親水交互作用—反相二維液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜同時測定乳制品中20種抗生素殘留

王煉 楊碧霞 張新申 鄭洪國 冉良驥

摘 要 建立了親水作用-反相二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乳制品中β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、氨基糖苷、酰胺醇、喹諾酮和磺胺7類20種抗生素殘留的方法。樣品與C18和CN填料混合，進(jìn)行基質(zhì)固相分散萃取，以乙腈和水洗脫，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘渣流動相溶解后分析。對樣品前處理條件、色譜流動相、質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。各分析物回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9945～0.9998；以定量離子信噪比為3和10時所對應(yīng)的樣品中分析物濃度計算檢出限和定量限，分別為0.10～2.40 μg/kg和0.33～7.92 μg/kg。奶粉和牛奶中添加水平25 μg/kg的加標(biāo)回收率分別為72.5%～97.2%和70.1%～96.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.8%和3.7%～9.9%。本方法應(yīng)用于實際樣品測定，結(jié)果滿意。

關(guān)鍵詞 親水交互作用色譜；二維液相色譜；抗生素；基質(zhì)固相分散

1 引 言

抗生素具有抑制或殺滅細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體、衣原體等致病微生物的作用。廣義的抗生素常常包括： β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類（Aminoglycosides， AGs）、酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類和多肽類【1，2】。作為常用的獸藥，近年來抗生素常被多類混合添加在動物飼料中，以掩蓋單個藥物殘留量超限的現(xiàn)象。因此，為保障食品安全，建立同時檢測多類抗生素的方法意義重大。

AGs極性最強(qiáng)，采用反相液相色譜（RPLC）分離，幾乎沒有保留。在流動相中加入離子對試劑，通過中和電荷降低其極性后可進(jìn)行RPLC分離，但會極大增加平衡時間，且不利于與質(zhì)譜聯(lián)機(jī)【3，4】。親水交互作用色譜（HILIC）使用RPLC的流動相，可分離強(qiáng)極性有機(jī)物，能解決了AGs的分離問題【5，6】，且易與質(zhì)譜聯(lián)用【7】。由于AGs和其它類抗生素極性差異大，抗生素多殘留分析的難點在AGs和其它類同時提取和檢測，現(xiàn)有方法通常只涉及4～5類抗生素【8～12】，且AGs和其它類抗生素同時檢測的方法鮮有報道。

本研究利用雙三元高效液相色譜儀，外接1個可變流速泵，7條流路組成親水交互作用與反相色譜二維液相色譜系統(tǒng)（HILIC-RPLC），經(jīng)三段分離，串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem mass spectrometry， MS/MS）檢測，建立了乳制品中的7類20種抗生素同時分離、定性定量分析的方法。對HILIC-RPLC，前人也做過一些研究，但與本方法在目的和原理上有所差異。Jandera等討論了HILIC與RP的正交性，得出二者不能完全正交的結(jié)論【14】；Wang等采用4個流路兩段分離模式對12種親水和13種親脂的混合物進(jìn)行了檢測，但分析物不涉及抗生素，也未對HILIC和RP都有所保留的情況進(jìn)行探討【15】；Liang等則采用了離線HILIC-RPLC的方式【16】。本研究采用了HILIC-RPLC-MS/MS三段檢測模式，并提出了混合基質(zhì)固相分散（Mixed matrix solid phase dispersion， MMSPD）的樣品前處理技術(shù)，較好地解決了7類抗生素同時提取并檢測的難點，方法簡便、快速、靈敏度高，滿足國際社會食品法規(guī)的最大允許殘留量要求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Ultimate3000高效液相色譜儀（美國ThermoFisher公司），帶DGP-3600SD泵，帶十通閥和六通閥各1個；AXP Auxiliary Pump（美國ThermoFisher公司）；3200Qtrap質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BCHI 公司）；Vortex Genius3型渦旋混勻器（德國IKA公司）；2034型真空泵（美國Welch公司）；VisiprepTM-DL固相萃取系統(tǒng)（美國Sepulco公司）6 mL SPE空管及配套熔融玻璃隔板（美國Agilent公司）；Chromatorex C18鍵合硅膠填料（40～75 μm，日本富士公司）；Cleanert 氰基（CN），硅膠（Silica），強(qiáng)陽離子（SCX）填料（平均粒度45 μm，美國Agela Technologies）。

