納豆激酶的制備及其降血脂功效研究

謝嵩,于宗琴,劉秀菊

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250022；2.山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，山東 臨沂 276000)

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納豆激酶的制備及其降血脂功效研究

謝嵩1,于宗琴2,劉秀菊1

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250022；2.山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，山東 臨沂 276000)

目的 利用納豆芽孢桿菌制備納豆激酶，并評(píng)價(jià)納豆激酶的降血脂功效。方法 采用酪蛋白平板初篩-搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法從市售納豆中篩選獲得高產(chǎn)納豆激酶的納豆枯草芽孢桿菌菌株，采用纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶酶活，以大豆為原料，利用該菌株制備納豆激酶凍干粉。選取72只Wistar高脂模型大鼠進(jìn)行降血脂功效研究，將其隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(普伐他汀鈉片200 mg/kg)、納豆激酶凍干粉高劑量組(360 mg/kg)、中劑量組(180 mg/kg)和低劑量組(90 mg/kg)。給藥前后分別用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(total triglyceride，TG)。結(jié)果 成功發(fā)酵制得納豆激酶凍干粉，大鼠喂養(yǎng)高脂飼料2周后其TC、TG水平較空白組顯著升高(P<0.05)，納豆激酶凍干粉高、中、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組在給藥6周后均能顯著降低TC ，TG水平(P<0.05)。結(jié)論 本研究制備的納豆激酶降血脂功效良好，為其作為降血脂藥物和保健品奠定了基礎(chǔ)。

納豆激酶；制備方法；降血脂

納豆激酶(nattokinase，NK)是在納豆發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，最早于1987年由日本科學(xué)家須見(jiàn)洋行博士發(fā)現(xiàn)并命名[1]。此后，人們對(duì)納豆激酶的生產(chǎn)及生化特性、保健功能進(jìn)行了研究[2-6]，但是關(guān)于納豆激酶降血脂的研究則較少，本文擬篩選得到一株活性高的納豆芽孢桿菌菌株，通過(guò)發(fā)酵制備納豆激酶粗品，利用纖維蛋白平板測(cè)定其酶活后，分別觀察不同劑量納豆激酶粉對(duì)脂代謝紊亂大鼠模型血脂水平的影響，為制備為降血脂藥物和保健品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 日本高橋納豆素購(gòu)自日本高橋祐藏研究所；櫻川納豆菌活性膠囊購(gòu)自吉林省雁鳴湖大豆生物科技有限責(zé)任公司；川秀納豆發(fā)酵劑購(gòu)自江蘇納克生物工程有限公司；北海道納豆購(gòu)自北海道株式會(huì)社(日本原裝進(jìn)口)；本場(chǎng)水戶納豆購(gòu)自本場(chǎng)株式會(huì)社(日本原裝進(jìn)口)；燕京納豆購(gòu)自北京燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司；御城納豆購(gòu)自大連美屋食品有限公司；大豆購(gòu)自市場(chǎng)上普通食用大豆(原產(chǎn)地山東)；益諾納豆激酶片由汕頭市雙駿生物工程有限公司生產(chǎn)；百合康牌納豆銀杏葉提取物膠囊由威海百合生物技術(shù)股份有限公司。

基礎(chǔ)飼料購(gòu)于山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；高脂飼料購(gòu)于北京科澳協(xié)力飼料有限公司(成分為：78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉和10%豬油、0.2%膽鹽)，北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(京)2009-0012。普伐他汀鈉片(中美上海施貴寶制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)1312041)；TC、TG檢測(cè)試劑盒購(gòu)于西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。纖維蛋白原F20131001購(gòu)自沈陽(yáng)拜英生物技術(shù)有限公司；凝血酶T6884購(gòu)自(Sigma公司，批號(hào)000908)。

1.2 儀器 ZXMP-A1230恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；MS304S分析天平(梅特勒-托利多公司)；自動(dòng)生化分析儀ADVIA 1800(西門(mén)子公司)；KDC-40低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠72只，平均體質(zhì)量(180±20)g，由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供(合格證號(hào)SCXK魯20130001)；本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基處方:酪蛋白平板初篩培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，酵母粉1 g/L，磷酸二氫鈉 1 g/L，磷酸氫二鈉2 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，酪素5 g/L，瓊脂粉20 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.2 g/L，pH=7.0；LB培養(yǎng)基(luria-bertani，JB)：蛋白胨1%，酵母粉 0.5%，氯化鈉 1%；纖維蛋白平板：2.5 mg/mL纖維蛋白原15 mL，1.5%瓊脂糖20 mL，凝血酶 12.5U。

