鹿茸蛋白2種不同提取方法的比較研究

李超華，王毅，何忠梅，孫婭楠

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100700)

?

鹿茸蛋白2種不同提取方法的比較研究

李超華1,2，王毅2，何忠梅1Δ?，孫婭楠2Δ?

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100700)

目的 探討從鹿茸中獲得促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)蛋白的最佳提取方法。方法 將新鮮鹿茸分別采用勻漿法和超微粉碎法獲取鹿茸蛋白混合物(velvet antler proteins, VAPs)；用Bradford法及SDS-PAGE檢測(cè)并比較蛋白含量及蛋白組分差別；用掃描電鏡觀察不同提取方法超微結(jié)構(gòu)不同。建立1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)MPP+誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y損傷模型，用該模型觀察不同提取方法所得蛋白對(duì)損傷恢復(fù)的影響。結(jié)果 超微粉碎法提取的鹿茸蛋白得率更高，得到的蛋白質(zhì)條帶更多，圖譜清晰；電鏡結(jié)果表明超微粉碎法得到的鹿茸蛋白干粉均無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且顆粒較細(xì)；活性檢測(cè)中，勻漿法提取的鹿茸蛋白從125 μg/mL 濃度開(kāi)始可顯著提高1mM MPP+作用下 SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖率，而超微粉碎法提取的鹿茸蛋白的最低有效濃度為62.5 μg/mL，促增殖率可達(dá)到25.45%。結(jié)論 超微粉碎法既能大量提取鹿茸蛋白又能最大限度保證蛋白促細(xì)胞增殖活性，是較為理想的蛋白提取方式。

鹿茸；蛋白提取；SH-SY5Y

鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的密生茸毛的未骨化的幼角，是我國(guó)非常珍貴的傳統(tǒng)中藥材。研究表明，鹿茸中的化學(xué)成份較復(fù)雜，其主要的藥理活性成分有無(wú)機(jī)元素、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸、磷脂等，其中蛋白類成份高達(dá)55.26%[1]。

近年來(lái)一系列相關(guān)研究[2-5]發(fā)現(xiàn)：鹿茸蛋白具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、改善性功能、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗缺氧、治療神經(jīng)損傷等多種生物學(xué)效應(yīng)，有廣泛的應(yīng)用前景和巨大的藥用價(jià)值。因此如何得到大量蛋白質(zhì)并保證其蛋白活性是闡釋其藥理作用的前提。

本研究對(duì)2種不同提取方法即勻漿法和超微粉碎法對(duì)鹿茸蛋白提取含量及產(chǎn)率的影響進(jìn)行了比較分析，并探討了2種方法提取的蛋白促M(fèi)PP+損傷后SH-SY5Y細(xì)胞增殖的活性，為后續(xù)藥效學(xué)研究篩選出鹿茸蛋白提取的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑：SH-SY5Y細(xì)胞株由西苑醫(yī)院贈(zèng)送；Bradford蛋白定量試劑盒為天根生化公司產(chǎn)品(Lot No. PA102)；考馬斯亮藍(lán)(Amresco公司)；EDTA、TEMED(Sigma公司)；過(guò)硫酸銨、冰乙酸、甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Amresco公司；胎牛血清FBS(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(Sigma公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：膠體磨(Lot No. KJM-50S，北京錕杰玉誠(chéng)機(jī)械有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI瑞士)；高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-H，上海安亭科學(xué)儀器廠)；垂直電泳儀(Bio-Rad美國(guó))；G-Box凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)基因公司)；掃描電子顯微鏡(S-3400N日本日立公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸蛋白提取方法

① 勻漿法提取鹿茸蛋白：將切成小塊狀的鮮鹿茸先用中藥粉碎機(jī)粉碎成碎末，然后將粉碎的鹿茸在自來(lái)水下浸泡沖洗至無(wú)血色。取200 g鹿茸肉末浸泡于預(yù)冷至4 ℃的2 000 mL純水溶液中，膠體磨勻漿8～10 h，每2小時(shí)旋轉(zhuǎn)膠體磨一次減小粒徑，以充分破碎細(xì)胞。勻漿結(jié)束后加入一定量的冰醋酸保持pH4于4 ℃過(guò)夜，5 000 r/min離心10 min分離上層清夜，收集上層清液于1 Kd透析袋用自來(lái)水透析脫鹽，每4 h更換一次透析液，直至經(jīng)pH試紙測(cè)量外部透析液為中性后，結(jié)束透析。透析袋內(nèi)所得液體即為鹿茸蛋白溶液。將鹿茸蛋白溶液于55 ℃以下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200 mL以內(nèi)，5 000 r/min離心10 min除掉沉淀之后，冷凍干燥，稱量干燥后粉末重量計(jì)算產(chǎn)率，4 ℃保存。