頭孢噻呋、氨芐青霉素、鄰氯青霉素、大觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1a、阿米卡星、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、替米考星、交沙霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素、氯霉素（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；頭孢氨芐（Fluka公司）；磺胺甲氧嗪、磺胺氯噠嗪（Sigma公司）；異帕米星（上海士鋒生物科技有限公司）。甲醇和乙腈（HPLC級），乙酸銨和甲酸（色譜純）均購自Dikma公司；EDTA二鈉、草酸為分析純，實驗用水為超純水。1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液均用甲醇配制，

20 ℃條件下，頭孢氨芐和氨芐青霉素保存14天，其它抗生素保存3個月。

2.2 樣品前處理

稱取0.50 g奶粉或牛奶樣品于研缽中，加入C18和CN填料各0.50 g，加入EDTA二鈉1.00 g，用研缽充分碾磨至均勻，裝入6 mL SPE空管（底部塞入熔融玻璃隔板）中，另用熔融玻璃隔板于上部將其壓至無明顯空隙。將裝好的SPE管置于固相萃取裝置上，用2.5 mL乙腈、2.5 mL水依次清洗研缽兩次后，分步加入到SPE管中，減壓洗脫（流速控制在3 mL/min以內(nèi)），收集洗脫液，于（40±1）℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入20 mmol/L乙酸銨-乙腈-甲酸（5∶5∶1）至1.0 mL，渦旋混勻1.0 min后，過0.2 μm水系濾膜，供測定。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

2.3.1 液相色譜條件 左泵流動相：A為0.2%甲酸，B為乙腈，C為20 mmol/L草酸；右泵流動相：A為20 mmol/L乙酸銨（含0.4%甲酸），B為乙腈（含0.4%甲酸），C為水。AXP泵流動相：水；流速：0.50 mL/min （0.70～1.30 min）、0.20 mL/min（6.50～11.00 min）。色譜柱1：Inspire HILIC， （100 mm ×2.1 mm， 3 μm，Dikma公司）；色譜柱2： Spursil C18-EP（100 mm×2.1 mm， 3 μm，Dikma公司）； 捕獲柱（T柱）：Oasis HLB （20 mm×2.1 mm， 25 μm， Waters公司）。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣體積：10 μL。洗針液：乙腈-水（90∶10， V/V）。閥切換和流動相梯度條件見表1和表2。endprint

2.3.2 質(zhì)譜條件 氣簾氣流量： 172.38 Pa； 碰撞氣流量： 34.48 Pa； 離子源電壓： 3500 V； 接口溫度： 550 ℃； 霧化器流量： 344.75 Pa； 輔助加熱氣流量： 344.75 Pa；檢測器電壓： 2000 V； 電離模式： ESI+。化合物的母離子、子離子及離子檢測參數(shù)見表3。

在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，空白奶粉樣品添加20種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（各分析物濃度均為20 ng/mL）的總離子流圖見圖1。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

基質(zhì)固相分散（Matrix solid phase dispersion， MSPD）萃取技術(shù)使用C8和C18鍵合硅膠，提取親脂性化合物，簡便快速、提取效率高，常用于動物源性食品中獸藥多殘留檢測的樣品前處理中【17】。本方法針對極性強(qiáng)的AGs提出的混合MSPD技術(shù)，利用氰基（CN）、C18鍵合硅膠與EDTA二鈉共同組成提取材料，結(jié)果表明， 對極性差異大的7類抗生素均有較高的提取效率，能較好的去除樣品基質(zhì)。

實驗考察了平均粒度45 μm的氰基（CN）、硅膠（Silica）、強(qiáng)陽離子（SCX）、C18填料和EDTA二鈉等提取材料，用奶粉和牛奶的加標(biāo)回收率考察提取效率。結(jié)果表明，如混合提取材料中不含EDTA二鈉，強(qiáng)力霉素和土霉素?zé)o回收率，這可能與四環(huán)素類藥物結(jié)構(gòu)中兩個酮基易與金屬離子形成螯合物造成損失有關(guān)。采用SCX或Silica與C18和EDTA二鈉組成提取材料時，采用水或乙腈洗脫液，7種AGs均不能被有效洗脫，采用氨化乙腈為洗脫液，可以部分洗脫AGs，僅在使用CN時，奶粉和牛奶中的回收率分別為81.3%（鏈霉素）～98.3%（環(huán)丙沙星），78.4%（鏈霉素）～97.0%（氯霉素）。這可能與CN填料為硅膠鍵合氰丙基，同時具備正相和反相保留機(jī)制，非極性溶劑溶解待測物并用極性溶劑洗脫時，表現(xiàn)為正相作用，對極性化合物有較好的保留有關(guān)，而Silica和SCX對極性化合物保留較強(qiáng)。

