芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖影響及機(jī)制研究

張海芳，衛(wèi)星，陳海華，張佳，石婷娟，王學(xué)玲

(1.運(yùn)城市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，山西 運(yùn)城 044000；2.山西省汾陽醫(yī)院 消化內(nèi)科，山西 汾陽 032200)

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芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖影響及機(jī)制研究

張海芳1Δ，衛(wèi)星1，陳海華1，張佳1，石婷娟1，王學(xué)玲2

(1.運(yùn)城市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，山西 運(yùn)城 044000；2.山西省汾陽醫(yī)院 消化內(nèi)科，山西 汾陽 032200)

目的 探討芬太尼對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖影響及機(jī)制研究。方法 以0(對(duì)照組)、0.5、5、50 nmol/L 芬太尼作用胃癌細(xì)胞SGC-7901一定時(shí)間，MTT法檢測(cè)芬太尼對(duì)SGC-7901細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)芬太尼對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cyclinD1，Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，0.5，5，50 nmol/L芬太尼可顯著抑制細(xì)胞的活力，在48 h抑制程度最高。0.5，5，50 nmol/L芬太尼使細(xì)胞周期阻滯在G1期，與對(duì)照組相比，隨著給藥濃度的增加，芬太尼能顯著抑制cyclinD1，Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 芬太尼可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖。

芬太尼；胃癌細(xì)胞SGC-7901；增殖；NF-κB信號(hào)通路

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居各種癌癥前列。并且與大多數(shù)癌癥一樣，預(yù)防和治療效果都不佳。像大多數(shù)癌癥一樣，胃癌發(fā)病機(jī)制也較復(fù)雜，并受各種細(xì)胞信號(hào)通路影響。其中核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路與胃癌腫瘤的生長(zhǎng)增殖密切相關(guān)[1]。細(xì)胞周期蛋白CyclinD1，CyclinA和凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2是NF-κB信號(hào)通路的下游分子，NF-κB通路激活后，CyclinD1，CyclinA及Bcl-2會(huì)持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，生長(zhǎng)[2-4]。

在包括胃癌等癌癥確診時(shí)，有50%以上患者都有疼痛主訴[5]。芬太尼是阿片類鎮(zhèn)痛藥物，對(duì)解除患者疼痛具有良好效果[6-10]。芬太尼對(duì)于胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用的具體分子生物學(xué)機(jī)制還未知。有文獻(xiàn)報(bào)道，芬太尼可通過下調(diào)NF-κB通路，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，胃癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞增殖。推測(cè)芬太尼也可通過NF-κB途徑來抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖，所以在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)將闡述芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞SGC-7901購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，目錄號(hào)：TCHu46,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。

1.1.2 儀器：FACSCanto流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；CO2培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱購自美國Themo 公司；雙垂直電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀購自北京六一儀器廠，2000TM凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，Elx800酶標(biāo)儀購自美國BIOTEK公司。

1.1.3 試劑：兔抗Bax，Bcl-2，p21，CyclinD1，IκBα，p-IκBα單克隆抗體購自美國Epitmics公司；兔抗NF-κB p65，pp65購自Santa Cruz公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，BCA試劑盒購，小鼠抗GADPH單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Gibco公司，胰酶購自美國Hyclone公司。枸櫞酸芬太尼注射液購于江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，其主要有效成份為芬太尼。

1.2 方法

1.2.1 MTT法:用0.25%胰酶將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，消化，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104/mL，100 μL接種于96孔板，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，芬太尼(終濃度為0.5，5，50 nmol/L)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h，加MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，上清液去掉，并加入150 μL DMSO，振蕩搖勻后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測(cè)：用0.25%胰酶將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，消化，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為8×103/mL，1 mL接種于6孔板，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，芬太尼(終濃度為0.5，5，50 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，將細(xì)胞固定于70%預(yù)冷的乙醇中，16 h，離心，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，后加入3 mL碘化丙啶染色液，于37 ℃孵育30 min，并于當(dāng)日進(jìn)行流式檢測(cè)。用FACSort Cell Quest軟件(美國BD公司)進(jìn)行DNA分析。

1.2.3 Western blot：用0.25%胰酶將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞SGC-7901，消化，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為8×103/mL，1 mL接種于6孔板，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，芬太尼(終濃度為0.5，5，50 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。加入預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，冰浴30 min，每隔10 min震蕩10 s，離心15 min，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白變性，并上樣，跑SDS凝膠電泳1.5～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜40～60 min，以5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，加入一抗(Bax，Bcl-2，p21，CyclinD1，NF-κB p65，pp65，IκBα，p-IκBα，稀釋比例為1:100)4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗3次，加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)，稀釋比例為1:500)，室溫孵育1.5 h，后TBST漂洗3次，并將ECL發(fā)光液滴加于膜上，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光，并用“Quantity one”軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 芬太尼對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，0.5，5，50 nmol/L芬太尼能顯著的抑制SGC-7901細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；并且同一劑量濃度隨著給藥時(shí)間的增加，芬太尼對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制強(qiáng)度也逐漸提高，在48、72 h抑制強(qiáng)度一致。見表1。

