miR-145對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和FSCN1蛋白表達(dá)的影響研究

牟志民,毛廣顯,謝遠(yuǎn)財(cái),彭旭興,烏達(dá)

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院 胸外科，廣東 深圳 518036)

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miR-145對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和FSCN1蛋白表達(dá)的影響研究

牟志民,毛廣顯,謝遠(yuǎn)財(cái)△,彭旭興,烏達(dá)

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院 胸外科，廣東 深圳 518036)

目的 研究miR-145在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 A549中的表達(dá)及其對(duì)A549細(xì)胞增殖和靶蛋白 FSCN1表達(dá)的影響。方法 采用分子克隆實(shí)驗(yàn)構(gòu)建pmR-mcherry/miR-145真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞，QPCR法檢測(cè)miR-145在細(xì)胞中的表達(dá)水平；Western blot 檢測(cè)miR-145對(duì)細(xì)胞中FSCN1蛋白表達(dá)水平的影響；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-145對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果 成功構(gòu)建pmR-mcherry/miR-145真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后QPCR檢測(cè)其可有效表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)miR-145后，F(xiàn)SCN1的蛋白水平明顯的下調(diào)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-145能明顯抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖。結(jié)論 過表達(dá)miR-145可抑制A549細(xì)胞增殖并下調(diào)FSCN1基因的表達(dá)水平。

miR-145；FSCN1；細(xì)胞增殖

肺癌居全球癌癥病死率之首，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的類型。研究表明肺癌5年生存率的表現(xiàn)仍然不佳[1]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其功能是靶向基因編碼的mRNA并調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和/或降解[2]。大量研究表明，miRNAs參與許多細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)如物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和分化[3-4]。miR-145是重要的抑癌分子，已知其在多種類型的惡性腫瘤中表達(dá)異常下調(diào)，包括前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、卵巢癌以及B細(xì)胞惡性腫瘤等。有報(bào)道證明miR-145的過表達(dá)具有生長抑制作用[5]。研究顯示miR-145可通過誘導(dǎo)p53表達(dá)、靶向c-myc和IRS-1來抑制細(xì)胞的生長，同時(shí)具有靶向ADAM17、MUC1、Oct4和FSCN1等，抑制胚胎干細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞的增殖并調(diào)節(jié)其遷移和侵襲的多能性[6]。研究表明在臨床樣本中fascinhomolog1 基因(FSCN1)與 miR-145的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建 miR-145真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和FSCN1)表達(dá)的影響，以期闡明miR-145在肺癌發(fā)生中的作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

T4 DNA連接酶、感受態(tài)大腸桿菌DH5α(美國Promega公司)；限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP(日本Takara公司)；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RIPA裂解液(東盛生物技術(shù)有限公司)；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、Trizol(美國Invitrogen公司)；pmR-mcherry質(zhì)粒(本院醫(yī)學(xué)研究中心保存)；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Hyclone公司)。FSCN1抗體及二抗均為英國Abcam公司產(chǎn)品；SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)。

PRISM?7500定量PCR儀(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 miR-145真核表達(dá)載體的構(gòu)建:由miRBase網(wǎng)站查詢獲得hsa-miR-145前體序列(M10000461)，通過BLAST比對(duì)獲取其基因組序列，引物設(shè)計(jì)軟件primer5設(shè)計(jì)引物。引物由上海life公司合成。primer1：5’-CGgaattcGGCTGGATGCAGAAGAG-AAC-3’，primer2：5’-GCggtaaccGCCTTCTTCTTGAACCCTCA-3’。primer1中為EcoR I酶切位點(diǎn)，primer2中為Kpn l酶切位點(diǎn)。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30s，72 ℃延伸50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物及pmR-mcherry質(zhì)粒分別用EcoR I和Kpn l進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將酶切回收的產(chǎn)物16 ℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，挑選陽性克隆并進(jìn)行雙酶切鑒定后送測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：A549細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清中于37 ℃，5%CO2及一定濕度下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，每孔2 mL細(xì)胞懸液。待6孔板中的細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時(shí)，用lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒分別將pmR-mcherry/miR-145、pmR-mcherry空載體轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。每孔質(zhì)粒量為0.5 ug，終濃度為150 nmol/L。

1.2.3 定量PCR檢測(cè)miR-145在A549細(xì)胞中的表達(dá)：轉(zhuǎn)染pmR-mcherry/miR-145過表達(dá)載體24 h后，提取細(xì)胞總RNA，oligo dT法反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。miR-145莖環(huán)引物為：上游5’-acactccagctgggtttgggagtct-3’，下游5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’。U6基因?yàn)閮?nèi)參：上游5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，下游5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)FSCN1蛋白表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染miR-145 72 h的A549細(xì)胞；RIPA裂解液裂解細(xì)胞得到總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳；5%的脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；TBST洗10 min，重復(fù)3次，然后加1∶1000稀釋的一抗(Abcam，英國)室溫孵育1 h；TBST洗10 min，3次，加1:4000稀釋的二抗(Abcam，英國)，室溫孵育1 h；TBST洗10 min，3次；BCL顯影，曝光。

