黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持階段VEGF、BMP-2及IL-1β表達(dá)的影響

李玲

(萊蕪市人民醫(yī)院 口腔科，山東 萊蕪 271199)

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黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持階段VEGF、BMP-2及IL-1β表達(dá)的影響

李玲

(萊蕪市人民醫(yī)院 口腔科，山東 萊蕪 271199)

目的 觀察黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持階段血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)和白介素1β(interleukin，IL-1β)表達(dá)的影響，探討黃芩苷對(duì)牙周組織改建的作用機(jī)制。方法 80只SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組20只?？瞻捉M不作處理，模型組建立牙周炎模型，對(duì)照組與觀察組均建立牙周炎模型，繼而建立牙移動(dòng)模型，觀察組給予黃芩苷，空白組和對(duì)照組給予等量生理鹽水，分別于1、3、6、12、18d時(shí)處死大鼠進(jìn)行免疫組化染色，觀察牙周組織VEGF、BMP-2和IL-1β的表達(dá)變化。結(jié)果 空白組大鼠BMP-2陽(yáng)性表達(dá)不高，模型組BMP-2表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)照組和觀察組牙周組織BMP-2的表達(dá)在加力結(jié)束后逐漸降低，但相同時(shí)間點(diǎn)比較，觀察組BMP-2表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組和觀察組牙周組織VEGF表達(dá)量在加力結(jié)束后均較模型組顯著降低，相同時(shí)間點(diǎn)比較，觀察組VEGF表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)?？瞻捉MIL-1β陽(yáng)性表達(dá)不明顯，模型組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)明顯增多，對(duì)照組和觀察組牙周組織IL-1β表達(dá)量在加力結(jié)束后逐漸降低，相同時(shí)間段組比較，觀察組IL-1β表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 黃芩苷可顯著減少牙周炎大鼠牙移動(dòng)后牙周組織中IL-1β表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，抑制骨吸收；增加牙周組織中BMP-2和VEGF表達(dá)，促進(jìn)牙周組織血管形成和成熟，這可能是黃芩苷促進(jìn)牙周炎大鼠正畸牙移動(dòng)后保持階段內(nèi)牙周組織改建的作用機(jī)制之一。

牙周炎；黃芩苷；VEGF；BMP-2；IL-1β

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到錯(cuò)頜畸形是一種疾病，極大影響顏面美觀和口腔功能，需及時(shí)接受正畸治療。但是，成人矯治后出現(xiàn)的牙周炎問題正成為困擾醫(yī)生的一大難題。牙周炎發(fā)病機(jī)制主要是由于菌斑及其毒性產(chǎn)物致使牙周組織炎癥，并且激活宿主細(xì)胞，從而釋放多種炎癥介質(zhì)[1-2]。一旦出現(xiàn)牙周炎，可導(dǎo)致牙槽骨吸收、牙周支持組織破壞，患牙受力失衡，從而影響牙齒咬合功能[3]。如何保持牙周炎患者牙齒穩(wěn)定而理想的位置是正畸治療后的關(guān)注重點(diǎn)，機(jī)械保持需長(zhǎng)期使用，舒適度差；牙周手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)性高，患者接受度較低[4]。近年來，藥物治療成為研究熱點(diǎn)，研究報(bào)道顯示，黃芩苷可抑制炎癥因子，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，保護(hù)牙周膜細(xì)胞[5]。本文觀察黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持階段VEGF、BMP-2和IL-1β表達(dá)的影響，旨在探討黃芩苷對(duì)牙周組織改建的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠80只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量(100±10)g，由北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供(合格證號(hào)：Scxk(京)-2002-0003)，嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品：黃芩苷購(gòu)自北京生物制品檢驗(yàn)所(純度>99%)，取黃芩苷10 g，加注射用水適量懸浮浸潤(rùn)，滴加2 mol/L氫氧化鈉溶液使黃芩苷溶解，配制成10 g/L的黃芩苷貯存液備用。