② 超微粉碎法提取鹿茸蛋白：鮮鹿茸先用粉碎機(jī)破碎成小塊，然后液氮速凍后置入超微粉碎機(jī)中粉碎至肉糜狀，粒徑75 μm左右，200目以上。稱取200 g鹿茸糜狀物按照1:10(W/V)的比例加入水及適量的冰醋酸保持pH 4置于4 ℃過(guò)夜，3 000 r/min離心10 min分離上層清夜，將上層清液于1 Kd透析袋用自來(lái)水透析脫鹽，每4 h更換一次透析液，直至經(jīng)pH試紙測(cè)量外部透析液為中性后，結(jié)束透析。透析袋內(nèi)所得即為鹿茸蛋白溶液。將鹿茸蛋白溶液55 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200 mL以內(nèi)，冷凍干燥，稱量干燥后粉末重量計(jì)算產(chǎn)率，4 ℃保存。

1.2.2 總蛋白含量的測(cè)定：參照Bradford(1976)[6]方法檢測(cè)蛋白含量。按蛋白含量測(cè)定試劑盒要求操作，溶液樣品與考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)8 min后于595 nm測(cè)吸光度。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鹿茸提取物蛋白含量。

考馬斯亮藍(lán)染液在使用前應(yīng)平衡溫度至室溫并溫和顛倒混勻，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品按0 μL，1 μL，2 μL，3 μL，4 μL，5 μL，6 μL的體積加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，再加入PBS補(bǔ)足到10 μL，向孔中加入190 μL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置8 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處的OD值。

1.2.3 SDS-PAGE電泳：配置10%分離膠和5%濃縮膠，樣品上樣量為20 μL。上樣前12 000 r/min離心1 min。初始電壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)電壓設(shè)置為120 V，電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色45 min(染色液：0.25 g考馬斯亮藍(lán)+50 mL甲醇+7 mL冰乙酸+蒸餾水至100 mL)及脫色過(guò)夜(脫色液：10 mL甲醇+10 mL冰乙酸+蒸餾水至100 mL)。

1.2.4 掃描電鏡檢測(cè)：將鹿茸蛋白提取物干粉用導(dǎo)電雙面膠粘在樣品臺(tái)上，噴金(60 s)，用掃描電鏡觀察(×200，局部放大至×800，電壓10 kV)。

1.2.5 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng):液氮中取出凍存的細(xì)胞株，復(fù)蘇培養(yǎng)，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS，100 U/mL青霉素、鏈霉素，pH 7.4)培養(yǎng)，置37 ℃，5%CO2，95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞為單細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁數(shù)大于85%時(shí)(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)可傳代培養(yǎng)。

1.2.6 MTT法檢測(cè)鹿茸促細(xì)胞增殖作用:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SH-SY5Y 細(xì)胞，以相同濃度的細(xì)胞接種于 96 孔板，待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后模型組以 1 000 μM MPP+作用于 SH-SY5Y 細(xì)胞。治療組分別以15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL的8個(gè)不同濃度的2種鹿茸蛋白和 MPP+作用于SH-SY5Y細(xì)胞。對(duì)照組只加 SH-SY5Y 細(xì)胞，不加藥物，分別檢測(cè)不同方法提取的鹿茸蛋白對(duì)MPP+損傷48 h的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞給藥時(shí)間結(jié)束前4 h，每孔加 20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，震蕩 2 min 后于酶標(biāo)儀 490 nm 處檢測(cè)吸光度值(A)。增值率=(OD給藥-OD模型)/(OD正常-OD模型)×100%。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)的提取方法比較 每250 g鮮鹿茸用2種方法可分別提取蛋白3.11 g(勻漿法)和6.21 g(超微粉碎法)，勻漿法提取的鹿茸純蛋白產(chǎn)率最高為0.08%，超微粉碎法提取的鹿茸純蛋白產(chǎn)率最高為0.37%。對(duì)不同方法提取的總蛋白進(jìn)行凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)勻漿法和超微粉碎法提取的蛋白質(zhì)在蛋白凝膠電泳中有明顯差別。勻漿法提取蛋白條帶清晰度比較好；超微粉碎提取法不僅含有較多大分子蛋白也含有較多小分子蛋白，與勻漿法相比在35 kD左右多出一條蛋白條帶，且在55 kD與250 kD附近蛋白含量較多。

