石杉?jí)A甲生物合成與代謝調(diào)控關(guān)鍵基因的差異表達(dá)分析

張君誠(chéng),陳作毅,宋育紅,2

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 三明 365004; 2.復(fù)旦大學(xué)三明學(xué)院天然藥物工程研究中心,福建 三明 365004)

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石杉?jí)A甲生物合成與代謝調(diào)控關(guān)鍵基因的差異表達(dá)分析

張君誠(chéng)1,2Δ,陳作毅1,宋育紅1,2

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 三明 365004; 2.復(fù)旦大學(xué)三明學(xué)院天然藥物工程研究中心,福建 三明 365004)

目的 選擇并比較L-賴(lài)氨酸脫羧酶、CYP450(CYP450-71A1和CYP450-72A1)、加雙氧酶、N-甲基轉(zhuǎn)移酶等石杉?jí)A生物合成途徑可能的關(guān)鍵基因(酶)在華南馬尾杉(Phlegariurus austrosinicus(ching)L.B.Zhang)和有柄馬尾杉(Phlegariurus petiolatus (C.B.Clarke) H.S.Kung et L.B.Zhang)中差異表達(dá)的情況。方法 以相同生境但石杉?jí)A甲含量差異明顯的一對(duì)石杉科馬尾杉屬植物華南馬尾杉與有柄馬尾杉為試材，提取總RNA并進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)文獻(xiàn)分別設(shè)計(jì)引物，開(kāi)展熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)并對(duì)2者的差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 加雙氧酶基因在高含量石杉?jí)A甲的有柄馬尾杉中表達(dá)，但在華南馬尾杉中表達(dá)量極低或者不表達(dá)；在有柄馬尾杉植體中相對(duì)高表達(dá)的基因有L-賴(lài)氨酸脫羧酶基因(約180倍)，CYP450-71A1基因(約33倍)，CYP450-72A1基因(約223倍)；N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因在2種材料中表達(dá)量接近。結(jié)論 加雙氧酶基因極有可能編碼石杉?jí)A生物合成限速酶和關(guān)鍵酶，導(dǎo)致2種植物中石杉?jí)A甲的含量明顯差異；L-賴(lài)氨酸脫羧酶基因、CYP450-71A1基因、CYP450-72A1基因編碼的蛋白對(duì)石杉?jí)A甲的積累具有促進(jìn)作用；N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因應(yīng)是編碼定位于石杉?jí)A生物合成途徑下游石杉?jí)A與石杉?jí)A甲之間轉(zhuǎn)換的催化酶，但非關(guān)鍵限速酶。

石杉?jí)A甲；生物合成；基因；熒光定量PCR

石杉?jí)A甲(Huperzine A, Hup A)作為一種強(qiáng)效、低毒且高選擇性的中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑，在中老年癡呆等疾病的治療價(jià)值日益凸顯。由于石杉?jí)A甲在生長(zhǎng)緩慢且生物量很低的天然石杉植物全草中含量甚微，故野生資源壓力巨大，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求[1]。石杉?jí)A甲開(kāi)環(huán)的吡啶酮環(huán)和六氫吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使其人工合成的成本遠(yuǎn)高于植物提取[2]，且目前已合成的一百多個(gè)石杉?jí)A甲類(lèi)似物的抑酶活性大多明顯不如天然石杉?jí)A甲[3]。

近年來(lái)生物合成與代謝工程已成為提高植物次生代謝物產(chǎn)量的潛在途徑之一。目前認(rèn)為石杉?jí)A甲生物合成的起始物為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸[4]，它被L-賴(lài)氨酸脫羧酶催化脫羧形成1，5-戊二胺，1，5-戊二胺脫去NH2形成1-哌啶烯，后者與丙酮二碳酸或Malonyl-CoA形成石榴堿；石榴堿和4PAA/4PAACoA脫羧形成Phlegmarine，Phlegmarine在CYP450催化下，形成石松定堿骨架(Lycodane，石杉?jí)A甲的前體物質(zhì))，再經(jīng)過(guò)一系列的氧化開(kāi)環(huán)、脫甲基以及甲基化(N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化)，最終形成石杉?jí)A甲[5]。目前關(guān)于石杉?jí)A甲生物合成與代謝途徑的關(guān)鍵基因的研究報(bào)道較少，僅見(jiàn)Luo[6-7]通過(guò)RT-PCR技術(shù)篩選出了蛇足石杉(Huperzia serrata)的CYP450基因，并認(rèn)為該基因參與石杉?jí)A甲形成的報(bào)道。

