光譜法研究洛索洛芬鈉與牛血清白蛋白的相互作用及共存金屬離子的影響

劉里,成飛翔

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011)

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光譜法研究洛索洛芬鈉與牛血清白蛋白的相互作用及共存金屬離子的影響

劉里,成飛翔

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011)

目的 研究洛索洛芬鈉(LS)和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用及共存金屬(Mn2+、Cu2+、Cr3+、Mg2+、Fe3+)離子對LS與BSA相互作用的影響。方法 在模擬人體生理?xiàng)l件下，用紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法研究LS與BSA的相互作用。298.5、308.5、318.5 K溫度下，根據(jù) S-V方程計(jì)算出猝滅常數(shù)(KSV)和速率常數(shù)(Kq)；根據(jù)L-B雙倒數(shù)方程，計(jì)算出靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)(KLB)；根據(jù)雙對數(shù)方程，計(jì)算出結(jié)合常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)；根據(jù)熱力學(xué)公式，計(jì)算出焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能變(ΔG)；根據(jù)Hill方程計(jì)算出 Hill系數(shù)(nH)。結(jié)果 3個溫度下的BSA熒光強(qiáng)度隨著LS濃度升高，有規(guī)律地降低； KSV、Kq、KLB和nH值隨著溫度升高而降低；ΔG<0，ΔH<0，ΔS>0；n約等于1；nH小于1。結(jié)論 LS對BSA的熒光有猝滅作用，其猝滅過程屬于靜態(tài)猝滅。其相互作用主要靠靜電作用力。LS可以被BSA運(yùn)輸，結(jié)合位置位于BSA的亞螺旋域ⅡA中，結(jié)合位點(diǎn)偏向于酪氨酸。Mg2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+對LS與BSA結(jié)合產(chǎn)生競爭作用，可提高藥效；Cr3+對LS與BSA結(jié)合產(chǎn)生促進(jìn)作用，可減弱藥物毒性。

洛索洛芬鈉；相互作用；金屬離子；牛血清白蛋白；光譜法

與人血清白蛋白相似的牛血清白蛋白(BSA)，是生命體中含量最豐富的蛋白質(zhì)，能與金屬離子、酶、代謝物等許多物質(zhì)相作用，具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子(離子)等重要生理功能[1]。洛索洛芬鈉(簡稱LS)是2-[4-(2-氧代環(huán)戊烷-1-基甲基)苯基]丙酸鈉二水合物，由日本三共株式會社首先研制，現(xiàn)在日本為非甾體抗炎藥中銷量第一的品種，已被日本藥局方收載，我國已進(jìn)口并已列入國家九五和2010年新品開發(fā)推薦試制品種之一[2]。與同類藥物相比，其特點(diǎn)主要體現(xiàn)在：更強(qiáng)(臨床效果好)、更快(口服30 min血漿濃度即達(dá)峰值)、更安全(副作用小)。另一類特點(diǎn)是適應(yīng)癥廣，臨床上可廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰痛、肩周炎等的抗炎鎮(zhèn)痛、手術(shù)、外傷后及拔牙后的鎮(zhèn)痛消炎和急性上呼吸道炎癥的解熱鎮(zhèn)痛等[3]。目前對LS的研究大多集中在臨床及藥代動力學(xué)研究以及測定含量方面[2-3]，對于光譜法研究LS與BSA的相互作用至今還沒有報(bào)道，而且以往研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用主要集中在對猝滅機(jī)理的探討上[4-5]。本文旨在從更多角度研究LS與BSA的結(jié)合反應(yīng)，從常規(guī)作用機(jī)理的判斷，到深入探討結(jié)合力類型、結(jié)合位點(diǎn)、藥物之間的協(xié)同性、結(jié)合位置、對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響以及金屬離子對結(jié)合反應(yīng)的影響，希望這些研究對于闡明LS在機(jī)體內(nèi)的傳輸、代謝過程及藥理作用能提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光光譜儀：F-4600型，日本日立公司，狹縫寬度 10.0 nm，負(fù)電壓為400 V；紫外可見光譜儀：Cary 50型，美國瓦里安技術(shù)中國有限公司；精密酸度計(jì)：pHS-3C型，上海虹益儀器儀表有限公司。牛血清白蛋白：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，配制1.0×10-5mol/L的溶液；洛索洛芬鈉：百靈威科技有限公司，含量98%，配制0.003549 mol/L的溶液；其它試劑為分析純，超純水作為試驗(yàn)用水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 依次加入0.50 mol/LNaCl溶液2.0 mL；0.10 mol/L，pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL；1.0×10-5mol/L的BSA 1.0 mL和不同體積0.003549 mol/L的LS溶液，在比色管中，定容至10 mL。分別在298.5、308.5、318.5 K溫度下，測定熒光光譜，記錄LS不存在時體系的熒光強(qiáng)度F0和LS存在時體系的熒光強(qiáng)度F。其最大激發(fā)波長(λex)和最大發(fā)射波長(λem)位于280 nm/345 nm 處。掃描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時體系的同步熒光光譜。以相應(yīng)的LS溶液作為參比，記錄BSA-LS體系的吸收光譜。按照上述條件，在LS-BSA體系中加入濃度都為1×10-3mol/L金屬離子(Mn2+、Cu2+、Cr3+、Mg2+、Fe3+)0.1 mL，測其熒光光譜。