3.2 HILIC固定相的選擇

已知的HILIC固定相有未衍生化的硅膠【18，19】或雜化顆?！?0，21】、酰胺【22，23】、氨基【24】、二醇【25】、兩性離子【26】等。適合AGs分離的固定相有3種：雜化顆粒、未衍生化的硅膠和兩性離子。雜化顆粒與未衍生化的硅膠兩種固定相保留機(jī)理相似，均使用有機(jī)相與水相的混合流動相，促使硅醇基團(tuán)產(chǎn)生，形成帶負(fù)電的酸性表面，從而有利于陽離子物質(zhì)的保留，常用來分析堿性極性物質(zhì)【27】；但硅膠基質(zhì)顆粒（未衍生化）在中高pH下容易溶解，因此適用范圍小于雜化顆粒。兩性離子固定相包含摩爾比為1∶1的強(qiáng)堿（季銨）和強(qiáng)酸（磺酸）基團(tuán)，有利用兩性離子固定相對AGs進(jìn)行分離的報道【28，29】。

本實驗比較了未衍生化硅膠的Atlantis HILIC-silica（100 mm×2.1 mm， 3 μm， Waters公司）、兩性離子的ZIC-HILIC（50 mm×2.1 mm， 3.5μm， Merck公司）和雜化顆粒硅膠的Inspire HILIC（100 mm×2.1 mm， 3 μm， Dikma公司）的色譜柱，使用Inspire HILIC時， 7種AGs分離良好。ZIC-HILIC柱分析效果不佳的原因，可能與它同時提供帶正電和負(fù)電荷的官能團(tuán)，使最終總凈電荷接近為零，流動相pH變化對分離影響小有關(guān)，在分析帶正電的堿性極性化合物時，ZIC-HILIC柱的分離效果不一定優(yōu)于雜化顆粒。

3.3 三段檢測模式的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，HILIC與 RP的分離模式接近于正交【30】。但在實際分離中，所選的20種抗生素中，5種完全不被HILIC柱保留，7種AGs和大環(huán)內(nèi)脂類替米考星在C18柱上幾乎不保留，而7種物質(zhì)在兩種色譜柱上均有所保留，而流動相組成和AXP泵流速的變化對這7種物質(zhì)的影響也不相同。

實驗中將20種抗生素分為3組（見表4），第一組為5種在HILIC柱上完全不保留的物質(zhì)，第二組為7種在HILIC和C18上均有保留的物質(zhì)，第三組為C18柱不保留的7種AGs和大環(huán)內(nèi)脂類的替米考星，分階段檢測。如圖2，狀態(tài)Ⅰ，20種待測物進(jìn)入HILIC柱后，第二和第三組物質(zhì)在HILIC上保留；第一組物質(zhì)在死時間通過HILIC柱，AXP泵在0.70～1.30 min，引入0.5 mL/min的水用于稀釋高比例有機(jī)流動相，第一組物質(zhì)被T柱捕獲。狀態(tài)Ⅱ（1.30～6.50 min），左泵流動相反向?qū)柱中待測物洗脫至C18柱并分離后，到達(dá)檢測器。6.50～11.00 min（狀態(tài)Ⅰ）和11.01～14.00 min（狀態(tài)Ⅱ），同樣方法分離和檢測第二組物質(zhì)，AXP泵流速為0.20 mL/min。14.00～20.00 min（狀態(tài)Ⅲ），右泵流動相將HILIC上強(qiáng)保留的第三組物質(zhì)洗脫至質(zhì)譜檢測器分析。

