糖納米粒對MCF-7的細胞毒作用顯著高于DOX。見表1。

表1 DOX和DOX-CSO-NPs對MCF-7細胞的

3 討論

3.1 以殼寡糖為材料制備載藥納米粒有顯著意義，值得進一步研究 目前，對殼寡糖的研究多停留在其降解制備方法和其生物活性的機理及機制的探討上，以殼寡糖作為納米粒載體的研究還較少。殼寡糖相對殼聚糖來說分子量低很多，其作為載體形成的納米粒的粒徑比殼聚糖納米粒的粒徑要小得多。本實驗采用離子凝膠法[7-8]成功制備了負載阿霉素的殼寡糖納米粒，此方法簡單、方便、快速，由于殼寡糖制得的納米粒粒徑顯著較小，還可以進一步嘗試對納米粒進行修飾[9]，使其除具有被動靶向作用[10]外，還能具有較好的主動靶向作用，在雙重靶向作用下，能更好的將抗腫瘤藥物直接作用于腫瘤細胞，實現(xiàn)低毒高效。因此，以殼寡糖為材料制備納米粒有顯著意義，值得進一步研究。

3.2 殼寡糖納米粒載體能降低阿霉素藥物的用量，潛在應用價值大 有研究報道，殼寡糖具有抗腫瘤生物活性[11]，但從實驗中發(fā)現(xiàn)空白殼寡糖納米粒對腫瘤細胞幾乎沒有毒性，這可能是因為殼寡糖濃度太低不直接參與抑制腫瘤的增生[12]，而體內環(huán)境下殼寡糖主要通過調節(jié)免疫功能和抑制腫瘤血管生長、遷移[13]等實現(xiàn)抗腫瘤作用的。

從初步的細胞毒性試驗中發(fā)現(xiàn)，DOX-CSO-NPs對MCF-7細胞增殖的抑制作用隨時間的延長而大于游離阿霉素，其原因可能有2方面：一是由于納米粒具有緩釋作用。載藥納米粒的體外釋放試驗初期，藥物能夠快速釋放的主要原因是納米粒混懸液中存在的游離阿霉素以及部分阿霉素只單純的物理吸附在納米粒的表面，能快速溶解擴散，有利于藥物的快速起效；中期藥物釋放較為緩慢，其原因是被包裹在納米粒內部的阿霉素通過納米粒的孔道以擴散方式穩(wěn)定釋放；最后，隨著時間的延長，納米粒載體材料殼寡糖慢慢地被溶蝕降解，致使納米粒疏松，孔道增多，促進擴散，從而加快了藥物的釋放，但沒有酶的存在，這一過程也是極其緩慢的。二是由于腫瘤細胞對納米粒具有選擇性吞噬作用[14]，而DOX是以擴散的方式進入細胞。本實驗說明了殼寡糖納米粒載體的應用有望降低阿霉素藥物的用量，從而降低藥物的系統(tǒng)毒性，具有良好的潛在應用價值。

3.3 其它 透射電鏡測得的納米粒粒徑(小于100 nm)明顯比粒度分析儀測出的結果小，這可能是因為納米粒是水凝膠體系，具有一定的溶脹/收縮性是凝膠的重要性質之一[15]。電鏡檢測是在干燥條件下，粒子此時處于收縮狀態(tài)，而粒度分析儀測定粒徑時，樣品為溶液，粒子處于溶脹狀態(tài)。

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(編校：吳茜)

Preparation of doxorubicin-loaded chitosan oligosaccharide nanoparticles and its anti-tumor effect in vitro

LIU Huan1,JIANG Jing-yi1,WANG Li-ling1,LIU Zhi-hui2Δ

(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2.Department of pharmacy, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210036, China)

ObjectiveTo prepare doxorubicin-loaded chitosan oligosaccharide nanoparticles (DOX-CSO-NPs), and investigate the physiochemical properties and anti-tumor activity in vitro.MethodsDOX-CSO-NPs were prepared by the method of ionic cross-linking; the shape of nanoparticles were observed by transmission electron microscope (TEM), the paticle size and surface potential were determined by laser particle size analyzer, encapsulation efficiency and drug-loading rate were measured by ultraviolet spectrometry.The drug release characteristics of nanoparticles in vitro were preliminarily evaluated.The cytotoxicity of drug-loaded nanoparticles to MCF-7 cells in vitro were also investigated by MTT assay.ResultsDOX-CSO-NPs were spherical and complete in shape as shown under the transmission election microscope, the average size, Zeta potential, encapsulation efficiency and drug-loading rate were (136.77±1.21)nm, (20.53±0.31)mV, (56.99±1.40)% and (15.49±0.38)%, respectively.The total amount of accumulative release was 72.15% at the 168th hour.Free doxorubicin and DOX-CSO-NPs could inhibit the proliferation of MCF-7 cells in dose and time dependent manners in vitro obviously.Furthermore, the inhibition of the DOX-CSO-NPs to the MCF-7 cells was increasing with time and stronger than free doxorubicin. ConclusionThe particle size of DOX-CSO-NPs prepared by this method is smal and features a good quality of slow releasing，and it has better anti-tumor effect.

chitosan oligosaccharide nanoparticles; doxorubicin; anti-tumor effect

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD2011)

劉歡，女，碩士在讀，研究方向：中藥新劑型與新技術，E-mail：liuhuan_y0812@163.com；劉志輝，通訊作者，主任中藥師，研究方向：中藥制劑開發(fā)及中藥質量標準研究，E-mail：liuzh1008@126.com。

R944.9

A

1005-1678(2015)01-0025-05