生豬膿包化膿隱秘桿菌的分離鑒定與防控分析

劉曉波，李 淼，岑 靜，李潤(rùn)成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128）

皮膚軟組織化膿性感染是由于細(xì)菌侵入皮膚而發(fā)生的炎癥反應(yīng)，局部可出現(xiàn)紅、腫、熱、痛和功能障礙，嚴(yán)重時(shí)細(xì)菌及毒素進(jìn)入血液循環(huán)可引起毒血癥或敗血癥,傷口感染是細(xì)菌在體內(nèi)大量繁殖的結(jié)果，膿是機(jī)體組織炎癥過(guò)程中形成的濃稠或稀薄的滲出物，其中包含變性、壞死的白細(xì)胞、細(xì)菌、壞死組織碎片和滲出的組織液。為了解豬場(chǎng)內(nèi)生豬體內(nèi)外膿包形成原因，筆者從不同規(guī)模的豬場(chǎng)、采集生豬不同部位的膿包樣本，進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定，并將測(cè)出的分離菌16SrRNA 基因與GenBank 登錄的序列進(jìn)行Blast 比對(duì)分析。 意圖對(duì)膿包形成的主要病原，進(jìn)行調(diào)查分析，為豬場(chǎng)預(yù)防膿包形成提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

巧克力瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自江門(mén)市凱林貿(mào)易有限公司，DNA 聚合酶、DNTP 購(gòu)自北京天根生物化學(xué)科技有限公司。

1.2 病料樣本的采集

從不同豬場(chǎng)， 主要以保育豬和肥豬為采樣對(duì)象，發(fā)現(xiàn)膿包首先進(jìn)行臨床觀察并就膿包形成的原因向畜主展開(kāi)調(diào)查，然后用一次性滅菌注射器無(wú)菌采取生豬體表膿包的膿汁樣品或直接將有發(fā)膿灶的組織樣品帶回試驗(yàn)室備用。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢

取采回的膿汁或帶有發(fā)膿灶的病料組織劃線接種巧克力培養(yǎng)基， 并放于37℃恒溫箱培養(yǎng)36h后，挑取菌落革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分離菌16SrRNA基因的擴(kuò)增與測(cè)序、Blast分析

參照文獻(xiàn)[1]合成細(xì)菌16SrRNA 基因的通用引物， 然后以分離的細(xì)菌為模板進(jìn)行16SrRNA PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增方法按常規(guī)進(jìn)行。 將PCR 產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序， 并將測(cè)出序列于NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行Blast 分析確定分離菌為何種細(xì)菌,最后將測(cè)出序列與GenBank 登錄的相同細(xì)菌序列用DNASTAR 生物軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，衡量測(cè)出序列與已登錄序列的同源性。

2 結(jié)果

2.1 病料采集結(jié)果

從不同豬場(chǎng)， 主要以保育豬場(chǎng)和肥豬為采樣對(duì)象，發(fā)現(xiàn)膿包首先進(jìn)行臨床觀察并就膿包形成的原因向畜主展開(kāi)調(diào)查，然后無(wú)菌采取生豬體表或體內(nèi)膿包的膿汁樣品帶回試驗(yàn)室備用。結(jié)果從3 個(gè)豬場(chǎng)共采集了7 個(gè)不同來(lái)源的膿包樣本， 其中頸部皮下膿包4個(gè)、耳朵膿包1 個(gè)、實(shí)質(zhì)臟器發(fā)膿灶樣本2 個(gè)。不同豬場(chǎng)臨床觀察及膿包形成原因調(diào)查情況如下。

2.1.1 豬場(chǎng)一：湖南省長(zhǎng)沙縣某豬場(chǎng)、豬場(chǎng)管理水平一般。保育豬健康水平較好，筆者前去調(diào)查采樣時(shí)，120 頭保育豬當(dāng)中發(fā)現(xiàn)有1 頭保育豬頸部皮下有一拳頭大小的膿包（見(jiàn)圖1）。 畜主反應(yīng)膿包形成原因可能與接種口蹄疫疫苗有關(guān)。

