木犀草素直腸保留灌腸對哮喘模型大鼠幼鼠干擾素-γ及白細(xì)胞介素-4的影響

洪麗軍，魏廣州，陳祖仁，劉克新*，張永政，王芳，王叢禮

（牡丹江市中醫(yī)醫(yī)院兒科，黑龍江牡丹江157000）

木犀草素直腸保留灌腸對哮喘模型大鼠幼鼠干擾素-γ及白細(xì)胞介素-4的影響

洪麗軍，魏廣州，陳祖仁，劉克新*，張永政，王芳，王叢禮

（牡丹江市中醫(yī)醫(yī)院兒科，黑龍江牡丹江157000）

目的：探討木犀草素直腸保留灌腸對哮喘模型大鼠幼鼠血清中干擾素-γ（IFN-γ）及白細(xì)胞介素4（IL-4）的影響。方法將80只雌雄各半SD大鼠幼鼠分成空白組、模型組、灌胃組、灌腸組，各20只。運用ELISA法測定血清中IFN-γ及IL-4含量，鏡下觀察哮喘模型大鼠幼鼠肺組織變化。結(jié)果與模型組比較，灌腸組和灌胃組均可明顯升高支氣管哮喘大鼠血清IFN-γ含量，及降低IL-4含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。灌腸組與灌胃組病理組織學(xué)觀察肺組織浸潤減少，管壁和平滑肌厚度減少，組織充血水腫現(xiàn)象減輕。結(jié)論木犀草素保留灌腸能夠降低哮喘大鼠幼鼠血清中IL-4及增加IFN-γ含量。

木犀草素；哮喘；白細(xì)胞介素4；干擾素-γ；保留灌腸；大鼠幼鼠

哮喘已經(jīng)成為僅次于癌癥的世界第二大致死和致殘疾病，而中國已經(jīng)成為全球哮喘病死率最高的國家之一［1］。哮喘病因迄今尚未完全明確。其病因多樣，研究發(fā)現(xiàn)有多種基因參與，同時其發(fā)病也離不開

個體因素和環(huán)境因素的共同作用［2］。研究表明Th1／Th2失衡理論是哮喘發(fā)病機(jī)制的重要原因之一［3-4］。哮喘發(fā)作期患兒血清中代表Th1功能的IFN-γ水平降低，代表Th2功能的IL-4水平明顯升高［5］。中藥在治療哮喘方面優(yōu)勢明顯，其中木犀草素（luteolin）作為中藥復(fù)方中的一個單體已被證實有明確的抗炎作用。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于絡(luò)石藤、羊乳、透骨草、金銀花等植物中［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制哮喘小鼠氣道重建的作用［8］。本實驗擬建立大鼠幼鼠哮喘模型，應(yīng)用木犀草素通過保留灌腸途徑對哮喘模型大鼠幼鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其血清中IFN-γ及IL-4的變化。以探討木犀草素治療哮喘的機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠幼鼠80只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量（80±15）g。由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。動物毛色均勻，反應(yīng)良好，性情溫和，無脫毛、斷尾現(xiàn)象。

1.2 藥物與試劑實驗所需木犀草素（純度＞98%）購于陜西華騰科技有限公司，氫氧化鋁干粉Aluminum hydroxide（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司生產(chǎn)，批號：20120926。卵清蛋白Albumin Egg（GradeⅡCrude dried egg white），Ovalbumin.MW：44287 Da by calculation；大鼠血清IL-4、大鼠血清IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒（酶聯(lián)免疫分析法）購于哈爾濱市順成醫(yī)科經(jīng)銷部。

1.3 主要儀器402AI型超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司；JY5002型電子天平（0.01～500 g），上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS223S型電子天平（0.001～220 g），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司；KD-TS3D1型組織自動脫水機(jī)，浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；全自動酶標(biāo)儀，美國；微量移液器，德國艾本德公司；Anke TGL-16G型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 實驗方法

2.1 幼鼠哮喘模型的制備參考相關(guān)文獻(xiàn)，將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，除去空白對照組幼鼠，剩余各組幼鼠在第1、7天致敏，即腹腔注射卵清蛋白和氫氧化鋁混合液共1 mL（含100 mg氫氧化鋁和1 mg卵清蛋白）。在第15、16、17、18、19天，分別給予霧化吸入3%雞卵白蛋白（OVA）20 min，空白對照組以生理鹽水代替卵清蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。觀察幼鼠出現(xiàn)呼吸加快、焦躁不安、點頭呼吸及站立不穩(wěn)等反應(yīng)，作為判定模型動物癥狀陽性的指征。

2.2 實驗動物分組與給藥在適應(yīng)性飼養(yǎng)之后，將80只大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照組、哮喘模型組、木犀草素灌胃組（以下稱灌胃組）、木犀草素灌腸組（以下稱灌腸組），每組20只。對每只大鼠分別標(biāo)記號碼，組間平均體質(zhì)量差控制在20 g以內(nèi)，進(jìn)行藥物干預(yù)實驗。

