HPLC法測(cè)患者血清萬古霉素和去甲萬古霉素濃度

劉斌，童彤

(安徽省立醫(yī)院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

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HPLC法測(cè)患者血清萬古霉素和去甲萬古霉素濃度

劉斌Δ，童彤

(安徽省立醫(yī)院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

目的 建立高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素濃度。方法 色譜柱為Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液(9.5:2.5:88)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為35 ℃，萬古霉素和去甲萬古霉素互為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。結(jié)果 萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度在1.25～100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9996；萬古霉素低、中、高濃度的平均方法回收率分別為96.88%、99.50%、105.01%；去甲萬古霉素低、中、高濃度的平均方法回收率分別為94.40%、103.90%、103.81%；日內(nèi)、日間精密度RSD均<5%。結(jié)論 該方法靈敏度高、簡(jiǎn)單、采血量少且成本低，適于萬古霉素及去甲萬古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)和臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。

高效液相色譜法；萬古霉素；去甲萬古霉素；人血清；血藥濃度

萬古霉素(Vancomycin)屬于糖肽類大分子抗生素，由于萬古霉素的藥力較強(qiáng)，一般在其他抗生素對(duì)病菌無效時(shí)被使用。主要用于敏感革蘭氏陽(yáng)性菌所致的系統(tǒng)感染和腸道感染，如心內(nèi)膜炎、敗血癥、偽膜性腸炎、骨髓炎、肺炎等感染性疾病等[1]。去甲萬古霉素(Norvancomycin)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理性質(zhì)和抗菌作用均與萬古霉素相似，是我國(guó)自主研制開發(fā)的萬古霉素同類產(chǎn)品，活性稍強(qiáng)于萬古霉素。2者均屬快效殺菌劑，通過作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成[2]。2者口服均不吸收,隨著用藥劑量或滴注速度的增加血藥濃度會(huì)不斷的延長(zhǎng),繼而產(chǎn)生耳毒性和腎毒性[3]等一系列不良反應(yīng)[4]。因此，臨床上在使用該藥物的同時(shí)，要密切觀察患者的血藥濃度，調(diào)整藥物劑量，即對(duì)患者血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以減少不良反應(yīng)的發(fā)生。國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道該藥物治療藥物監(jiān)測(cè)的方法，檢測(cè)方法有主要高效液相色譜法(HPLC)、微生物檢測(cè)法、熒光偏振免疫法(FPIA)等[5-10]。由于微生物檢測(cè)法耗時(shí)較長(zhǎng)，且其精密度較低，目前在臨床上主要使用FPIA法測(cè)定，其操作簡(jiǎn)單易行，相對(duì)與微生物檢測(cè)法來說精密度較高。但是又有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，熒光偏振免疫法與高效液相色譜法相比，測(cè)定值容易偏高。Morishige 等[12]曾對(duì)FPIA標(biāo)準(zhǔn)血樣穩(wěn)定性進(jìn)行研究，表明其穩(wěn)定性較差。HPLC相對(duì)于FPIA法，其檢測(cè)限和精密度較低，分析過程簡(jiǎn)單，費(fèi)用較低，患者更易于接受。所以，建立快速、準(zhǔn)確的HPLC法，供臨床進(jìn)行萬古霉素和去甲萬古霉素血藥濃度的監(jiān)測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究，是很有必要的。本實(shí)驗(yàn)欲通過建立HPLC法同時(shí)測(cè)定人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度的方法，以期探索方便、易行、省時(shí)且靈敏度高的檢測(cè)方法可供臨床使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Waters高效液相色譜儀(包括515四元泵、2487紫外檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、TC-100柱溫箱、HS色譜工作站V400+)(美國(guó)Waters公司)；BT25S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；XW-80A微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；pHS-2C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

1.1.2 藥品與試劑：萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)：140328-200601，純度95.5%)；去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)：140313-200603，純度83.4%)。乙腈(色譜純，天津市福晨化學(xué)儀器廠)；甲醇(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；磷酸二氫鉀(分析純，無錫市展望化工試劑有限公司5)；磷酸、高氯酸均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為pH=3.6的甲醇-乙腈磷酸-二氫鉀緩沖液(9.5:2.5:88)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm(參照2010年版《中國(guó)藥典》)；柱溫為35 ℃。

1.2.2 流動(dòng)相的配制：稱取磷酸二氫鉀6.805 g，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL,用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.6，即得0.05 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液。

1.2.3 沉淀劑的配制：將乙腈-6%高氯酸按1︰6的比例混合即得。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取20.9424 mg萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度為95.5%)于10 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解后定容，搖勻，即得濃度為2000 μg/mL的萬古霉素儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存，臨用時(shí)用蒸餾水稀釋成濃度分別為12.5、25、50、100、250、500、1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。稱取11.9904 mg去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度83.4%)于10 mL容量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻，即得濃度為1000 μg/mL的去甲萬古霉素儲(chǔ)備液，置冰箱4 ℃保存，臨用時(shí)用蒸餾水稀釋成濃度分別為12.5、25、50、100、250、500、1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.5 血清樣品預(yù)處理：取待測(cè)樣品200 μL于1.5 mL EP 管中, 加入上述沉淀劑200 μL漩渦震蕩2 min,15000 r/min,離心15 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

① 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密移取180 μL空白血清至1.5 mL EP管中,加入100 μg/mL去甲萬古霉素，萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)液各20 μL，使萬古霉素血清終濃度分別1.25、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL，按1.2.1項(xiàng)下進(jìn)行處理。計(jì)算萬古霉素與去甲萬古霉素的峰高比，以血清濃度(X)與峰高比值(Y)進(jìn)行線性回歸分析。