表1 不同提取方法獲得梅花鹿鹿茸蛋白含量(g/250 g鮮鹿茸)Tab.1 Protein content of VAPs by two different methods (g/250 g flesh VA)

圖1 不同提取方法所提取的鹿茸蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜的比較1：marker；2、3：勻漿法；4、5：超微粉碎法Fig.1 Extracted by different extraction methods of velvet antler proteins sds-page map comparison1:maker; 2: homogenization; 3:micronization

2.2 鹿茸凍干粉的電鏡檢測(cè) 圖2A所示，放大200倍后可見(jiàn)超微粉碎法得到的鹿茸干粉的結(jié)晶物表面光滑，局部放大800倍后仍未見(jiàn)明顯顆粒。圖2B所示，勻漿法得到的鹿茸干粉放大200倍后可見(jiàn)部分顆粒，局部放大800倍后顆粒呈圓形光滑，可能為未完全磨碎的細(xì)胞。表明超微粉碎法得到的蛋白干粉較細(xì)，細(xì)胞均已破壁。

圖2 鹿茸凍干粉的電鏡檢測(cè)分析Fig.2 Electron microscopy analysis of antler freeze-dried powder

2.3 不同方法提取鹿茸蛋白對(duì)MPP+急性損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用比較 當(dāng)鹿茸蛋白與 MPP+共孵育 48 h后，采用勻漿法提取的鹿茸蛋白從125 μg/mL濃度開(kāi)始可顯著提高1mM MPP+作用下SH-SY5Y 細(xì)胞的增殖率，而超微粉碎法提取的鹿茸蛋白的最低有效濃度為62.5 μg/mL，增殖率可達(dá)到25.45%。見(jiàn)表1。

表2 不同提取方法提取鹿茸蛋白對(duì)MPP+損傷SH-SY5Y細(xì)胞 的保護(hù)作用比較 (n=5)Tab.2 The protective effect of different extraction methods of VAPs against MPP+-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cell line(n=5)

*P<0.05，**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

3 結(jié)論

鹿茸始載于漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有“生精補(bǔ)髓，養(yǎng)血益陽(yáng)，強(qiáng)筋健骨，治一切虛損、耳聾、目暗、眩暈虛痢”。鹿茸的再生、迅速增長(zhǎng)是依賴于一系列內(nèi)在激素和生長(zhǎng)因子，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明鹿茸的主要有效活性成分應(yīng)為鹿茸中大量存在的蛋白類物質(zhì)[7]。因此如何獲得大量的鹿茸蛋白并保證其蛋白活性是確定其藥理學(xué)作用的基礎(chǔ)步驟，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中重要的一環(huán)[8]。

目前常用的蛋白提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法、裂解液法、酶法、超聲波萃取法、雙水相萃取法和超臨界萃取法等。其中，有機(jī)溶劑容易引起蛋白質(zhì)變性失活，在提取蛋白質(zhì)時(shí)比較少用。裂解液法提取蛋白的步驟相對(duì)較多、耗時(shí)長(zhǎng)，可能引起蛋白的降解，同時(shí)裂解液法中所用到的助溶劑中的幾種成分有細(xì)胞毒性，而除雜過(guò)程中用到的丙酮有劇毒，不適用于后續(xù)的動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[9-10]。雙水相萃取法價(jià)格昂貴，限制了其在工業(yè)中大規(guī)模的應(yīng)用；體系本身易乳化，使得萃取過(guò)程極不穩(wěn)定；某些高聚合物雙水相體系分相時(shí)間較長(zhǎng)，大大降低了生產(chǎn)效率[11]。超臨界萃取法所需設(shè)備昂貴，成本高。相比較而言，勻漿法和超微粉碎法提取工藝簡(jiǎn)單，步驟少，成本低，對(duì)活性無(wú)影響。

本研究采用勻漿法和超微粉碎法2種提取方法對(duì)鹿茸蛋白的提取方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，超微粉碎法提取的純蛋白產(chǎn)率和含量均高于勻漿法。就蛋白電泳圖可見(jiàn)超微粉碎法蛋白條帶較多，且蛋白條帶較粗。

2種提取方法中勻漿法是在酸性體系中提取鹿茸蛋白，所獲得的鹿茸蛋白因?yàn)橐３制湓谌芤褐械娜芙舛?，使得體系中含鹽量高，電泳條件不穩(wěn)定，不利于電泳條帶的觀察。超微粉碎法步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需特別前處理，產(chǎn)率較高，所得到的蛋白種類多，蛋白含量大，條帶清晰、明確，且不改變蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)活性無(wú)影響。電鏡結(jié)果也顯示超微粉碎法提取的鹿茸蛋白凍干粉已無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且顆粒較細(xì)。因此，超微粉碎法能夠獲得大量鹿茸蛋白更適于后續(xù)對(duì)鹿茸蛋白藥效學(xué)的研究。