2 結(jié)果

2.1 猝滅光譜 在模擬人體生理?xiàng)l件下，當(dāng)把藥品LS加入到BSA溶液中充分反應(yīng)后，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光被猝滅，并在λex/λem=280/345 nm處其熒光強(qiáng)度明顯有規(guī)律地降低(見圖1)，表明LS與BSA之間存在著相互作用，且熒光猝滅程度與LS的濃度成正比。

圖1 LS對BSA的猝滅光譜Fig.1 Quenching spectra of LS as BSA1→10 CBSA= 1.0×10-6mol/L, CLS=(0, 7.098～113.568) ×10-5mol/L; 11：CLS= 7.098×10-5 mol/L

2.2 猝滅機(jī)理的探討 實(shí)際上任何一個熒光猝滅過程是同時包含動態(tài)和靜態(tài)猝滅的混合過程，但是2者在反應(yīng)過程中有主次之分[6]，所以正如通常所說的猝滅機(jī)理分為動態(tài)猝滅機(jī)理和靜態(tài)猝滅機(jī)理。動態(tài)猝滅遵從S-V方程[7]：F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C]，式中Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；τ0為生物大分子熒光壽命，在10-8s數(shù)量級左右[7]；Ksv為S-V猝滅常數(shù)；[C]為LS濃度。按照實(shí)驗(yàn)方法在298.5、308.5、318.5 K時，作F0/F-CLS圖(見圖2、表1)。

圖2 不同溫度下LS對BSA的S-V曲線 Fig.2 S-V plots of LS as BSA at different temperatures

溫度(K)Stern-Volmer方程相關(guān)系數(shù)rKsv/(L/mol)Kq/[L/(mol·s)]298.5F0/F=3722.7[C]+0.91830.99923722.73.7227×1011308.5F0/F=2828.6[C]+0.99740.99762828.62.8286×1011318.5F0/F=2560.2[C]+0.93620.99872560.22.5602×1011

若LS對BSA為靜態(tài)猝滅，更應(yīng)符合L-B方程[8]： (F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[C])-1式中KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)。(F0-F)-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線，結(jié)果見表2。

表2 L-B 線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

為了確定猝滅機(jī)理，測定了LS、BSA和不同濃度LS與BSA作用的吸收光譜圖(見圖3)。

圖3 LS(1)、BSA(2)和LS-BSA(3-14)紫外吸收光譜C BSA=1.0×10-6，CLS=7.1×10-5～11.3568×10-4 mol/L Fig.3 UV adsorption spectra of LS ,BSA and LS -BSA solutions