1.1.3 試劑與儀器：牙釉質(zhì)粘結(jié)劑(杭州西湖生物材料有限公司)；速眠新(吉林省敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司)；多聚甲醛(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；VEGF抗體、BMP-2抗體和IL-1β抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；VEGF、BMP-2和IL-1β ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

正畸用測(cè)力計(jì)(杭州奧索醫(yī)療器械有限公司)，YJZ-100型高速渦輪牙鉆機(jī)(上海泰益醫(yī)療儀器設(shè)備有限公司)，高速渦輪牙鉆手機(jī)(日本NSK公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 按照隨機(jī)數(shù)字表法將80只SD大鼠分為空白組(A組)、牙周炎模型組(B組)、對(duì)照組(C組)和觀察組(D組)4組，每組20只。A組不作任何處理，后采用心臟灌注法處死，制作組織學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行免疫組化染色。B組大鼠建立牙周炎模型后采用心臟灌注法處死，制作組織學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行免疫組化染色。C組大鼠建立牙周炎模型，繼而建立牙移動(dòng)模型，于加力裝置去除前一天開始腹腔注射生理鹽水，1次/天，分別于1、3、6、12、18d時(shí)心臟灌注處死，制作組織學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行免疫組化染色。D組大鼠建立牙周炎模型，繼而建立牙移動(dòng)模型，于加力裝置去除前1天開始腹腔注射黃芩苷溶液40mg/kg，1次/天，分別于1、3、6、12、18d時(shí)心臟灌注處死，制作組織學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.2 大鼠牙周炎模型建立：大鼠肌內(nèi)注射0.25 mL/kg速眠新麻醉，動(dòng)物麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，采用高速渦輪牙鉆機(jī)

在大鼠上頜雙側(cè)第一磨牙近中頰側(cè)牙頸部磨一淺的固位溝，用口腔正畸結(jié)扎鋼絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第二磨牙牙頸部1圈。術(shù)后給予高糖飲食，喂養(yǎng)軟食，30 d后形成大鼠牙周炎模型[6]。

1.2.3 大鼠牙移動(dòng)模型建立：牙周炎模型大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，用高速渦輪牙鉆機(jī)在大鼠上頜2顆切牙遠(yuǎn)中磨一淺的固位溝，用結(jié)扎絲將螺旋彈簧的一端結(jié)扎于上頜第一磨牙牙頸部固位溝，另一端結(jié)扎在上頜切牙固位溝內(nèi)牽引上頜雙側(cè)第一磨牙近中移動(dòng)，清潔后酸蝕2顆切牙結(jié)扎絲周圍牙面，干燥后用釉質(zhì)粘結(jié)劑固定，共持續(xù)18d[7]。

1.2.4 牙移動(dòng)后保持階段動(dòng)物模型建立：牙移動(dòng)結(jié)束后去除大鼠口內(nèi)加力裝置，以左側(cè)上頜牙弓作為實(shí)驗(yàn)的保持側(cè)，以結(jié)扎絲連扎于左側(cè)上頜第一磨牙和切牙之間，切牙結(jié)扎處涂布粘結(jié)劑固定，分別保持1、3、6、12、18d[8]。

1.2.5 免疫組化染色：各組大鼠灌注結(jié)束后解剖取出上頜骨，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h。之后浸泡于10% EDTA液中于4 ℃脫鈣約30 d。PBS沖洗干凈組織塊后石蠟包埋，從腭側(cè)向頰側(cè)的方向進(jìn)行切片，選擇斷面為完整牙周韌帶的切片進(jìn)行觀察，進(jìn)行免疫組化染色。觀察各組大鼠牙周組織IL-1β、BMP-2和VEGF的水平變化。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠牙周組織中BMP-2免疫組化染色結(jié)果分析 胞質(zhì)內(nèi)BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞以淡黃色和棕褐色顆粒為主，胞核和胞膜上少見。見圖1?？瞻捉M大鼠BMP-2陽(yáng)性表達(dá)不高，模型組BMP-2表達(dá)增強(qiáng)，牙槽骨表面可見新骨形成。對(duì)照組和觀察組牙周組織BMP-2的表達(dá)在加力結(jié)束后逐漸降低，但相同時(shí)間點(diǎn)比較，觀察組BMP-2表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠牙周組織BMP-2免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.1 BMP-2 immunohistochemical staining results in periodontal tissues of rats(×200)