3.4 流動相條件優(yōu)化

3.4.1 左泵流動相

對第一組物質(zhì)，使用乙腈和0.2%甲酸水溶液流動相，分離良好且質(zhì)譜響應(yīng)度高。第二組中四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素和土霉素，特有的兩個酮基結(jié)構(gòu)使之易與硅羥基作用，分離時出現(xiàn)明顯拖尾峰。研究表明，流動相中加入草酸【31】、琥珀酸【32】、檸檬酸【33】 等螯合劑可改善分離。本實驗中，流動相中加入草酸，結(jié)果表明，強(qiáng)力霉素和土霉素峰形得到極大改善；但草酸濃度太高會對其它物質(zhì)峰形和分離帶來很大影響。實驗采用了11.01～11.20 min， 0.2%甲酸-乙腈（5∶95， V/V）反向沖洗T柱，防止峰展寬；11.21～12.70 min，乙腈-20 mmol/L草酸（5∶95， V/V）保證了足夠的螯合劑，防止了強(qiáng)力霉素和土霉素的拖尾；12.71～14.00 min，0.2%甲酸-乙腈梯度變化，使第二組7種物質(zhì)峰形良好。endprint

3.4.2 右泵流動相

實驗表明，在將第一組物質(zhì)（0～1.30 min）和第二組物質(zhì)（6.50～11.00 min）洗脫至T柱階段，需分別使用高比例的有機(jī)相（95%和 90%），才能將兩組物質(zhì)有效洗脫至T柱，并確保第三組物質(zhì)不被沖出HILIC柱。這可能與兩組物質(zhì)極性較弱以及HILIC柱保留強(qiáng)極性物質(zhì)時，乙腈是弱洗脫溶劑有關(guān)。

3.4.3 AXP泵條件 AXP泵開啟時間及流速在一定程度上影響分離，系統(tǒng)死時間為0.70 min，AXP泵開啟過早或流速過大，產(chǎn)生的反壓會通過三通影響到HILIC柱的分離，使第一組物質(zhì)無法順利通過三通進(jìn)入T柱。比較4種流速（0， 0.25， 0.50和0.75 mL/min）的實驗表明，AXP泵流速死時間（0.70min）后開啟，保持0.50 mL/min流速時，綜合效果最佳。

采用同樣方法優(yōu)化AXP泵在第二組物質(zhì)分離時的條件，結(jié)果表明，AXP泵開啟6.50～11.00 min，流速：0.20 mL/min，第二組物質(zhì)分離良好。

在優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件下，8種代表性的抗生素多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖3所示。

3.5 方法學(xué)評價

對空白奶粉分別添加1.0 mL待測物濃度分別為0.2， 0.5， 2.0， 5.0， 20和100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理后，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下測定，對各待測物濃度和定量離子峰面積進(jìn)行線性回歸。根據(jù)定量離子信噪比（S/N）分別為3和10時對應(yīng)的樣品中待測物濃度，得到檢出限和定量限（表4）。

在奶粉和牛奶中添加0.5， 1.0， 1.5倍最大殘留限量（MRL）的各抗生素（以MRL值最小的頭孢族抗生素50 μg/kg為基準(zhǔn)），即25， 50和75 μg/kg3個水平，平行測定6份。

計算奶粉和牛奶中平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果：25 μg/kg水平，回收率分別為72.5%（強(qiáng)力霉素）～97.2%（環(huán)丙沙星）和70.1%（強(qiáng)力霉素）～96.8%（環(huán)丙沙星），RSD分別為4.2%（替米考星）～8.8%（四環(huán)素）和3.7%（替米考星）～9.9%（四環(huán)素）；50 μg/kg水平，回收率分別為77.0%（強(qiáng)力霉素）～102.1%（環(huán)丙沙星）和76.4%（四環(huán)素）～98.9%（環(huán)丙沙星），RSD分別為2.8%（卡那霉素）～6.9%（四環(huán)素）和4.0%（氯霉素）～7.8%（四環(huán)素）； 75 μg/kg水平，回收率分別為82.4%（四環(huán)素）～104.7%（恩諾沙星）和79.0%（四環(huán)素）～105.8%（環(huán)丙沙星），RSD分別為3.6%

3.6 實際樣品的分析

對市售的5份奶粉、5份牛奶、5份原奶進(jìn)行檢測，在1份原奶中檢出氨芐青霉素，含量37.6 μg/kg，低于歐盟規(guī)定的MRL（50 μg/kg），陽性樣品的總離子流圖和二級質(zhì)譜圖見圖4。

References

1 Kennedy D G， McCracken R J， Cannavan A， Hewitt S A. J. Chromatogr. A.， 1998， 812（1-2）： 77-98

2 Gentili A， Perret D， Marchese S. Trends Anal. Chem.， 2005， 24（7）： 704-733

3 van Holthoon F L， Essers M L， Mulder P J， Stead S L， Caldow M， Ashwin H M， Sharman M. Anal. Chim. Acta， 2009， 637（1-2）： 135-143