2.3 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n以及結(jié)合常數(shù)KbBSA大分子與LS小分子結(jié)合的表觀結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n由lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[C]公式求出[9]。分別在298.5、308.5、318.5K以lg(F0-F)/F對lg[C]作圖，見圖4。計(jì)算得Kb和n，列于表3中。

圖4 不同溫度下 lg[(F0-F)/F]與 lg CLS關(guān)系曲線Fig.4 lg[(F0-F)/F] vs.lg CLS plots at different temperatures

溫度(K)雙對數(shù)方程Kb(L/mol)nr298.5lg[(F0-F)/F]=1.0763lg[C]+3.7956237.351.07630.9995308.5lg[(F0-F)/F]=0.9989g[C]+3.44542788.690.99890.9973318.2lg[(F0-F)/F]=1.141lg[C]+3.83846892.871.14100.9965

2.4 作用力類型 當(dāng)溫度相差不大時，可以把焓變看成一個常數(shù)，由不同溫度下的Kb，可根據(jù)熱力學(xué)方程[9]算出反應(yīng)焓變ΔH、自由能變ΔG和熵變ΔS，計(jì)算結(jié)果見表4。由表4可知，LS與BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔG<0，ΔH<0，ΔS>0表明LS與BSA為自發(fā)的，吸熱反應(yīng)。根據(jù)Ross等[10]總結(jié)出的判斷規(guī)律，推斷出LS與BSA的作用力為靜電作用力。

表4 LS-BSA的熱力學(xué)參數(shù)值

2.5 結(jié)合部位的確定 與人血清白蛋白相似，BSA含有3個ɑ-螺旋域(Ⅰ-Ⅲ) ，每個ɑ-螺旋域包含2個亞螺旋域 A 和 B。為確定藥物小分子與BSA具體結(jié)合的位置，考察在2者的作用過程中色氨酸和酪氨酸殘基的實(shí)際參與情況，應(yīng)用Sulkowska和劉保生等[11-14]提出的方法，即比較波長在280 nm 和 295 nm 激發(fā)時LS-BSA體系熒光程度的降低變化(見圖5)。

圖5 λex為 280 nm 和 295 nm 時，LS-BSA熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of LS-BSA at λex=280 and 295 nmC BSA= 1.0×10-6 mol/L，CLS=7.1×10-5～9.94×10-4 mol/L

2.6 藥物協(xié)同性 BSA具有多重結(jié)合部位，藥物與BSA結(jié)合時，BSA各結(jié)合部位之間存在相互影響作用，這種相互影響作用稱為藥物的協(xié)同作用[11-14]，可用Hill方程[11-14]進(jìn)行分析：lgD/(1-D)=lgK+nHlg[C]，式中，D為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)，K為結(jié)合常數(shù)，nH為Hill系數(shù)。在熒光實(shí)驗(yàn)中：D/(1-D)=B/(Bm-B)，其中，B=(F0-F)/F0；1/Bm是1/B對1/[C]作圖的截距。LS-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見表5。

表5 不同溫度下的nH值

2.7 同步熒光研究LS對BSA構(gòu)象的影響 蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化通常用同步熒光光譜來分析，根據(jù)λem的變化來確定[11-14]其熒光猝滅主要由何種氨基酸殘基起主導(dǎo)作用，而且氨基酸殘基的λem移動方向與其所處的疏水性也緊密相關(guān)[11-14]。Δλ=60nm和Δλ=15nm分別顯示色氨酸和酪氨酸殘基的熒光特征[11-14]。在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下測LS加入BSA之后的同步熒光光譜(見圖6)。

圖6 LS猝滅BSA的同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous fluorescence spectrometry of BSA as LSCBSA= 1.0×10-5 mol/L, CLS=(0, 7.1, 14.196,28.392, 42.588, 63.882, 70.98, 85.176, 99.372, 113.568 ×10-5 mol/L)

2.8 金屬離子的影響 金屬離子的存在會直接影響藥物與血清白蛋白的結(jié)合[14-16]，有2種不同的影響：一是對藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合有增強(qiáng)作用；二是對藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合有減小作用[14-16]。因此，研究了MgSO4、CrCl3、CuSO4、FeCl3和MnCl2對LS與BSA的結(jié)合作用的影響，結(jié)果見表6。