組別 只數(shù)BMP-2表達(dá)1d3d6d12d18d空白組460.33±2.14 64.92±2.89 68.31±3.02 90.04±2.78 93.21±2.51 模型組4265.31±3.57269.41±3.01274.98±2.35277.36±3.49284.56±2.69對(duì)照組4133.06±0.97126.94±1.56118.90±1.47111.91±2.25108.89±1.38觀察組4139.18±1.01*130.85±1.21*125.01±3.24*116.76±1.90*112.89±1.51*

*P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group

2.2 牙周組織中VEGF免疫組化染色結(jié)果分析 光學(xué)顯微鏡下觀察可見，胞質(zhì)內(nèi)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞以淡黃色和棕褐色顆粒為主，胞核和胞膜上未見明顯染色，主要分布于牙周膜、血管內(nèi)壁和牙髓腔中，見圖2。對(duì)照組和觀察組牙周組織VEGF表達(dá)量在加力結(jié)束后均較模型組顯著降低，相同時(shí)間點(diǎn)比較，觀察組VEGF表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

圖2 各組大鼠牙周組織VEGF免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.2 VEGF immunohistochemical staining resultsin periodontal tissues of rats(×200)

組別 只數(shù)VEGF表達(dá)1d3d6d12d18d空白組476.35±4.0280.21±3.9883.51±2.9686.73±3.1187.21±2.65模型組4205.76±3.11211.84±2.81218.29±1.87226.33±2.65231.57±3.07對(duì)照組4121.93±1.51116.85±1.26112.80±1.50107.79±1.29104.79±1.27觀察組4127.95±1.53*122.03±1.49*118.81±1.24*109.97±1.72*109.97±1.72*

*P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group

2.3 牙周組織中IL-1β免疫組化染色結(jié)果分析 光學(xué)顯微鏡下觀察，胞質(zhì)內(nèi)IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞以淡黃色和棕褐色顆粒為主，胞核和胞膜上未見。IL-1β表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞及中性粒細(xì)胞。由圖3可見，空白組未見明顯陽(yáng)性染色，模型組IL-1β陽(yáng)性表達(dá)明顯增多。對(duì)照組和觀察組牙周組織IL-1β表達(dá)量在加力結(jié)束后逐漸降低，相同時(shí)間段組比較，觀察組IL-1β表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

圖3 各組大鼠牙周組織IL-1β免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.3 IL-1β immunohistochemical staining resultsin periodontal tissues of rats(×200)

組別 只數(shù)IL-1β表達(dá)1d3d6d12d18d空白組487.32±2.0990.21±1.8783.57±1.6792.14±2.3596.31±1.93模型組4245.91±3.08263.84±2.68258.27±2.31273.41±1.95283.15±3.22對(duì)照組4116.97±1.10121.18±1.19125.10±1.54127.82±1.27132.01±1.16觀察組4112.21±1.34*117.78±1.30*121.00±1.28*123.93±1.56*127.13±1.33*