1.4.2 高產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌的篩選：將日本高橋納豆素、櫻川納豆菌活性膠囊、川秀納豆發(fā)酵劑分別挑取適量溶于無(wú)菌水中，稀釋后涂布LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。北海道納豆、本場(chǎng)水戶納豆、燕京納豆、御城納豆分別挑取幾粒至含30 mL無(wú)菌水和十余顆玻璃珠的錐形瓶中，放入37 ℃搖床中振搖30 min，取出后沸水浴煮5 min，冷卻后稀釋涂布LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

挑取經(jīng)培養(yǎng)后LB平板培養(yǎng)基上的單菌落點(diǎn)板于酪蛋白初篩平板[7]，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察酪蛋白初篩平板上單菌落周?chē)该魅Φ那闆r并進(jìn)行測(cè)量，選取透明圈直徑與菌落直徑比大者轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，保存，待復(fù)篩。

取初篩所得的菌株，轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，活化12 h后按3%接種量轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵培養(yǎng)液各1 mL，12000 r/min離心5 min，上清液稀釋100倍后取10 μL加入已打好孔的纖維蛋白平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置18 h，測(cè)定透明圈直徑，計(jì)算透明圈面積，面積大者表明纖溶活性較高。選取纖溶活性最高的一株菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用菌株。

1.4.3 納豆激酶樣品的制備：種子液的活化：取篩選保存的納豆枯草芽孢桿菌甘油管，轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

原料預(yù)處理：原料大豆經(jīng)精選后清洗，選擇粒型飽滿、整齊一致的大豆，以小?；驑O小粒為佳，室溫下清水浸泡15～20 h。

蒸煮：浸泡后的大豆在0.13 MPa的壓力下蒸煮30 min，蒸煮后的大豆應(yīng)保持大豆形態(tài)，用手輕輕一捻即碎。無(wú)菌條件下按原料重量2%～4%接種量接種納豆芽孢桿菌，將豆子與菌液充分混勻。

發(fā)酵：于37 ℃、85%濕度條件下的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)24～36 h，發(fā)酵結(jié)束后于4 ℃下后熟24 h[8-10]。

凍干：發(fā)酵后的新鮮納豆經(jīng)送入預(yù)冷室冷凍至-35 ℃～-40 ℃，轉(zhuǎn)至凍干室，通過(guò)溫度控制，調(diào)節(jié)凍干速度凍干，凍干后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎即成納豆激酶樣品粉末。

1.5 納豆激酶樣品纖溶活性的測(cè)定 納豆激酶纖溶活性的測(cè)定采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[11-12]，即根據(jù)納豆激酶將纖維蛋白平板內(nèi)纖維蛋白水解而形成透明圈的原理，利用透明圈面積計(jì)算納豆激酶纖溶活性。該方法是目前最常用的的纖溶酶溶栓活力的測(cè)定方法，也是最早用于納豆激酶溶栓活力的測(cè)定方法之一。

稱(chēng)取130 mg納豆激酶粉，用10 mL生理鹽水溶解，同時(shí)取1片益諾牌納豆激酶片(含納豆激酶粉130 mg)、1粒百合康牌納豆銀杏葉提取物膠囊分別用10 mL生理鹽水溶解。將以瓊脂糖作為固體支持，以凝血酶和纖維蛋白原作用后制成的人工血栓平板打孔，分別取上述3種樣品10 μL注射于孔內(nèi)，37 ℃孵育18 h，測(cè)量透明圈大小，并根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上標(biāo)示酶活計(jì)算納豆激酶粉樣品酶活。

1.6 納豆激酶樣品降血脂功效研究 在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下全部大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料1周，禁食12 h后稱(chēng)重，眼內(nèi)眥取血，25 ℃室溫靜置1 h，3000 min離心10 min，取血清，通過(guò)試劑盒用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG水平。