表6 金屬離子對結(jié)合作用的影響

表中的Kb和Kb′分別表示LS與BSA在金屬離子不存在和存在時的結(jié)合常數(shù)，“*”代表不加任何金屬離子

3 討論

由圖2可知，3個溫度下的S-V曲線均呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度的升高，直線斜率減小，即Ksv減小，正好與靜態(tài)猝滅機(jī)理相吻合。按Kq=Ksv/τ0可求出不同溫度下的Kq值，結(jié)果列于表1中。表中所有溫度下的Kq值都大于最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)[7]，說明LS對BSA是靜態(tài)猝滅。

從表2可以看出，3個溫度下的相關(guān)系數(shù)都在0.995以上，其KLB值都在103數(shù)量級，而且KLB隨著溫度升高而降低，表明LS與BSA的結(jié)合是符合靜態(tài)猝滅特征的。

圖3中曲線1(LS)，曲線2(BSA)和曲線3-14(LS-BSA)對比表明隨著LS不斷加入BSA溶液中，峰形與峰位(265 nm紅移到275 nm)以及吸收強(qiáng)度都發(fā)生了改變，這表明LS與BSA發(fā)生像靜態(tài)猝滅那樣因?yàn)樯尚碌奈镔|(zhì)而改變紫外光譜[8]，而不是LS與BSA激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生動態(tài)猝滅，不改變吸收光譜的結(jié)果，所以3種方法最終確定LS-BSA的作用機(jī)理為靜態(tài)猝滅。

由表3可知，當(dāng)?shù)陀跍囟?08.5 K時，Kb和n隨溫度的增加而減??；當(dāng)溫度高于308.5 K時，Kb和n隨溫度的增加而增大；在308.5 K時Kb和n達(dá)到最小值；3個溫度下，n≈1，可形成一個結(jié)合位點(diǎn)。表明Kb和n對溫度變化不太敏感，即蛋白質(zhì)對藥物的運(yùn)輸受溫度的影響較小。

由表4可知，LS與BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔG<0，ΔH<0，ΔS>0表明LS與BSA為自發(fā)的，吸熱反應(yīng)。根據(jù)Ross等[10]總結(jié)出的判斷規(guī)律，推斷出LS與BSA的作用力為靜電作用力。

由圖 5可知，在波長在280 nm和295 nm激發(fā)下，LS對BSA的猝滅程度曲線是分開獨(dú)立的，說明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中，對比這2種波長下的熒光猝滅程度可知，在280 nm激發(fā)時的程度要熒光降低程度更大些，這一現(xiàn)象說明在LS與BSA的結(jié)合過程中，結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域ⅡA。

表5中3個溫度下的nH<1，表現(xiàn)為負(fù)協(xié)同作用[15-16]，說明LS與BSA結(jié)合過程中，隨著LS不斷的結(jié)合到BSA位點(diǎn)上，使得后續(xù)LS對BSA的親和性減弱，即前一個藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后，對后一個藥物分子與BSA的結(jié)合起到阻礙作用。雖然隨著溫度的變化，nH變化不大，但也隨溫度升高而減小，說明溫度的提升對LS藥物小分子之間的協(xié)同作用不利。

由圖6可知出，隨LS濃度的增大，這2種氨基酸殘基的λem均向長波移動，說LS的加入改變了BSA的構(gòu)象，使其疏水結(jié)構(gòu)增大，引起肽鏈的伸展程度增大，導(dǎo)致BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性減弱。因色氨酸的λem向長波移動的程度小于酪氨酸，表明色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性降低得更多[11-14]。酪氨酸的猝滅程度大于色氨酸，表明LS與BSA相結(jié)合的位點(diǎn)偏向于酪氨酸。