運(yùn)用MPP+誘導(dǎo)的急性損傷SH-SY5Y模型對(duì)2種方法提取的鹿茸蛋白活性的比較分析結(jié)果也表明，超微粉碎法提取的鹿茸蛋白具有較高的活性，其促進(jìn)MPP+損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞增殖率明顯高于勻漿法，且最小有效濃度為62.5 μg/mL，低于勻漿法的125 μg/mL。

綜上所述，在現(xiàn)有的研究階段，由于口服鹿茸中發(fā)揮藥效作用的活性成分和種類尚不明確，且蛋白類物質(zhì)容易變性失活，為保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，同時(shí)保證工作的高效進(jìn)行，采用既能大量提取蛋白又能保證蛋白活性的超微粉碎法是較為理想的提取方式。

[1] 王本祥.鹿茸的研究[M].長(zhǎng)春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1993.96-105.

[2] 桂麗萍，郭萍，郭遠(yuǎn)強(qiáng).鹿茸化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究， 2010， 33(3)：237-240.

[3] 劉琳玲，叢波，姜洪梅.鹿茸多肽功能的研究進(jìn)展[J].特產(chǎn)研究，2009，31(2)： 67-70.

[4] 范玉琳，邢增濤.鹿茸蛋白的提取分離及其抗腫瘤活性[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 1998，2(1)：27-31.

[5] 段冷昕，李夏，王楠婭.鹿茸多肽促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及肝部分切除小鼠的肝再生[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43(1)：27-30.

[6] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein binding [J].Anal Biochem， 1976， 72：248-254.

[7] 吉靜嫻，錢(qián)璟，黃鳳杰等.鹿茸的活性物質(zhì)及藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(2)，41-143.

[8] 楊穎，徐代勛，曲勃，邢秀梅，楊福合.梅花鹿鹿茸總蛋白的提取方法比較[J].特產(chǎn)研究，2011，33(2)：11-12.

[9] 翁瑜，曾群力，姜槐，許正平. 雙向凝膠電泳比較三種常用蛋白質(zhì)提取方法[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21(5)：690-693.

[10] 羅海波，陳偉，周靜峰，等.茭白總蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2013，32(6)：581-585.

[11] 單佳莉，黃幫裕，麥霖霞.雙水相萃取技術(shù)在生物技術(shù)上的應(yīng)用[J].廣東化工，2014，41(16)：131-132.

(編校：譚玲)

Comparison of two protein extraction methods from velvetantler

LI Chao-hua1,2, WANG Yi2, HE Zhong-mei1Δ?， SUN Ya-nan2Δ?

(1.College of Chinese Medicine Materials, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 2.Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medicine Science, Beijing 100700, China)

ObjectiveTo compare optimal protein extraction method of velvet antler(VA) and explore the repairmen activity of velvet antler proteins (VAPs) on 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) damaged nerve cell. MethodsVAPs was obtained from fresh velvet antler by homogenization and micronization method respectively. The protein content of VAPs was measured by Bradford and the molecular weight was identified by SDS-PAGE. Scanning electron microscope (SEM) was perfomed to observe the ultrastructure of VAPs. Neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) damage was induced by MPP+, and activity of each compound was compared by the proliferation of damaged cell detected by MTT method. ResultsThe yield of micronization method of VAPs was higher than homogenization method and with better characters both in SDS-PAGE and SEM. Activity detection indicated that VAPs at the concentration of 125 μg/mL by homogenate method could significantly increase the proliferation rate of damaged SH-SY5Y cells. By contrast, VAPs by micronization method had more effective effect at 62.5μg/mL, and proliferation rate could reach 25.45%. ConclusionMicronization method does not only acquire more protein but also has cell proliferation activity, is a relatively ideal way of protein extraction of velvet antler.

velvet antler; protein extraction; SH-SY5Y

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373884)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(ZZ2013005，ZZ0808011)

李超華，女，碩士在讀，研究方向：生藥學(xué)，E-mail：928191089@qq.com；何忠梅，通訊作者，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥有效成分及作用機(jī)理研究，E-mail：435398002@qq.com；孫婭楠，共同通訊作者，女，博士，助理研究員，研究方向：生物光子學(xué)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用，E-mail：23731787@qq.com。

R9

A

1005-1678(2015)09-0023-03