脂代謝紊亂大鼠模型的建立[13-15]：大鼠72只，隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(普伐他汀鈉片200 mg/kg)、納豆激酶粉高劑量組(360 mg/kg)、中劑量組(180 mg/kg)和低劑量組(90 mg/kg)?？瞻捉M始終喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠均換用高脂飼料喂養(yǎng)，2周后眼內(nèi)眥取血(取血前禁食12 h)，測(cè)定血清TC、TG水平。

除空白組外，將喂養(yǎng)高脂飼料2周后大鼠再次根據(jù)測(cè)定的TC水平進(jìn)行調(diào)整?？瞻捉M與模型組每日灌胃蒸餾水1 mL，陽(yáng)性對(duì)照組每日按照劑量給予普伐他汀鈉片，實(shí)驗(yàn)組按照劑量給予納豆激酶粉。陽(yáng)性對(duì)照組及納豆激酶粉高、中、低劑量組分別按照相應(yīng)的劑量每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥6周，每周稱(chēng)重1次，每次稱(chēng)重前禁食12 h。給藥6周后大鼠隔夜禁食12 h，眼內(nèi)眥取血，測(cè)定血清TC、TG水平。

2 結(jié)果

2.1 高產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌的篩選 經(jīng)酪蛋白初篩平板初篩，得到透明圈直徑與菌落直徑比較大的9株菌，測(cè)定其透明圈直徑，透明圈面積最大的一株菌即為活性最高的菌，通過(guò)計(jì)算選取NK-4繼續(xù)研究。不同株菌透明圈大小比較見(jiàn)表1。

表1 不同菌株透明圈面積大小比較

2.2 納豆激酶粗品的制備 發(fā)酵成熟的納豆色澤金黃，表面覆有一層白色的粘性物質(zhì)，挑起時(shí)有長(zhǎng)長(zhǎng)的拉絲，見(jiàn)圖1。將發(fā)酵好的納豆凍干，磨碎成粉，即得到納豆激酶粗品。

圖1 制備的納豆成品Fig.1 Preparation of natto products

2.3 納豆激酶纖溶活性的測(cè)定 將纖維蛋白平板從37 ℃培養(yǎng)箱中取出，可見(jiàn)纖維蛋白平板上有清晰的透明圈(見(jiàn)圖2)，測(cè)量透明圈大小(見(jiàn)表2)，計(jì)算得130 mg納豆激酶粉樣品酶活約為1000 FU。百合康牌納豆銀杏葉提取物膠囊是經(jīng)SFDA認(rèn)證的加蓋小藍(lán)帽的保健食品(國(guó)食健字G20130204)，從結(jié)果看出130 mg納豆激酶粉含有的纖溶活性物質(zhì)與1粒百合康膠囊相近，可以達(dá)到保健食品的要求。

圖2 纖維蛋白平板結(jié)果 Fig.2 Results of the fibrin plate 1.益諾牌納豆激酶片；2.百合康牌納豆銀杏葉提取物膠囊；3.納豆激酶粉樣品1.Yi Nuo nattokinase tablets;2.Bai He Kang natto and ginkgo leaf extract capsule;3.Nattokinase samples

樣品透明圈直徑(mm)透明圈面積(mm2)酶活(FU)118.5×18.02611200217.0×17.0226—317.0×16.52201000

2.4 納豆激酶降血脂功效研究 納豆激酶粉對(duì)高血脂大鼠血脂的影響：高脂飼料給藥前2周，與空白組比較，各組大鼠血清TC、TG水平顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組相比，血清TC和TG水平幾乎無(wú)變化。見(jiàn)表3；給藥6周后，與空白組比較，各組大鼠血清TC、TG水平顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)表明模型成立；與模型對(duì)照組相比，普伐他汀鈉陽(yáng)性對(duì)照組和納豆激酶粉低、中、高劑量組的TG、TC水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中血脂水平測(cè)定結(jié)果±s)