治療組均從第1次哮喘激發(fā)開始（造模第15天）至處死前每天灌胃或灌腸給藥。灌腸組幼鼠每只每天給予木犀草素30 mg／kg灌腸1次；灌胃組幼鼠每只每天給予木犀草素30 mg／kg灌胃1次。以上各組連續(xù)給藥7 d，每組隨機(jī)處死10只，進(jìn)行實驗研究；各組剩余10只，繼續(xù)給藥7天后處死進(jìn)行實驗研究?？瞻讓φ战M不做任何干預(yù)。

灌腸具體方法：輕柔按摩幼鼠肛門促使其盡量排空結(jié)腸下段大便后，一人戴厚手套左手將幼鼠翻轉(zhuǎn)固定使腹部朝上，右手輕輕向下拉幼鼠尾巴，露出肛門。另一人用1根無菌20號大鼠灌胃針接上5 mL無菌注射器，石蠟潤滑后緩慢插入，深度約4～6 cm，慢慢推入灌腸藥物，一般在給藥時需要用手按壓肛門以防藥液滴出，必要時可用棉花包埋好的塑料小夾輕輕夾住肛門，保持肛門高位6 min，盡量避免藥物流出。

2.3 實驗標(biāo)本采集于實驗的第21天和最后1天，各組實驗動物隨機(jī)抽選10只稱重，并進(jìn)行大鼠眼眶取血，收集靜脈血；用于測定血清IFN-γ及IL-4，并開胸取出肺臟用于觀察組織病變情況。

2.4 檢測項目及方法

2.4.1 一般觀察觀察各組幼鼠的體質(zhì)量、糞便、毛發(fā)情況、飲食情況、活動度、精神狀態(tài)等，并做相關(guān)記錄。

2.4.2 血清IFN-γ及IL-4的測定給藥結(jié)束后，將各組幼鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg／kg）麻醉，進(jìn)行眼眶取血，靜置15 min，然后4℃，3 000 r／min，離心10 min，取上層血清，-20℃冰箱凍存待檢。以ELISA方法檢測各組大鼠血清中IFN-γ及IL-4的表達(dá)情況。IFN-γ、IL-4測定嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明操作（采用酶聯(lián)免疫吸附ELISA法）。

2.4.3 幼鼠肺病理組織學(xué)觀察動物麻醉完全后，開胸和開腹取肺組織和結(jié)腸，用4%多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅HE染色，鏡下觀察病理學(xué)改變。

2.5 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間采用單因素方差分析的方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。顯著性差異水平以P＜0.05或P＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)。

3 實驗結(jié)果

3.1 木犀草素對支氣管哮喘大鼠一般狀態(tài)的影響

模型組及用藥組大鼠在吸入OVA后不久即出現(xiàn)躁動不安，搔抓顏面皮毛，呼吸急促，嚴(yán)重者呼吸減慢，節(jié)律不齊，時快時慢，噴嚏或咳嗽，口鼻、四肢和尾尖輕度紫紺，豎毛，活動明顯減少或俯臥不動。隨著激發(fā)次數(shù)的增多，上述癥狀出現(xiàn)增多并加重，經(jīng)連續(xù)激發(fā)后體質(zhì)量減輕，毛發(fā)少光澤，四肢癱軟，反應(yīng)遲鈍，呼吸及幅度紊亂。繼而大鼠俯伏不動，出現(xiàn)呼吸急促，呼吸困難（明顯的腹式呼吸），部分大鼠口鼻流出黏液，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸不規(guī)則。反復(fù)激發(fā)后大鼠毛色失去光澤，精神不振和反應(yīng)遲鈍。而空白組則無此表現(xiàn)。

與哮喘模型組比較，木犀草素灌胃給藥組和灌腸給藥組癥狀均減輕，但仍有呼吸急促，呼吸困難的現(xiàn)象。灌胃給藥組和灌腸給藥組大鼠表現(xiàn)相似，沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。

3.2 血清IFN-γ及IL-4的測定

3.2.1 對支氣管哮喘大鼠幼鼠血清IL-4含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠幼鼠血清IL-4含量增加，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而木犀草素灌腸組和灌胃組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

3.2.2 對支氣管哮喘大鼠幼鼠血清IFN-γ含量的影響與空白組比較，模型組大鼠幼鼠血清IFN-γ含量降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，木犀草素灌腸組和灌胃組均可明顯升高支氣管哮喘大鼠血清IFN-γ含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-4、IFN-γ含量比較（ˉx±s，n＝10）

