VEGF水平與惡性胸腔積液的相關(guān)性研究

劉洪建,王玉波,解楨,張慶廣

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胸外科，山東 濱州 256600)

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VEGF水平與惡性胸腔積液的相關(guān)性研究

劉洪建,王玉波,解楨,張慶廣

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胸外科，山東 濱州 256600)

目的 探討血清及胸腔積液中VEGF水平在良、惡性腫瘤中的診斷價值，并評價VEGF-A,C,D在診斷惡性胸腔積液中的臨床應(yīng)用。方法 從濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院治療的患者中，選擇肺癌且伴有胸腔積液者，共34例，收集其血清及胸腔積液，采用雙抗體夾心ELISA法檢測胸腔積液及血清VEGF及VEGF-A，C，D濃度。同時測定34例良性胸腔積液患者的血清及胸腔積液VEGF水平情況，并進一步檢測惡性漿膜腔積液患者外周血清，積液上清VEGF-A，C，D的濃度。結(jié)果 血清及胸腔積液VEGF水平惡性組均顯著高于良性組(P<0.05)。另外，初治前肺癌患者血清及胸腔積液VEGF水平，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組明顯高于尚未有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。VEGF水平與惡性胸腔積液存在相關(guān)性(r=0.878,P<0.05)。VEGF水平與良性胸腔積液無相關(guān)性。血清sVEGF-A含量在惡性組及良性組無統(tǒng)計學(xué)差別。積液上清pVEGF-A含量在惡性組高于良性積液組(P<0.05)，在惡性積液中顯示pVEGF-A明顯高于sVEGF-A水平(P<0.05)。血清sVEGF-C，sVEGF-D含量在惡性組及良性組無統(tǒng)計學(xué)差別。積液上清pVEGF-C，pVEGF-D含量在惡性組及良性組無統(tǒng)計學(xué)差別。結(jié)論 檢測血清及胸腔積液中VEGF水平有助于良惡性胸腔積液的診斷和鑒別診斷。積液上清VEGF-A在良惡性積液有差異，提示可能成為良惡性積液的腫瘤標(biāo)志物。

胸腔積液；血管內(nèi)皮生長因子；腫瘤；VEGF-A；VEGF-C；VEGF-D

惡性胸腔積液患者中位生存時間為4.7 個月，23%患者為1年，7%患者為2年[1-3]。這些數(shù)據(jù)提示臨床前研究的重要性，以提高惡性積液的診斷及治療。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在1980年被發(fā)現(xiàn)，同時發(fā)現(xiàn)其在積液形成中有重要作用[4]。腫瘤浸潤或轉(zhuǎn)移至胸腹后VEGF水平的升高、腫瘤新生血管的生成以及血管通透性增加等是漿膜腔內(nèi)積液形成的重要機制，VEGF是組胺血管滲透能力的50000倍。VEGF被認(rèn)為是有前景的標(biāo)志物[5]。VEGF家族包括6種類型：VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)，主要由腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，VEGF-A 是腫瘤血管生成中最重要的調(diào)控因子，VEGF-C 和 VEGF-D 是腫瘤淋巴管生成中最重要的調(diào)控因子[6]既往研究多集中于血管。即VEGF-A 的研究，而很少關(guān)注淋巴因子的作用。Ishii[7]等建立穩(wěn)定的肺癌細(xì)胞克隆(TKB5/VEGF-A, TKB5/VEGF-C, TKB5/VEGF-D，TKB5/VEGF-A/C，TKB5/VEGF-A/D)，接種于裸鼠胸腔，結(jié)果證明 VEGF-A 在產(chǎn)生積液方面及血管新生方面發(fā)揮了重要作用， VEGF-D在胸膜播散及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面有作用。Ma[8]等建立小鼠的惡性胸膜腔積液模型，在重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液的高劑量組(30 mg/kg)，胸腔積液量及VEGF-A，VEGF-C 明顯低于低劑量組(8 mg/kg)、貝伐單抗(5 mg/kg)和生理鹽水組。以上基礎(chǔ)實驗為VEGF-C及VEGF-D在漿膜腔積液的發(fā)生機制中的作用，提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本研究將VEGF作為研究指標(biāo)，分別檢測了良、惡性胸腔積液VEGF水平和血清中的VEGF水平，探討VEGF水平與惡性胸腔積液形成之間的關(guān)系，并進一步通過檢測惡性漿膜腔積液患者外周血清，積液上清及細(xì)胞水平VEGF-A,C,D的蛋白含量及表達，探討三因子在積液診斷方面的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 隨機選擇2012年7月1日～2013年1月30日，濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院漿膜腔積液初診的患者為研究對象，根據(jù)患者積液的蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)及免疫組化結(jié)果確診為癌癥及未見癌患者，收集其血清，積液上清及細(xì)胞涂片，并隨訪至 2014年1月25日。最終選取積液上清共68例(原發(fā)肺癌所致惡性積液34例，良性積液34例)。68例外周血清(原發(fā)肺癌所致惡性積液34例，良性積液34例)。