*P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group

3 討論

近年來，成人正畸患者數(shù)急劇增加，大部分具有不同程度的牙周病損。牙周病已成為影響人類口腔健康的主要疾病，在全球范圍內(nèi)具有極高的患病率，而我國(guó)患病率更是高達(dá)95%。牙周炎的主要特征是牙周袋形成和袋壁的炎癥、牙槽骨吸收，可導(dǎo)致患者牙齒松動(dòng)和移位，繼發(fā)畸形和殆創(chuàng)傷，是成人牙齒喪失的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康[9]。目前，正畸治療是牙周病治療的重要手段。眾多研究顯示，藥物治療可達(dá)到控制牙齒移動(dòng)，增加支持的目的。

黃芩苷是從唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中提取而來，屬于黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黃芩苷生物活性顯著，具有解熱、降壓、利尿、抗菌、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等多種作用[10-11]。近年來，通過不斷探索黃芩苷對(duì)牙周炎的作用發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可保護(hù)牙周膜成纖維細(xì)胞，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，抑制TNF-α，降低IL-6含量[12]。此外，黃芩苷對(duì)LPS介導(dǎo)的IL-1β也有抑制作用，顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及其膠原蛋白合成。

VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌骨生長(zhǎng)因子，刺激成骨細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。此外，VEGF還可能與成骨細(xì)胞遷移和分化相關(guān)，參與骨改建。BMP-2屬于TGF-β超家族成員，決定骨祖細(xì)胞分化，是一種高效的骨誘導(dǎo)物質(zhì)，可誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞系分化，加速礦化結(jié)節(jié)形成，參與牙齒移動(dòng)過程中的骨改建[14]。因此，BMP-2可用來衡量骨形成是否活躍。IL-1是炎性因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始動(dòng)因子，其中IL-1β對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和心血管疾病具有重要調(diào)節(jié)作用。IL-1β是牙周炎的破壞因子，具有催化牙槽骨吸收的作用。眾多研究顯示，IL-1β可刺激骨吸收，抑制骨形成，抑制金屬蛋白酶組織抑制因子，從而導(dǎo)致結(jié)締組織降解[15]。因此，本文以VEGF、BMP-2和IL-1β作為檢測(cè)指標(biāo)評(píng)價(jià)黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持階段牙周組織抗炎方面的骨改建作用。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組和觀察組牙周組織BMP-2和VEGF表達(dá)量在加力結(jié)束后呈逐漸減少的趨勢(shì)，相同時(shí)間點(diǎn)比較，實(shí)驗(yàn)組BMP-2和VEGF表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。而對(duì)照組和觀察組牙周組織IL-1β表達(dá)量在加力結(jié)束后逐漸增加，相同時(shí)間點(diǎn)比較，實(shí)驗(yàn)組IL-1β表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。綜上所述，黃芩苷可顯著減少牙周炎大鼠牙移動(dòng)后牙周組織中IL-1β表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，抑制骨吸收；增加牙周組織中BMP-2和VEGF表達(dá)，促進(jìn)牙周組織血管形成和成熟，這可能是黃芩苷促進(jìn)牙周炎大鼠正畸牙移動(dòng)后保持階段內(nèi)牙周組織改建的作用機(jī)制之一。

[1] 鄒亞光，毛向明，黃琪，等.正畸患者牙周炎的中藥輔助治療及機(jī)制研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(8)：1663-1667.

[2] 郭秋曼束蓉.不同類型牙周炎患者牙齦組織中 IL-17 的表達(dá)研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，34(10)：1525-1528.

[3] 桂湧，馮琛琛.牙周-牙髓聯(lián)合治療重度牙周炎的療效分析[J].上?？谇会t(yī)學(xué)，2014，23(4)：457-459.

[4] 董愛芬.基礎(chǔ)治療與牙周手術(shù)對(duì)慢性牙周炎患者血清腫瘤壞死因子及齦溝液中病原菌的影響 [J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23(13)：3173-3173.

[5] 李成章，曹正國(guó)，楊茹，等.黃芩苷對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞 pro-MMP-1 和 MMP-3 表達(dá)的影響[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，39(3)：197-200.