在石杉植物野外生態(tài)及植物化學(xué)工作中，研究發(fā)現(xiàn)在同一生境下的同為石杉科馬尾杉屬植物的華南馬尾杉與有柄馬尾杉2者之間石杉?jí)A甲含量甚異，后者幾近為前者的10倍[8]。這為石杉?jí)A代謝途徑關(guān)鍵基因的差異研究提供了一對(duì)良好的實(shí)驗(yàn)材料，在前述認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上，選擇并定量比較L-賴(lài)氨酸脫羧酶、CYP450(CYP450-71A1和CYP450- 72A1)、加雙氧酶、N-甲基轉(zhuǎn)移酶等可能的關(guān)鍵基因(酶)在2種材料中差異表達(dá)的情況，對(duì)于揭示石杉?jí)A的生物合成與代謝調(diào)控路徑與機(jī)制應(yīng)該具有重要的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 植物材料 實(shí)驗(yàn)材料華南馬尾杉(Phlegariurus austrosinicus(ching)L.B.Zhang)、有柄馬尾杉(Phlegariurus petiolatus (C.B.Clarke)H.S.Kung et L.B.Zhang)的新鮮莖葉，由項(xiàng)目組于2012年秋季采集于福建省尤溪縣高山村的福建省石杉科植物種質(zhì)資源圃。植物材料由復(fù)旦大學(xué)潘勝利教授與本文作者鑒定。

1.2 試劑與儀器設(shè)備 GoTaq(R) qPCR Master Mix試劑盒(Promega公司)；TRIzon Reagent CW0580A(康為世紀(jì)公司)；M-MLV M1701(Promega)；RNasin N2511(Promega公司)；常用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑自配。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QP4811型(百泰克)，自動(dòng)凝膠圖像分析儀JS-380A(上海培清科技公司)，凝膠成像儀GIS 2008(上海天能公司)。

1.3 總RNA的提取與總RNA反轉(zhuǎn)錄 RNA提取按康為世紀(jì)TRIzon Reagent(CW0580A)說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行；總RNA的反轉(zhuǎn)錄使用Promega M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，方法按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI蛇足石杉(Huperzia serrata)EST數(shù)據(jù)庫(kù)序列GenBank: GO912417.1，被注釋為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的序列[9],選定該系列為每場(chǎng)基因。另外，EST數(shù)據(jù)庫(kù)序列GenBank: GO914645.1，被注釋為編碼L-賴(lài)氨酸脫羧酶的蛇足石杉mRNA序列；GenBank: GO914428.1，GO913165.1，GO911852.1被注釋為CYP450；GenBank: GO912724.1被注釋為加雙氧酶；GenBank: GO913407.1被注釋為N-甲基轉(zhuǎn)移酶。結(jié)合使用primer premier 5.0，oligo 6.0等軟件設(shè)計(jì)引物，由博尚生物技術(shù)有限公司合成。見(jiàn)表1。

表1 關(guān)鍵酶基因熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

1.4.2 熒光定量分析：室溫配制PCR反應(yīng)混合液20 μL，其中cDNA模板2.0 μL，上游引物(10 μM)0.4 μL，下游引物(10 μM)0.4 μL，2×GoTaq? qPCR Master Mix, 10 μL ，Nuclease-Free Water 7.2 μL，分至各反應(yīng)管，加入2 μL模板或Nuclease-Free Water(陰性對(duì)照)。輕微離心并去除8聯(lián)管中反應(yīng)物的氣泡；采用三步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。溫度降至4 ℃，后繼續(xù)加熱進(jìn)行溶解曲線(xiàn)測(cè)定；50 ℃～90 ℃，每隔1 ℃持續(xù)測(cè)定熒光信號(hào)10 s。結(jié)果通過(guò)百泰克熒光定量PCR雙通道軟件系監(jiān)測(cè)分析。

2 結(jié)果

根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果數(shù)值，使用內(nèi)參基因的Ct值歸一化目的基因的Ct值，計(jì)算ΔCt，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)；用華南馬尾杉的關(guān)鍵酶基因ΔCt值歸一化有柄馬尾杉的ΔCt值。按照Livak等[10]方法計(jì)算ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt(有柄馬尾杉)-ΔCt(華南馬尾杉)； 計(jì)算相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)水平比率，求2-ΔΔCT。見(jiàn)表2。