*P<0.05，與空白組比較，compared with blank group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用酪蛋白平板初篩-搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法，通過(guò)纖維蛋白平板測(cè)定活性，從市售納豆中篩選獲得高產(chǎn)納豆激酶的納豆枯草芽孢桿菌菌株。然后以普通大豆為原料，利用篩選的菌株在恒溫恒濕條件下發(fā)酵得到納豆，凍干后磨碎得到納豆激酶粉。在Wistar高脂大鼠模型上進(jìn)行降血脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納豆激酶粉高、中劑量組具有降血脂功效，但降血脂強(qiáng)度不如他汀類(lèi)藥物。李瑞芳[13]等也對(duì)納豆激酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂大鼠的降脂作用進(jìn)行了研究，190、380、570 mg/kg劑量組TG、TC水平均顯著下降。孟繁宇等[5]用提純的納豆激酶在動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納豆激酶組降血脂功效同樣不如他汀藥物組，TC、TG水平雖顯著下降，但不如他汀藥物組，但納豆激酶組在降低血液粘度方面卻有很顯著的效果，使大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)得以改善。

雖然納豆激酶降血脂強(qiáng)度不如他汀類(lèi)藥物，但是與他汀類(lèi)藥物相比納豆激酶幾乎無(wú)不良反應(yīng)[14]，不會(huì)對(duì)人體造成損傷，還可以降低血液粘度，改善血液流變學(xué)指標(biāo)。而且納豆激酶是由大豆發(fā)酵而成，大豆中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，包含多種氨基酸，大量的黏性物質(zhì)如多肽與多糖，其中異黃酮、皂苷素、粗多糖、磷脂等都是SFDA批準(zhǔn)注冊(cè)的輔助降血脂保健品種中常見(jiàn)的功能因子[15]，這些功能因子多為抗氧化物質(zhì)，能有效降低血脂、膽固醇及清除腦組織中過(guò)氧化脂質(zhì)色素，也能起到輔助降血脂的功效。另外，納豆激酶也被公認(rèn)具有良好的溶血栓效果，纖維蛋白平板實(shí)驗(yàn)也證明了其纖溶活性；納豆中的粘性物質(zhì)中含有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可以起到降血壓的作用。

納豆及納豆激酶擁有的這些功能優(yōu)勢(shì)為其開(kāi)發(fā)為預(yù)防心腦血管疾病藥物和保健品奠定了基礎(chǔ)。若能將納豆激酶提純，則可進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)為藥物，發(fā)揮其在溶血栓和降血脂方面的功效，造福于人類(lèi)健康。

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(編校：王冬梅)

Preparation of nattokinase and study on its hypolipidemic effect

XIE Song1,YU Zong-qin2,LIU Xiu-ju1

(1.Department of Pharmacy, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250022, China;2.Shandong Medical College, Linyi 276000, China)

ObjectiveTo prepare nattokinase usingBacillussubtilisnatto,and evaluate its hypolipidemic effect.MethodsA strain ofBacillussubtilisnattowas screened from traditional Japanese food natto with an improved method.The screening strategy included the first selection with the casein plate and the further approach with shaking culture.Fermented the boiled soybean with the screened strain ofBacillussubtilisnatto.Then the fermented natto was vacuum freeze-dried and grinded to get nattokinse.After detecting the fibrinolytic activity of nattokinase the hypolipidemic effect was carried out on 72 Wistar rats with hyperlipidemia.It was randomly divided into 6 groups,blank control group,model group,positive control group (pravastatin sodium tablets,200 mg/kg),nattokinase freeze-dried powder in high dose group(360 mg/kg),medium dose group (180 mg/kg)and low dose group(90 mg/kg),respectively.Before and after the administration of drugs were used for determination of total cholesterol automatic biochemical analyzer TC and TG level.ResultsA high yield strain ofBacillussubtilisnattowas screened and nattokinase was fermented with soybeans.The TC,TG level was significantly higher than the control group after two weeks feeding high-fat diet(P<0.05).Nattokinase high dose group (360 mg/kg),middle dose group (180 mg/kg),positive control group and low dose group(90 mg/kg)significantly reduced TC,TG levels (P<0.05). ConclusionNattokinase has hypolipidemic effect,which is prepared in this study,also lay the foundation for developing new health products.

nattokinase; preparation method; hypolipidemic effect

謝嵩，女，碩士，主管藥師，研究方向：生物藥學(xué)，E-mail：xiesong3800@sina.com。

R543.5

A

1005-1678(2015)01-0017-04