2.1.2 豬場(chǎng)二：湖南省長(zhǎng)沙縣某豬場(chǎng)、豬場(chǎng)管理水平較差。 保育豬健康水平不理想，保育豬轉(zhuǎn)到肥豬欄不久的架子豬，部分出現(xiàn)呼吸困難癥狀，神經(jīng)癥狀，不能站立，發(fā)病死淘率在5%～10%左右。 筆者前去調(diào)查采樣時(shí)，解剖了4 頭轉(zhuǎn)入肥豬欄不久的架子豬，發(fā)現(xiàn)有1 頭豬的肝、脾臟組織有白色發(fā)膿灶（見(jiàn)圖2、圖3）。 畜主不清楚發(fā)膿灶形成的原因。

圖2 架子豬肝臟發(fā)膿灶

圖3 架子豬脾臟發(fā)膿灶

2.1.3 豬場(chǎng)三：湖南省衡陽(yáng)市某豬場(chǎng)、豬場(chǎng)管理水平差。保育豬健康水平補(bǔ)理想，筆者前去調(diào)查采樣時(shí)，200 頭保育豬當(dāng)中發(fā)現(xiàn)有22 頭保育豬耳朵或頸部長(zhǎng)有膿包（代表性圖片見(jiàn)圖4、圖5）。 通過(guò)畜主反映，頸部皮下膿包形成可能與接種油乳劑細(xì)菌滅活疫苗有關(guān)，耳朵可能與轉(zhuǎn)群后豬群打斗有關(guān)。

圖4 保育豬耳朵膿包

圖5 保育豬頸部膿包

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果

取采回的膿汁或帶有發(fā)膿灶的病料組織劃線接種巧克力培養(yǎng)基，并放于37℃恒溫箱培養(yǎng)36 小時(shí)后，挑取菌落革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果所有分離菌，菌落形態(tài)可分為2 種。 1 號(hào)菌在平皿上生長(zhǎng)為圓形、光滑、表面凸起、灰白色、針尖狀菌落，周?chē)腥谘木?；革蘭氏染色陽(yáng)性。 2 號(hào)菌在平皿上生長(zhǎng)為圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明的菌落；革蘭氏染色為陽(yáng)性。豬場(chǎng)二、三采集樣本分離菌均為1 號(hào)菌落形態(tài)的細(xì)菌，樣本中細(xì)菌數(shù)量多而純；從豬場(chǎng)一樣本中分離的細(xì)菌主要為1 號(hào)菌落形態(tài)的細(xì)菌，同時(shí)還有少量2 號(hào)菌落形態(tài)的細(xì)菌。

2.3 分離菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析結(jié)果

將分離到的細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 并將PCR 產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，最后于NCBI 中進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，結(jié)果，1 號(hào)菌落形態(tài)的細(xì)菌為均化膿隱秘桿菌，與GenBank 登錄的化膿隱秘桿菌序列基因同源性為96%以上（見(jiàn)圖6，圖中HN1、HN2、HN3、HN4、HN5、HN7、HN8：本文測(cè)出序列 ，HF947290、JN578122、JQ975944、JQ975947：GenBank 登錄的化膿隱秘桿菌16SrRNA 基因序列）；2 號(hào)菌落形態(tài)的細(xì)菌為葡萄球菌， 與GenBank登錄的葡萄球菌序列同源性達(dá)到99.9%（見(jiàn)圖7，其中PT1： 本文測(cè)出序列，HM484984、HM484985、HM484986、NR036905：GenBank 登 錄 的 葡 萄 球 菌16SrRNA 基因序列）。