表2 熒光數(shù)據(jù)分析

由表2得知：①華南馬尾杉L-賴(lài)氨酸脫羧酶基因的Ct值為18.98333，而有柄馬尾杉中該基因的Ct值為18.94333，通過(guò)歸一化方法可知有柄馬尾杉中該基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)勝過(guò)華南馬尾杉(約180倍)；②華南馬尾杉中CYP450 71A1基因的Ct值為30.11，有柄馬尾杉該基因的Ct值為32.52，通過(guò)歸一化方法可知有柄馬尾杉中該基因表達(dá)量為華南馬尾杉的33倍；③華南馬尾杉CYP450 72A1基因的Ct值為18.73333，有柄馬尾杉該基因的Ct值為：18.39，GAPDH基因的的Ct值為：31.89。通過(guò)歸一化方法可知有柄馬尾杉中該基因表達(dá)量為華南馬尾杉的223倍。④華南馬尾杉加雙氧酶基因的Ct值平均超過(guò)38，GAPDH基因的的Ct值為：24.42667；有柄馬尾杉加雙氧酶基因的Ct值為：30.03，GAPDH基因的的Ct值為：31.89。通過(guò)歸一化方法可知加雙氧酶基因在有柄馬尾杉中有表達(dá)，該基因在華南馬尾杉暫無(wú)檢測(cè)到克隆，因此，可以認(rèn)為該酶在華南馬尾杉中表達(dá)量極低或者不表達(dá)。⑤華南馬尾杉N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的Ct值為19.26333，GAPDH基因的的Ct值為：25.47；有柄馬尾杉加雙氧酶基因的Ct值為：19.27333，GAPDH基因的的Ct值為：25.76667。通過(guò)歸一化方法可知有柄馬尾杉中N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量約為華南馬尾杉的0.8倍。

根據(jù)熒光數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果，制成各關(guān)鍵酶基因表達(dá)差異倍數(shù)圖，更加具體形象的反映了關(guān)鍵酶基因差異表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 各關(guān)鍵酶基因表達(dá)差異倍數(shù)圖Fig.1 The key genes differential expression

圖1中灰色柱狀圖(上)表示華南馬尾杉關(guān)鍵酶基因表達(dá)情況，白色柱狀圖(下)表示有柄馬尾杉關(guān)鍵酶基因表達(dá)情況。經(jīng)歸一化后，除了加雙氧酶基因無(wú)表達(dá)為“0”外，其余基因均被修正為“1”。特別說(shuō)明：淺色透明為有柄馬尾杉加雙氧酶表達(dá)量，經(jīng)2-ΔΔCT計(jì)算后相對(duì)華南馬尾杉其表達(dá)量倍數(shù)為無(wú)窮大。

同時(shí)，對(duì)各關(guān)鍵酶基因qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳定性分析，見(jiàn)圖2。圖中左半部分為內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)凝膠電泳圖，右半部分為關(guān)鍵目的基因表達(dá)凝膠電泳圖。圖2至少直觀地顯示Group 4的加雙氧酶基因再兩種馬尾杉中的表達(dá)差異十分明顯，該基因在華南馬尾杉中幾乎看不到擴(kuò)增條帶。凝膠電泳圖直觀結(jié)果與熒光定量PCR數(shù)據(jù)基本吻合。

圖2 各關(guān)鍵酶基因表達(dá)差異電泳圖Group1：L-賴(lài)氨酸脫羧酶基因差異表達(dá)；Group 2：細(xì)胞色素P450-72A1基因差異表達(dá)；Group 3：細(xì)胞色素P450-71A1基因差異表達(dá)；Group 4：加雙氧酶基因差異表達(dá)；Group 5：N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因差異表達(dá)Fig.2 Electrophoresis of the differentially expressed key genes Group1: differential expression of l-lysine tryptophan decarboxylase gene；Group 2:differential expression of cytochrom P450-72A1 gene；Group 3:differential expression of cytochrome P450-71A1；Group 4:differential expression dioxygenase gene;Group 5:differential expression of N-methyltransferase gene