1.2.5 miR-145對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響：分別收集轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h后的A549細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞生長曲線測(cè)定。在0.08 mL臺(tái)盼藍(lán)(含0.1% Trypan blue的PBS)中加0.2 mL細(xì)胞懸液，立即用微量巴氏吸管混勻后，吸足量細(xì)胞懸液從血細(xì)胞計(jì)數(shù)室的一邊加樣；使用Freshney計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建 pmR-mcherry/miR-145載體構(gòu)建結(jié)果見圖1。PCR特異擴(kuò)增出的miR-145前體片段條帶和目標(biāo)條帶大小及位置一致(line 1)。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EωRI雙酶切，可獲得約4500 bp和200 bp的條帶(line 2)，說明miR-145前體片段已成功連接至cherry空質(zhì)粒中；測(cè)序結(jié)果與GeneBank中的miR-145前體序列一致，表明重組質(zhì)粒pmR-mcherry/miR-145構(gòu)建成功(結(jié)果未顯示)。

圖1 pmR-mcherry/miR-145載體構(gòu)建電泳結(jié)果M：DL 500 bp Marker；1：miR-145前體片段PCR產(chǎn)物；2：pmR-mcherry/miR-145雙酶切產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis results of recombinant plasmid pmR-mcherry/miR-145M:DL 500 bp Marker; 1.PCR product of miR-145 precursor;2.Restrictive enzyme digestion products of pmR-mcherry/miR-145

2.2 miR-145表達(dá)水平檢測(cè) QPCR法檢測(cè)pmR-mcherry/miR-145重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24 h后miR-145的表達(dá)結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒A549的細(xì)胞miR-145的表達(dá)量遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P<0.01)，說明miR-145在A549細(xì)胞中得到過表達(dá)，可以用于后續(xù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

圖2 miR-145的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of miR-145

2.3 miR-145對(duì)FSCN1蛋白水平的影響 采用Western blot檢測(cè)過表達(dá)miR-145對(duì)FSCN1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組中FSCN1的表達(dá)量明顯低于空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組(均P<0.05)；空質(zhì)粒組中FSCN1的表達(dá)量與空白對(duì)照組無明顯差別。說明過表達(dá)miR-145后，F(xiàn)SCN1蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，見圖3。

圖3 Westernblot檢測(cè)FSCN1蛋白表達(dá)水平Fig.3 Relative expression of FSCN1 protein

2.4 過表達(dá)miR-145對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145重組質(zhì)粒72 h后，miR-145重組質(zhì)粒組對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，在96 h抑制作用更為明顯(P<0.05)，見圖4。說明miR-145可能通過下調(diào)FSCN1的表達(dá)水平來抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖。

圖4 過表達(dá)miR-145對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 Effect of miR-145 overexpression on A549 cell proliferation

3 討論

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面有很大的進(jìn)步，但其仍是癌癥死亡的主要原因，肺癌中近85%的患者為非小細(xì)胞肺癌[8]。FSCN1是一種將細(xì)胞內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白組織成有序的，緊密的平行束的分子量為55 kDa的球狀蛋白[9]。脊椎動(dòng)物基因組中存在3種形式的FSCN：FSCN1，在間充質(zhì)組織和神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)； FSCN2，由視網(wǎng)膜感光細(xì)胞表達(dá)；FSCN3，具有睪丸特異性。FSCN1為負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞質(zhì)微絲束。最近研究表明，在腫瘤患者身體的許多部位中均檢測(cè)到FSCN為1蛋白的上調(diào)[10]。在非小細(xì)胞肺癌和胃腺癌的研究顯示，帶瘤生存率較差與腫瘤中FSCN1的高表達(dá)相關(guān)[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建pmR-mcherry/miR-145真核表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-145后，F(xiàn)SCN1的蛋白水平明顯的下調(diào)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-145能明顯抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖。表明miR-145抑制A549細(xì)胞的增殖很可能是通過調(diào)節(jié)A549細(xì)胞中FSCN1蛋白的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討miR-145在肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，以期為肺癌的臨床診斷和生物治療提供理論依據(jù)。

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(編校：吳茜)

Effect of miR-145 on NSCLC cell proliferation and FSCN1 protein expression

MU Zhi-min,MAO Guang-xian,XIE Yuan-cai△,PENG Xu-xing,WU Da

(Department of Thoracic Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-145 on human lung adenocarcinaoma A549 cell proliferation and FSCN1 expression.MethodspmR-mcherry/miR-145 was constructed and transfected into A549 cell，then the expression of miR-145 and the proliferation of A549 cell were verified by QPCR and MTS assay, respectively．The situation of FSCN1 expression in A549 cell was detected by Western blot.ResultspmR-mcherry/miR-145 vector was constructed successfully，and QPCR results indicated that miR-145 expressed effectively.Western blot results showed that FSCN1 was one of the targets of miR-145 in A549 cell．MTS assay results indicated that miR-145 inhibited the proliferation of A549 cell.ConclusionOverexpression of miR-145 can inhibit the proliferation of A549 cell, and FSCN1 was one of its target.

miR-145;fascinhomolog1;cell proliferation

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20140415162338820);深圳市醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(201302068)

牟志民，男，學(xué)士，副主任醫(yī)師，研究方向:胸外科，E-mail：szmzm416@126.com；謝遠(yuǎn)財(cái)，男，通訊作者，博士，主任醫(yī)師，研究方向：胸外科疾病，E-mail：xieyuancai2005@126.com。

R734.2

D

1005-1678(2015)03-0025-03