3.3 木犀草素灌腸對大鼠幼鼠支氣管-肺組織病理學(xué)的影響經(jīng)染色和鏡下病理學(xué)觀察（圖略）：1）空白對照組，可見大鼠肺組織支氣管內(nèi)及周圍無明顯炎性細(xì)胞浸潤，管壁完整，管壁和平滑肌厚度正常，細(xì)胞排列規(guī)整，組織黏膜未見充血水腫，肺泡間隔狹窄，肺泡腔清亮寬敞。2）模型組，可見支氣管壁、管腔內(nèi)及血管、支氣管周圍有嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，黏液腺增生，支氣管黏膜水腫、增厚、上皮脫落、微血管滲漏、管腔內(nèi)分泌物增多，基層細(xì)胞增生、平滑肌增厚，組織黏膜充血水腫，肺泡間隔變寬，肺泡腔變狹窄。3）灌腸組與灌胃組，可見肺組織嗜酸性粒細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞浸潤減少，管壁和平滑肌厚度減少，黏膜結(jié)構(gòu)較完整，周圍組織充血水腫現(xiàn)象減輕，肺泡腔變寬，肺泡間隔變窄。

4 討論

中藥復(fù)方在治療兒童哮喘方面有明顯優(yōu)勢，我科在臨床中應(yīng)用中醫(yī)經(jīng)典方劑三子養(yǎng)親湯治療哮喘取得了良好的療效。其中紫蘇的有效成分即是木犀草素。木犀草素已被證實具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗變應(yīng)性、抗病毒和細(xì)胞保護(hù)等作用［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素還通過其他機(jī)制參與免疫反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)。如抑制NF-κB介導(dǎo)的基因表達(dá)［11］。DAS M等［12］研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能顯著減輕哮喘的癥狀，減輕支氣管收縮和氣道高反應(yīng)性，降低血清中特異性IgE的水平，減少支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5，增加干擾素-γ（IFN-γ）、PDGF-BB的產(chǎn)生。該研究結(jié)果表明，木犀草素具有調(diào)節(jié)哮喘木星Th1／Th2平衡的作用。

研究表明，直腸壁是一種半透膜，其具有選擇性吸收和排泄功能。嬰幼兒腸壁較薄，具有通透性高、腸壁孔隙大、蛋白質(zhì)結(jié)合率低、可使藥物分布容積呈增大趨勢的優(yōu)點［13］。

本實驗通過木犀草素保留灌腸給藥，觀察大鼠幼鼠哮喘模型血清中IFN-γ、IL-4的含量及肺組織炎性改變。結(jié)果表明灌腸組較模型組血清中IFN-γ顯著增高，IL-4顯著降低。揭示了木犀草素治療哮喘的機(jī)制可能為調(diào)節(jié)Th1／Th2平衡，抑制Th2細(xì)胞活化。灌腸組與灌胃組血清中IFN-γ、IL-4含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示木犀草素灌腸給藥與灌胃給藥在療效上相當(dāng)。灌腸組肺組織嗜酸性粒細(xì)胞及其它炎性細(xì)胞浸潤減少，管壁和平滑肌厚度減少，組織充血水腫現(xiàn)象減輕，肺泡腔變寬，肺泡間隔變窄。說明木犀草素保留灌腸可減輕肺組織炎性浸潤。

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Retention Enama treatment with Luteolin suppresses interferon gamma and interleukin 4 Levels in asthma mice model

HONG Lijun，WEI Guangzhou，CHEN Zuren，LIU Kexin*，ZHANG Yongzheng，WANG Fang，WANG Congli
（Mudanjiang City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Mudanjiang 157000，Heilongjiang Province，China）

ObjectiveTo explore the influence of luteolin retention enema on interferon rats serum in rat asthma model of gamma（IFN-gamma）and interleukin 4（IL-4）.MethodsThe 80 male and female SD rats were divided into blank group，model group，gavage group，retention enema group，with 20 rats in each group.IFN-gamma and IL-4 content in serum were tested by method of ELISA.Rats in the lung tissue of rat asthma model change were observed under the microscope.ResultsCompared with the model group，clysis group and the oral group could significantly increase the content of serum gamma IFN-in bronchial asthma rats，and decreased the content of IL-4.Significant differences（P＜0.01）.Enema group and oral group histopathological observation of lung tissue infiltration is reduced，the smooth muscle wall thickness reduction，reduced tissue edema and congestion phenomenon.ConclusionLuteolin retention enema can reduce asthma in young rats serum IL-4 and IFN-content increased gamma.

Luteolin；asthma；IF-4；INF-γ；retention enama；mice

R285.5

A

1003-5699（2015）09-0938-04

：張瑞彬

2014-12-15）

10.13463／j.cnki.jlzyy.2015.09.022

黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題（2014-084）。

洪麗軍（1955-），女，主任醫(yī)師，主要從事兒科常見病及疑難病治療研究。

*通信作者：劉克新，電話-18204637111，電子信箱-honglijhlj112＠126.com