3 討論

石杉?jí)A甲的天然來(lái)源不足與其衍生物ZT-1的藥源需求矛盾十分突出。有關(guān)藥源植物(石杉)組織培養(yǎng)研究[11]、產(chǎn)石杉?jí)A甲內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)[12]、石杉?jí)A甲全合成、類(lèi)似物或衍生物合成[2-3]等尋找更多的石杉?jí)A甲來(lái)源的研究時(shí)有報(bào)道，但都難以達(dá)到替代藥源的效果。目前石杉?jí)A甲主要還是來(lái)源于生長(zhǎng)緩慢且資源日漸稀少的石杉科天然植物。喜樹(shù)堿(吲哚生物堿)等生物合成與代謝研究為植物重要次生代謝物的生物合成與代謝工程研究提供了很好的思路[13]。當(dāng)然，開(kāi)展這方面工作，對(duì)合成與代謝途徑中的關(guān)鍵(限速)酶的了解與研究就顯得十分重要。有報(bào)道已獲得部分蛇足石杉的轉(zhuǎn)錄組信息，從中發(fā)現(xiàn)了可能參與蛇足生物堿、三萜合成的轉(zhuǎn)錄本，并從中發(fā)掘了可能參與石杉?jí)A甲、三萜化合物等化合物的生物合成的CYP450[6-7]、HsCAS1[14]和鯊烯合酶 HsSQS1[9]等基因，為石杉植物重要次生代謝物的生物合成途徑研究提供了一些基礎(chǔ)。

姬生國(guó)等[15]使用石杉?jí)A甲含量幾乎為零的東北石杉(Huperzia miyoshiana (Makino) Ching)與含量高的伏貼石杉(Huperzia selago (Linn.) Bernh.ex shrank et Mart.var.appressa (Desv.) Ching)做為一組試材并進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選，發(fā)現(xiàn)一種只存在于伏貼石杉中的絲裂素調(diào)節(jié)蛋白(Mrp3)，該蛋白被證實(shí)是一種具有促使煙草分泌次生代謝物香紫蘇醇作用的與ATP結(jié)合的卡盒型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[16]。與他們工作思路類(lèi)似，本研究通過(guò)熒光定量分析石杉?jí)A甲含量明顯差異的一對(duì)石杉植物中可能參與石杉?jí)A生物合成與代謝調(diào)控基因的差異表達(dá)，為這方面研究提供了新的信息。

結(jié)果中最值得注意的是加雙氧酶基因。加雙氧酶在生物體中普遍存在，其催化底物添加一分子的氧，形成結(jié)構(gòu)式中帶有氧原子的產(chǎn)物，該酶是酮類(lèi)物質(zhì)合成所依賴(lài)的酶。本研究中該基因在高石杉?jí)A含量的有柄馬尾杉中表達(dá)量正常，而在低石杉?jí)A含量的華南馬尾杉中表達(dá)量幾乎不表達(dá)，提示加雙氧酶在石杉?jí)A生物合成與代謝調(diào)控途徑中扮演著重要的限速酶角色，估計(jì)與石杉?jí)A甲結(jié)構(gòu)中的吡啶酮環(huán)合成相關(guān)，可能直接導(dǎo)致了2種馬尾杉植體中石杉?jí)A甲的含量明顯差異。

L-賴(lài)氨酸脫羧酶主要生物學(xué)功能是催化 L-賴(lài)氨酸脫羧生成1，5-戊二胺(尸胺)和二氧化碳。近年陸續(xù)證實(shí)多胺在生物體內(nèi)廣泛存在，可作為植物次生代謝產(chǎn)物生物堿的重要前體物質(zhì)。本研究表明該基因在有柄馬尾杉中表達(dá)量分別是華南馬尾杉中的約180倍，說(shuō)明該基因編碼的蛋白質(zhì)活躍于石杉?jí)A代謝調(diào)控路徑中，對(duì)石杉科植物體內(nèi)石杉?jí)A含量的積累具有明顯的促進(jìn)作用。

CYP450是植物中最大的蛋白家族之一, 以可溶性及膜結(jié)合(與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器膜結(jié)合)兩種形態(tài)存在，廣泛參與包括氧化性脫氨、氧化性的碳碳鍵斷裂等植物次生代謝反應(yīng)[17-18]。其家族中CYP450-71A1、 CYP450-72A1、CYP450-74A1及CYP450-90A1等具備相似的催化性質(zhì)，均具有充當(dāng)電子載體活性以及單氧酶活性的能力，可加入或去除一原子的氧，對(duì)石杉?jí)A特殊構(gòu)象的形成具有重要作用。羅紅梅等[7]篩選了蛇足石杉葉片中較根系高表達(dá)的CYP450基因，并認(rèn)為其可能編碼開(kāi)鏈馬錢(qián)子苷合成酶(secologanin synthase，SLS)，后者催化馬錢(qián)子苷氧化斷裂形成開(kāi)鏈馬錢(qián)子苷，證實(shí)了CYP450基因在石杉?jí)A生物合成過(guò)程中的重要作用[19]。本研究中CYP450-71A1基因、CYP450-72A1基因在有柄馬尾杉中表達(dá)量分別是華南馬尾杉中的約33倍和223倍。可以這樣判斷，這2個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)活躍于石杉?jí)A代謝調(diào)控路徑中，它們的存在對(duì)石杉科植物體內(nèi)石杉?jí)A含量的積累具有促進(jìn)作用。其中，CYP450-71A1基因編碼的蛋白可能為加單氧酶，這可能是石杉定堿骨架轉(zhuǎn)化為石杉?jí)A甲結(jié)構(gòu)中的吡啶酮環(huán)的作用酶，其表達(dá)直接影響石杉?jí)A甲在石杉科植物體內(nèi)的含量。而對(duì)于高表達(dá)的CYP450-72A1基因，因其注釋結(jié)果與CYP450-74A1基因具有較高相似度，其編碼細(xì)胞分裂素羥化酶。