1.2 試劑與儀器 TGL-16B臺式離心機(上海)，微孔板振蕩器(日本)，Ependorf管(蘇州)， BIO-TEK ELX800 全自動酶標(biāo)儀(美國)，VEGF-A ELISA 試劑盒(NeoBioscience 公司) ，VEGF-C ELISA 試劑盒(美國RayBiotec 公司)，VEGF-D ELISA 試劑盒(美國 ImmunoWay 公司)，兔抗人 VEGF-C 抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)， 兔抗人VEGF-A抗體(美國Bioworld Technology公司)，濃縮 DAB 試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔VEGF-D抗體(美國Bioworld Technology公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)：試劑 A(藍(lán)色液體)為封閉用正常山羊血清工作液；試劑B(黃色液體)為生物素化二抗工作液、SP-9001：羊抗兔 IgG；試劑 C(橙色液體)為辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液(S-A/HRP)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集：外周血的采集，自患者肘靜脈處抽取晨起空腹外周血2 mL；胸腔積液的采集，通過胸腔穿刺收集胸腔積液 5 mL；采用臺式離心機，于4 ℃3000 r/min條件下離心 10 min，提取上清液，分別置于冰箱中，-20 ℃保存。

1.3.2 VEGF水平檢測：采用雙抗體夾心 ELISA法檢測胸腔積液及血清VEGF及VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D 濃度，采用同一批試劑，實驗步驟按照說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 各組中血清、胸腔積液VEGF水平 結(jié)果顯示惡性組血清和胸腔積液中VEGF水平均高于良性對照組(P<0.05)，見表1。

表1 血清與胸腔積液中VEGF水平比較Tab.1 Comparison of VEGF levels in serum and pleural ±s,pg/mL)

2.2 VEGF濃度水平在初治前惡性組(M1)與未轉(zhuǎn)移組(M0)的表達 將初治前惡性組患者，以有、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組(M1)和未轉(zhuǎn)移組(M0)，2組患者血清濃度、胸腔積液濃度進行比較，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移組VEGF水平高于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，見表2。

表2 未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組VEGF水平比較Tab.2 Comparison of VEGF levels in without metastasis and metastasis ±s,pg/mL)

2.3 VEGF水平與良，惡性胸腔積液的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性研究分析，VEGF水平與惡性胸腔積液存在相關(guān)性(r=0.878,P<0.05)。VEGF水平與良性胸腔積液無相關(guān)性。

2.4 惡性和良性組胸腔積液中VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D水平比較 積液上清pVEGF-A含量在惡性組高于良性積液組(P<0.05)。血清sVEGF-A含量在惡性組及良性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在惡性積液中顯示pVEGF-A 明顯高于sVEGF-A水平(P<0.05)。積液上清pVEGF-C，pVEGF-D及血清sVEGF-C，sVEGF-D含量在惡性組及良性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 惡性組和良性組胸腔積液中VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D水平比較Tab.3 Levels of VEGF-A, -C and -D proteins in benign and malignant pleural ±s，pg/mL)

#P<0.05，與良性組相比，compared with benign group；ΔP<0.05，與血清水平比較，compared with serum level

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一類生長因子。Mohammed KA[9]指出，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合微血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜和小泡囊狀細(xì)胞器，使小泡囊狀細(xì)胞器的活性增加，導(dǎo)致血管內(nèi)大分子物質(zhì)的滲出，是目前已知的最強的血管滲透劑，對血管通透性比組胺大5萬倍左右。Yano S[10]指出，VEGF與其受體結(jié)合后，增加了血管通透性，使血漿蛋白外滲，進而為胸腔積液的形成提供了理想的微環(huán)境。因此VEGF可能是誘發(fā)惡性胸腔積液的重要原因。