組別劑量(nmol/L)抑制率(%)24h48h72h對(duì)照組00.12±0.023.06±0.383.17±0.55芬太尼0.513.54±0.23*21.53±3.29*21.37±2.27*519.92±2.15*33.22±4.10*33.91±4.13*5030.78±3.38*45.34±5.63*45.26±5.34*F122.24065.39076.520P0.0000.0000.000

與對(duì)照組*P<0.05相比，compared with control group

2.2 芬太尼對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，0.5，5，50 nmol/L芬太尼能使G1期細(xì)胞數(shù)目顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；0.5，5，50 nmol/L芬太尼能使G2期的細(xì)胞明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。從而說明芬太尼能阻滯SGC-7901細(xì)胞周期在G1期。見表2。

表2 芬太尼對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞周期影響Tab.2 Effect of fentanyl on cell cycle of gastric cancer SGC-7901 ±s，n=3)

*P<0.05與對(duì)照組相比，compared with control group

2.3 芬太尼對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞cyclinD1，Bcl-2表達(dá)量的影響 與對(duì)照組相比，隨著給藥濃度的增加，芬太尼能顯著抑制cyclinD1，Bcl-2的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 芬太尼對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞cyclinD1，Bcl-2表達(dá)量的影響*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比 Fig.1 Effect of expression of cyclinD1 and Bcl-2 of SGC-7901 cell by Fentanyl*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

3 討論

腫瘤的增殖活性決定了它的惡性程度，增殖程度越高，腫瘤組織生長(zhǎng)越快，越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度越高。因此，一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可遏制腫瘤組織生長(zhǎng)過快。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在48 h，芬太尼可顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖，并呈劑量依賴性，與韋寧仙等[4]等的觀點(diǎn)一致。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB參與了腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡[9]。NF-κB在大多數(shù)腫瘤組織中以活化形式存在，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10]。NF-κB自身蛋白以及NF-κB所調(diào)節(jié)的一些蛋白與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡皆有密切關(guān)系[11]。在胃癌細(xì)胞中NF-κB同樣具有重要作用，在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中NF-κB過表達(dá)，與患者的預(yù)后有密切關(guān)系[12]。通過抑制NF-κB的活化，可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖[5, 13]。

胃癌細(xì)胞的發(fā)生常伴隨著細(xì)胞周期蛋白過度活化，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞不可控制增殖。CyclinD1是常見的細(xì)胞周期蛋白，是NF-κB信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)分子，與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[7]。Cyclin D1與胃癌患者臨床分期，腫瘤分化，侵襲，DNA倍體情況，細(xì)胞S期分?jǐn)?shù)密切相關(guān)[14]。干擾Cyclin D1表達(dá)能使肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期阻滯在G1期[15]。孫輝平等[16]也證實(shí)一定劑量的瑞芬太尼能使肝癌細(xì)胞HepG2阻滯在G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與胃癌細(xì)胞SGC-7901對(duì)照組相比，芬太尼作用后，cyclin D1表達(dá)減弱，細(xì)胞周期阻滯在G1期。在細(xì)胞凋亡的過程中，Bcl-2家族蛋白在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，可以通過與促凋亡蛋白成員Bax形成異源二聚體作用于線粒體外膜，以阻止線粒體釋放Caspase來影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2在胃癌患者中過表達(dá)，與胃癌的發(fā)展發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系[17]。Bcl-2 siRNA 可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)通過芬太尼作用胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，芬太尼能顯著下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，并呈劑量依賴性。

綜上所述，芬太尼可通過抑制Bcl-2和cyclinD1的表達(dá)量，阻礙細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，進(jìn)而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖。

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(編校：譚玲)

Study of mechnism and effect of fentanyl on proliferation in gastric cancer cell SGC-7901

ZHANG Hai-fang1Δ, WEI Xing1, CHEN Hai-hua1, ZHANG Jia1, SHI Ting-juan1, WANG Xue-ling2

(1.Department of Gastroenterology, Yuncheng Central Hospital, Yuncheng 044000, China; 2.Department of Gastroenterology, Fenyang hospital of Shanxi Province, Fenyang 032200, China)

ObjectiveTo explore mechnism and effect of fentanyl on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cell.MethodsGastric cancer SGC-7901 cell was cultured with fentanyl of 0 (negative control), 0.5, 5 and 50 nmol/L, MTT method was used to detect the effect of fentanyl on SGC-7901 viability.The effect of fentanyl on SGC-7901 cell cycle was measured by flow cytometry.The level of cell related protein,cell cycle protein cyclin D1, Bcl-2.ResultsCompared with control group, fentanyl (0.5, 5, 50 nmol/L) could inhibit SGC-7901 cell viability, and the inhibitory rate was highest at 48 h.0.5, 5, 50 nmol/L fentanyl made cell cycle arrested in G1 phase.Compared with control group, fentanyl can significantly inhibit cyclinD1 and Bcl-2 expression with drug concentration increasing(P<0.05).ConclusionThese results suggeste fentanyl inhibit proliferation of gastric cancer SGC-7901 cell.

fentanyl; gastric cancer cell SGC-7901; proliferation; NF-κB signal pathway

中國肝炎防治基金會(huì)天晴肝病研究基金 (TQGB20120013)

張海芳，通訊作者，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：消化道早癌的診斷及治療，E-mail：zhanghaifang8389@163.com。

R735.2

A

1005-1678(2015)09-0038-03