N-甲基轉(zhuǎn)移酶可以特異性識(shí)別底物并轉(zhuǎn)移N原子位上的甲基[20]。在石杉?jí)A甲合成中，該基因編碼的蛋白定位于石杉?jí)A生物合成途徑下游石杉?jí)A與石杉?jí)A甲之間甲基轉(zhuǎn)換的催化酶，使得石杉?jí)A甲最終形成。在本研究關(guān)注的五個(gè)關(guān)鍵酶基因中，該基因是唯一一個(gè)有柄馬尾杉較華南馬尾杉略低表達(dá)的基因，說(shuō)明該基因?qū)τ谑級(jí)A生物合成雖不可或缺，但應(yīng)該不是關(guān)鍵的限速酶。

石杉?jí)A生物合成與代謝途徑復(fù)雜，參與調(diào)控的酶種類(lèi)也繁多，仍有許多不確定的中間體產(chǎn)物的存在，目前的研究只是開(kāi)始，接下來(lái)可以篩選更多功能基因，開(kāi)展基因的生物信息學(xué)分析并進(jìn)行蛋白的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)、理化性質(zhì)與酶作用位點(diǎn)分析，以期為闡明石杉?jí)A甲生物合成與代謝途徑提供更多基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Analysis of differential expression of the key enzyme genes involved in Huperzine A biosynthesis and metabolic pathways

ZHANG Jun-cheng1,2Δ,CHEN Zuo-yi1,Song Yu-hong1,2

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Monitoring Resource Environment and Sustainable Management Utilization, Sanming 365004, China; 2.Research Center of Natural Medicines Engineer, Fudan University & Sanming College, Sanming 365004, China)

ObjectiveTo compare differential expression of the key enzyme genes involved in Huperzine A biosynthetic and metabolic pathways between Phlegariurus austrosinicus(ching)L.B.Zhang and Phlegariurus petiolatus (C.B.Clarke) H.S.Kung et L.B.Zhang.The key enzyme genes including such as L-lysine decarboxylase gene, Cytochrome P450 gene(CYP450-71A1 and CYP450-72A1), dioxygenase gene, and N-methyltransferase gene.MethodsExperimental materials were Phlegariurus austrosinicus and Phlegariurus petiolatus, they belonged to the family of Huperziaceae and live in the same habitat, but the contents of Huperzine A between them were of great difference.Their total RNAs were extracted and reverse transcribed into cDNA.Differential expression results were analyzed by fluorescence quantitative PCR, the PCR-primers were designed according to the published literature.ResultsThe dioxygenase gene expressed highly in Phlegariurus petiolatus and did not detected expression in Phlegariurus austrosinicus.Further, highly expressed genes in Phlegariurus petiolatus were L-lysine decarboxylase gene(about 180 times), Cytochrome P450-71A1(about 33 times) and Cytochrome P450-72A1(about 223 times).While, the amount of methyltransferase gene expression in the two materials was close. ConclusionDioxygenase gene is very likely to be the key rate-limiting enzyme that encoded protein of Huperzine A biosynthesis that lead the content of Huperzine A between the two materials to be of significant difference.The other genes that highly expressed genes in phlegariurus petiolatus were L-lysine decarboxylase gene, Cytochrome P450-71A1 and Cytochrome P450-72A1.These genes encoding the protein were active in the biosynthetic and metabolic pathways of the Huperzine A.Methyltransferase gene is catalyzing enzyme but not the key rate-limiting enzyme, it plays a part in the step of Huperzine transform into Huperzine A, that is in the end of Huperzine A biosynthetic and metabolic pathways.

Huperzine A; biosynthesis; gene; FQ-PCR

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2012J01145)；福建省生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目

張君誠(chéng)，博士，教授，研究方向：藥用植物資源與生物技術(shù)研究，E-mail：5988603101@163.com。

R931

A

1005-1678(2015)01-0001-05