由表6可知，金屬離子不同，Kb′和n也不同，其原因可能是由于金屬元素本身的原子結(jié)構(gòu)不同，才導(dǎo)致結(jié)合力和結(jié)合位點(diǎn)的差異；Mg2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+的加入后，Kb和n都減小了，即金屬離子對藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合產(chǎn)生了抑制作用，其中Fe3+對體系影響最大。原因可能是金屬離子對LS與BSA結(jié)合產(chǎn)生了競爭作用，縮短了LS在血液中的停留時間，提高了藥效。但Cr3+的加入與其它4種離子所產(chǎn)生的效果相反，增大了原本的Kb和n值，促進(jìn)了BSA與藥物的結(jié)合作用，延長了LS在血液中的停留時間，減弱了藥物毒性。原因可能是金屬離子通過橋聯(lián)作用或形成“離子架橋”[14-16]方式參與其中導(dǎo)致的。以上這些不同恰好也說明不同人的血液中金屬離子含量不同，產(chǎn)生的藥效也不同。

綜上所述，用熒光和紫外光譜法證明了LS對BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，2者靠靜電作用力相互作用；通過計(jì)算求得了Kb和n值的大小，表明LS可以被BSA運(yùn)輸；2者結(jié)合位置位于BSA的ⅡA亞螺旋域中；在LS與BSA結(jié)合過程中，藥物分子之間有負(fù)協(xié)同性；同步熒光光譜表明LS使BSA構(gòu)象產(chǎn)生了影響，疏水性減弱，結(jié)合位點(diǎn)離酪氨酸更近。詳細(xì)研究了Mn2+、Cu2+、Cr3+、Mg2+、Fe3+對藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響。 Mg2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+對LS與BSA結(jié)合產(chǎn)生競爭作用，縮短了LS在血液中的停留時間，可提高藥效；Cr3+對LS與BSA結(jié)合產(chǎn)生促進(jìn)作用，可減弱藥物毒性。

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(編校：吳茜)

Study on the interaction between loxoprfen sodium with bovine serum albumin and effect of coexistent metal ion on the reaction by spectroscopic methods

LIU li,CHENG fei-xiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University, Qujing 655011, China)

ObjectiveTo investigate the interaction between loxoprfen sodium (LS)and bovine serum albumin (BSA)and discuss the effect of metal ions (Mn2+,Cu2+,Cr3+,Mg2+,Fe3+)on the interaction of LS with BSA.The theoretical basis was provided for further research on non-steroidal anti-inflammatory drugs and the further study of the inner mechanism and biological effect in organism of LS and the proteins.MethodsUnder the simulation of the human body physiological conditions，the interaction between LS and BSA was studied with UV-visible absorption spectra and fluorescence spectra.At 298.5,308.5，318.5 K, quenching constant(KSV)and speed constant(Kq)were calculated by S-V curves.Static quenching constant (KLB)was obtained by L-B double reciprocal equation.Double logarithmic equation was used to calculate the binding constants (Kb)and the number of binding site (n).Thermodynamic equation was used to obtain ΔH, ΔS, ΔG.Hill’s coefficients (nH)was obtained by Hill equation.ResultsAt different three temperatures, with LS concentration increasing, fluorescence intensity of BSA decreased regularly.The value of KSV,Kq,KLBandnHdecreased with the temperature increasing.ΔH and ΔG were lower than 0.ΔS was higher than 0.N was approximately equal to 1 andnH<1. ConclusionThe fluorescence of BSA was quenched by LS, which was a static quenching process.The interaction was mainly driven by electrostatic force.LS could be transported by BSA and the binding site was located at sub-domain ⅡA of BSA.The binding site was near by tyrosine residue.Mg2+,Cu2+,Mn2+and Fe3+competed with the interaction of LS with BSA, increasing medical effectiveness.Cr3+promoted on the interaction and reduced toxicology.

loxoprfen sodium; interaction; metal ions; bovine serum albumin; spectroscopy

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21261019)

劉里，女，講師，研究方向：藥物化學(xué)和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用研究，E-mail：18908746298@163.com。

O657.3

A

1005-1678(2015)01-0021-05