4 GONG Qiang， DING Li， ZHU Shao-Hua， JIAO Yan-Na， CHENG Jing， FU Shan-Liang， WANG Li-Bing. Chinese J. Chromatography， 2012， 30（11）： 1143-1147

龔 強(qiáng)， 丁 利， 朱紹華， 焦艷娜， 成 婧， 付善良， 王利兵. 色譜， 2012， 30（11）： 1143-1147

5 Gremilogianni A M， Megoulas N C， Koupparis M A. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（1-2）： 6646-6651

6 Kawano S. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2009， 23（6）： 907-914

7 Kahsay G， Song H， Schepdael A V， Cabooter D， Adams E. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2014， 87（1-2）： 142-154

8 Aguilera-Luiz M M， Vidal J L M， Romero-González R， Frenich A G. J. Chromatogr. A， 2008 ， 1205（1-2）： 10-16

9 Carretero V， Blasco C， Picó Y. J. Chromatogr. A， 2008， 1209（1-2）： 162-173

10 Chico J， Rúbies A， Centrich F， Prat M D， Granados M. J. Chromatogr. A， 2008， 1213（2）： 189-199

11 Granelli K， Elgerud C， Lundstrm ， Ohlsson A， Sjberg P. Anal. Chim. Acta， 2009， 637（1-2）： 87-91endprint

12 Granelli K， Branzell C. Anal. Chim. Acta， 2007， 586（1-2）： 289-295

13 GU Xin， WU Jian-Ping， ZHANG Xing， LI Dan-Ni， YAN Feng， ZHOU Yue-Rong. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（12）： 1759-1766

顧 欣， 吳劍平， 張 鑫， 李丹妮， 嚴(yán) 鳳， 周悅榕. 分析化學(xué)， 2014， 42（12）： 1759-1766

14 Jandera P， Hájek T， Stakov M， Vyuchalová K， Cesla P. J. Chromatogr. A， 2012， 1268（1-2）： 91-101

15 Wang Y， Lehmann R， Lu X， Zhao X J， Xu G W. J. Chromatogr. A， 2008， 1204（1-2）： 28-34

16 Liang Z， Li K Y， Wang X L， Ke Y X， Jin Y， Liang X M. J. Chromatogr. A， 2012， 1224（1-2）： 61-69

17 WANG Lian， LI Yuan-Qian， WANG Hai-Bo， GUAN Yan-Li. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（2）： 203-207

王 煉， 黎源倩， 王海波， 官艷麗. 分析化學(xué)， 2011， 39（2）： 203-207

18 Grumbach E S， Diehl D M， Neue U D. J. Sep. Sci.， 2008， 31（9）： 1511-1518

19 Fountain K J， Xu J， Diehl D M， Morrison D. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 740-751

20 Novakova L， Kaufmannova I， Janska R. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 765-772

21 Chauve B， Guillarme D， Cleon P， Veuthey J. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 752-764

22 Liu M， Chen E X， Ji R， Semin D. J. Chromatogr. A， 2008， 1188（1-2）： 255-263

23 Nguyen H P， Yang S H， Wigginton J G， Simpkins J W， Schug K A. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 793-802

24 Jandera P， Hajek T， Skerikova V， Souhup J. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 841-852

25 Hemstrom P， Irgum K. J. Sep. Sci.， 2006， 29（12）： 1784-1821

26 Goucher E， Kicman A， Wolff K， Smith N， Jickells S. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 955-965

27 Dejaegher B， Heyden Y V. J. Sep. Sci.， 2010， 33（6-7）： 698-715

28 Buszewski B， Sylwia N. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（1）： 231-247

29 Kumar P， Rubies A， Companyó R， Centrich F. J. Sep. Sci.， 2011， 35（4）： 498-504

30 Liu Y， Xue X， Guo Z， Xu Q， Zhang F， Liang X. J. Chromatogr. A， 2008， 1208（1）： 133-140

31 Nakazawa H， Ino S， Kato K， Watanabe T， Ito Y， Oka H. J. Chromatogr. B， 1999， 732（2）： 55-64

32 Cristofani E， Antonini C， Tovo G， Fioroni L， Piersanti A， Galarini R. Anal. Chim. Acta， 2009， 637（1-2）： 40-46

33 Zurhelle G， Müller-Seitz E， Petz M. J. Chromatogr. B， 2000， 739（1）： 191-203endprint