② 去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密移取180 μL空白血清,100 μg/mL萬古霉素，去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)液各加入20 μL，使去甲萬古霉素血清終濃度別1.25、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL，按1.2.3項(xiàng)下進(jìn)行處理。計(jì)算去甲萬古霉素與萬古霉素的峰高比，以血清濃度(X)與峰高比值(Y)進(jìn)行線性回歸分析。

③ 精密度實(shí)驗(yàn)：精密移取180 μL空白血清,萬古霉素、去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)液各加入20 μL，使萬古霉素、去甲萬古霉素血清濃度分別為1.25 μg/mL(低)，10 μg/mL(中)，100 μg/mL(高)，按1.2.3項(xiàng)下進(jìn)行處理，低、中、高3個(gè)濃度日內(nèi)分別平行測(cè)定5次，得日內(nèi)精密度。每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3天，得日間精密度。

④ 回收率實(shí)驗(yàn)：精密移取180 μL空白血清,加入萬古霉素、去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)液各20 μL，使萬古霉素、去甲萬古霉素血清濃度分別為1.25 μg/mL(低)，10 μg/mL(中)，100 μg/ml(高)，按1.2.3項(xiàng)下進(jìn)行處理，低、中、高3個(gè)濃度日內(nèi)分別平行測(cè)定5次，將儀器檢測(cè)到的濃度除以實(shí)際配置的濃度，即得方法回收率。

2 結(jié)果

2.1 色譜峰分離情況 本實(shí)驗(yàn)條件下，萬古霉素和去甲萬古霉素與血清中的組分分離良好且峰形較好，空白血清中無干擾雜質(zhì)峰。萬古霉素和去甲萬古霉素的相對(duì)保留時(shí)間分別為15.998 min、11.932 min。古霉素、去甲萬古霉素血清樣品色譜圖見圖1。

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素的血清色譜圖A：空白血清； B：空白血清+去甲萬古霉素； C：空白血清+萬古霉素； D：空白血清+去甲萬古霉素+萬古霉素Fig.1 HPLC chromatograms of serum Vancomycin and NorvancomycinA: blank serum; B: serum of blank and Norvancomycin-treated patients; C: serum of blank and Vancomycin-treated patients; D: blank serum containing Vancomycin and Norvancomycin

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 萬古霉素和去甲萬古霉素均在1.25～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。萬古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=15.315X-0.7896，R2=0.9996(n=7)；去甲萬古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=6.7626X-0.1554，R2=0.9996(n=7)；萬古霉素和去甲萬古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2和圖3。

圖2 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Vancomycin

圖3 去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of Norvancomycin

2.3 精密度和回收率 低、中、高3個(gè)濃度萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率和精密度的結(jié)果見表1。由表1可知，萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率和精密度均符合《中國(guó)藥典》生物樣本分析相關(guān)規(guī)定。

表1 萬古霉素與去甲萬古霉素的回收率和精密度(n=5)Tab.1 Results of the recovery rates and precision of vancomycin and norvancomycin in serum(n=5)

3 討論

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，常采用pH=3.6的甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液(10:5:85)為流動(dòng)相，地塞米松磷酸鈉、甲硝唑、替考拉寧等作為內(nèi)標(biāo)物，液-液萃取法、直接沉淀法或2者相結(jié)合等方法進(jìn)行血清樣品處理。但經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的配比、pH值、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)及血樣處理方法對(duì)出峰時(shí)間、峰形及分離效果均有較大影響。本試驗(yàn)最終采用甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液(9.5:2.5:88)為流動(dòng)相，萬古霉素和去甲萬古霉素互為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，選擇乙腈-6% 高氯酸(1︰6)作為沉淀劑,沉淀較為完全，分離效果較好，操作簡(jiǎn)便且靈敏度較好，萬古霉素和去甲萬古霉素與血清雜質(zhì)分離更加完全，且峰形更好，保留時(shí)間合適，檢測(cè)效率高，更適于臨床血藥濃度檢測(cè)和藥代動(dòng)力學(xué)研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功通過試驗(yàn)研究篩選出靈敏度高、選擇性好、專屬性強(qiáng)、分析快速等優(yōu)點(diǎn)的人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素的高效液相色譜測(cè)定法，快速簡(jiǎn)捷、采血量少，其準(zhǔn)確度和精密度良好，符合生物樣本分析要求，可滿足臨床開展治療藥物監(jiān)測(cè)(therapeutic drug monitoring，TDM)和進(jìn)行人體藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。

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(編校：王冬梅)

Determination of Vancomycin and Norvancomycin in human serum by HPLC

LIU BinΔ, TONG Tong

(Department of Pharmacy, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001,China)

ObjectiveTo establish HPLC method for fast, effective, simultaneous determination of Vancomycin and Norvancomycin in serum.MethodsThe separation was achieved on the Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-acetonitrile-a mixture of potassium phosphate(9.5:2.5:88) as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min. The UV detecting wavelength was 280 nm. The temperature of the column was 35 ℃. Vancomycin and Norvancomycin were used as the internal standard for each other.ResultsVancomycin and Norvancomycin blood concentration were in well linearity in the range of 1.25-100 μg/mL,R2=0.9996.The average method recovery rate of three concentrations were 96.88%,99.50%,105.01% respectively, the average method recovery rate of three concentrations were 94.40%,103.90,103.81%respectively, the intra-day and inter-day RSD were less than 5%.ConclusionThe HPLC method is proved to be simple,sensitive, accurate and precise in which little blood sample is taken, thus it is suitable for the therapeutic drug monitoring(TDM) and pharmacokinetic study of Vancomycin and Norvancomycin.

HPLC; Vancomycin; Norvancomycin; human serum; plasma concentration

劉斌，通信作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥理學(xué)，E-mail：liubinhf@sina.com。

R927.11

A

1005-1678(2015)11-0172-03