圖6 化膿隱秘桿菌與GenBank登錄序列同源性比較結(jié)果

圖7 葡萄菌與GenBank登錄序列同源性比較結(jié)果

4 討論與分析

4.1 病樣采集

本文從湖南省的幾個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)調(diào)查采樣，從幾頭保育豬的頸部膿包采集了4 個(gè)膿汁樣品，從1 頭豬腫大的耳朵采集了1 個(gè)膿包樣品，從1 頭保育豬的實(shí)質(zhì)臟器采取了2 個(gè)化膿灶樣品。結(jié)果除1 個(gè)頸部皮下濃汁樣品同時(shí)分離到少量葡萄球菌外，所有樣品均分離到純的、數(shù)量眾多的化膿隱秘桿菌。 所采樣品數(shù)量雖比較少，但膿包產(chǎn)生的部位具有多樣性， 基本上包括了生豬體內(nèi)外常見(jiàn)膿包出現(xiàn)的部位。因此，本文分離細(xì)菌的結(jié)果具有一定的代表性，說(shuō)明生豬體內(nèi)外常見(jiàn)膿包與化膿隱秘桿菌感染有一定關(guān)聯(lián)，這與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道具有一致性[2、3]，為生豬體內(nèi)外膿包的防控補(bǔ)充了參考數(shù)據(jù)。

4.2 膿包的成因

化膿隱秘桿菌化膿隱秘桿菌又名化膿放線菌或化膿棒狀桿菌， 為革蘭染色陽(yáng)性的短棒狀桿菌，普遍存在于牛、羊、豬和其他重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的黏膜上，是一種條件性致病菌[2]。該病原最早從牛的膿汁中分離得到，常見(jiàn)于牛、羊、豬的化膿性病灶，表現(xiàn)為肺炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、皮下膿腫等[3]?；撾[秘桿菌已被認(rèn)定為病原菌, 并關(guān)于人感染致病病例也常有報(bào)道[5]。

本文從膿汁分離到化膿隱秘桿菌， 分離率為100%。 從本文調(diào)查的生豬頸部皮下膿包的形成原因來(lái)看， 其與接種油佐劑疫苗存在一定的關(guān)系，但豬舍不良的衛(wèi)生條件以及較高的氣溫促進(jìn)了膿包的形成， 化膿隱秘桿菌通過(guò)注射傷口進(jìn)入生豬體內(nèi)，加上白礦物油難以吸收、易造成組織損傷、無(wú)菌性肉芽腫，二因素結(jié)合可能促進(jìn)了細(xì)菌性膿包的形成。 此外，從本文還可見(jiàn)，生豬合群時(shí)的打斗，造成生豬體表傷口也是生豬體表形成膿包的重要原因，至于本文采集到的實(shí)質(zhì)臟器發(fā)膿灶樣本可能是由于局部傷口化膿隱秘桿菌感染后，加上生豬免疫力低下，化膿隱秘桿菌在體內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的緣故。

4.3 預(yù)防工作

我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)集約化養(yǎng)殖模式日益擴(kuò)大，但部分豬場(chǎng)養(yǎng)殖理念未能跟上科學(xué)養(yǎng)豬的要求，飼養(yǎng)管理比較粗放，日常操作消毒意識(shí)不強(qiáng)。如：一些豬場(chǎng)對(duì)于診療器械的消毒管理極為忽視，針頭、注射器放在窗臺(tái)上或裸放在其他地方， 甚至同雜物一同混放，多個(gè)病豬用一個(gè)針頭等；小豬轉(zhuǎn)群后，豬場(chǎng)管理沒(méi)有考慮如何減少混群小豬的打斗程度，造成小豬體表出現(xiàn)多處傷口， 且豬舍環(huán)境差容易出現(xiàn)感染。因此，不少豬場(chǎng)的生豬?？梢?jiàn)到體表或體內(nèi)膿包的出現(xiàn)。 尤其是在氣溫較高，細(xì)菌滋生的夏季更為明顯。 膿包的形成勢(shì)必引起生豬生長(zhǎng)速度下降，飼料報(bào)酬率降低，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)不必要的損失。 所以筆者認(rèn)為，豬場(chǎng)平常做好各項(xiàng)管理工作，減少和消除各種誘因，對(duì)預(yù)防本病有重要意義，特別是加強(qiáng)豬場(chǎng)內(nèi)生豬傷口的預(yù)防、傷口的有效消毒以及改善豬舍內(nèi)的環(huán)境，降低環(huán)境中的病原含量對(duì)生豬疾病的防控具有非常重要的意義。

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