本研究結(jié)果顯示：在肺癌患者胸腔積液中，VEGF水平惡性患者明顯高于良性患者(P<0.01)。可以認(rèn)為 VEGF水平在良、惡性胸腔積液中具有鑒別診斷意義和診斷價值。同時相關(guān)性分析顯示，VEGF水平與惡性胸腔積液存在相關(guān)性(r=0.878,P<0.05)。

本研究數(shù)據(jù)顯示， VEGF水平在胸腔積液和血清水平中，前者含量明顯高于后者，所以認(rèn)為在胸腔滲出液積聚過程中VEGF起到了重要作用，通過測定胸腔積液中 VEGF水平來鑒別良、惡性胸腔積液是有意義的。有研究指出[11]，在中國和美國，胸腔積液中惡性胸腔積液占滲出性胸腔積液的第2位，故通過胸腔積液中 VEGF水平進行早期診斷具有重要意義。

本研究顯示積液上清VEGF-A 水平高于其血清值，分析原因在于漿膜腔中標(biāo)志物不易進入血循環(huán)被肝臟滅活，而血清學(xué)指標(biāo)易受全身代謝等多種因素影響，故濃度不及漿膜腔因子濃度高。VEGF-A積液上清水平在診斷方面，本研究顯示上清VEGF-A良惡性有差異，與既往文獻[12-14]一致。臨床病理因素方面，本研究顯示，VEGF-A含量在惡性積液高于良性，與之前研究一致。本研究顯示，VEGF-C,VEGF-D的血清及上清水平在良惡性積液均未見統(tǒng)計學(xué)差異。很多研究都在開展以VEGF為靶點進行抑制腫瘤生長的研究[10，15-16]。

結(jié)合既往文獻分析，VEGF盡管是分泌型蛋白，可以在外周血及積液測出蛋白水平，但一些因子，如VEGF-C，VEGF-D釋放的生物活性形式不同，所以，識別重要的生物活性形式及何種形式對臨床實踐很重要。VEGF同樣參與了病理性炎癥的發(fā)生，尤其在膿性積液的發(fā)生及結(jié)核病變的滲出期尤為明顯，需聯(lián)合炎性或結(jié)核的分子標(biāo)志物加以比較，方可提高其診斷良惡性的敏感性。未來需進一步擴大樣本量及良性積液的病種。

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(編校：譚玲)

Study on correlation between VEGF level and malignant pleural effusion

LIU Hong-jian,WANG Yu-bo, XIE Zhen, ZHANG Qing-guang

(Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256600, China)

ObjectiveMethods To explore the value of VEGF levels in serum and pleural effusion for diagnosis of benign and malignant tumors, and evaluate clinical value of VEGF-A, C, D in malignant pleural effusion.MethodsSerum and pleural effusion of 34 cases patients with lung cancer were collected in our hospital, the application of ELISA method for the detection of VEGF level in serum and pleural effusion in patients with lung cancer and with benign pleural effusion. VEGF-A, C, D levels were detected.ResultsVEGF levels in serum and pleural effusion in malignant group were significantly higher than those in benign group(P<0.05). In addition, patients with lung cancer before initial treatment, the VEGF levels in serum and pleural effusion of distant metastasis group were significantly higher than those of without distant metastasis group(P<0.05). There was a correlation between the level of VEGF and the malignant pleural effusion(r=0.878,P<0.05). No correlation existed between VEGF level and benign pleural effusion. The content of sVEGF-A in serum had no statistical difference in cancer group and benign group. Effusion supernatants of pVEGF-A content in lung cancer group were higher than those in benign effusion group(P<0.05). pVEGF-A and sVEGF-A levels were similar in benign effusion group. Effusion supernatants pVEGF-A in malignant group was higher than that in benign effusion group(P<0.05). pVEGF-A was significantly higher than that of sVEGF-A in malignant effusion(P<0.05). Serum VEGF-C, VEGF-D content had no significant difference between cancer group and benign group. pVEGF-C, pVEGF-D content had no significant difference between cancer group and benign group.ConclusionLevel of VEGF in serum and pleural effusion detection would help to diagnose and differentially diagnose benign and malignant pleural effusion. Effusion VEGF-A is different in benign and malignant effusion, which may become benign and malignant effusion tumor markers.

pleural effusion; vascular endothelial growth factor; tumor; VEGF-A; VEGF-C; VEGF-D

劉洪建，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：胸部腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：yixvebianjis@163.com。

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1005-1678(2015)03-0141-03