[6] Fischer RG,Klinge B.Clinical and histological evaluation of ligature-inducedperiodontitis in the domestic ferret[J].J Clin Periodontol,1994,21(4):230-239.

[7] King GJ,Keeling SD,McCoy EA,et al.Measuring dental drift and orthodontic tooth movement in response to various initial forces in adult rat[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop,1991,99(5):456-465.

[8] 劉世穎，陳遠(yuǎn)萍，劉天悅，等.實(shí)驗(yàn)性正畸牙移動(dòng)保持期動(dòng)物模型的建立[J].中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2009，2(9)：537-539.

[9] 鄭瑤，焦榮紅，程潔，等.牙周非手術(shù)治療對(duì)重度牙周炎患者 C 反應(yīng)蛋白和血管內(nèi)皮功能的影響[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(6)：822-823.

[10] 李倩楠，葛曉群.黃芩苷的解熱作用及對(duì)細(xì)胞因子的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2010(8)：1068-1072.

[11] 朱偉，孫紅光，朱迅.黃芩苷元對(duì)炎癥反應(yīng)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(2)：194-197.

[12] 王國(guó)芳，吳織芬，牛兵.淫羊藿苷，黃芩苷和大黃素聯(lián)合作用對(duì)牙周炎大鼠牙周組織中 RANKL 和 OPG 表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(10)：2556-2558.

[13] 劉元標(biāo).血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與血管新生[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2004，19(5)：396-400.

[14] 崔大平，趙德偉.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 聯(lián)合修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)股骨頭壞死[J].中國(guó)組織工程研究，2011，15(1)：37-40.

[15] 欒朝霞，裴著果.白介素-1 和血小板源性生長(zhǎng)因子對(duì)血管平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1 表達(dá)的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2004，20(2)：115-116.

(編校：王儼儼)

Effect of baicalin on expression of VEGF, BMP-2 and IL-1β in rat mobile dental periodontitis maintained phase

LI Ling

(Department of Stomatology, People’s Hospital of Laiwu City, Laiwu 271199, China)

ObjectiveTo observe effect of baicalin on VEGF, BMP-2 and IL-1β expression in rat mobile dental periodontitis maintained phase, and explore the mechanism of baicalin on periodontal tissue remodeling.Methods80 SD rats were randomly divided into four groups,20 rats in each group. The blank group weren’t giren any treatment, model group were built with periodontitis, control group and observation group were built with periodontitis and then tooth movement model. The observation group were given baicalin, blank group and control group were given the same volume of saline. The rats were killed at 1d, 3d, 6d, 12d, 18d, then samples of the maxilla were taken to make tissue sections and immunohistochemical staining. VEGF, BMP-2 and IL-1β expression were observed in periodontal tissue.ResultsThe BMP-2 expression isn’t obvious in blank group, but was obvious in model group, and gradually reduced at the end of the afterburner; BMP-2 expression in experimental group were higher than that in control group at the same point (P<0.05). The VEGF expression in control group and experimental group gradually reduced at the end of the afterburner; VEGF expression in experimental group were lower than that in control group at the same point (P<0.05). The IL-1β expression wasn’t obvious in blank group, but was obvious in model group. The IL-1β expression in control group and experimental group gradually reduced at the end of the afterburner; IL-1β expression in experimental group were lower than that in control group at the same point (P<0.05).ConclusionBaicalin can significantly increase the expression of IL-1β in periodontal tissues of periodontitis rats after moving teeth, reduce inflammation, inhibit bone resorption, and also increase BMP-2 and VEGF expression, promote periodontal vessel formation and maturation, which may be one of the mechanisms of baicalin to promote periodontal tissue remodeling in periodontitis rats at holding phase after orthodontic tooth movement.

periodontitis; baicalin; VEGF; BMP-2; IL-1β

李玲，女，主治醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：口腔，E-mail：liling15763499755@163.com。

R781.42

A

1005-1678(2015)03-0032-04