加味真武湯對阿霉素誘導心衰大鼠模型的保護作用及其機制

游廣輝

(鄭州人民醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450003)

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加味真武湯對阿霉素誘導心衰大鼠模型的保護作用及其機制

游廣輝Δ

(鄭州人民醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450003)

目的 研究加味真武湯對阿霉素誘導的大鼠心衰模型的保護作用并探討其機制。方法 尾靜脈注射阿霉素建立心衰模型，于1、3、5周注射阿霉素3 mg/kg，于2、4、6周尾靜脈注射阿霉素2 mg/kg，共注射6次。60只大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組，模型組，加味真武湯高、中、低劑量組(40、20、10 g生藥/kg，灌胃)，氫氯噻嗪(陽性藥物)組(10.78 mg/kg，灌胃)。觀察動物一般狀況，24 h尿量、尿液中Na+、K+及Cl-含量，比較各組心功能，血漿中血管緊張素(angiotensin，AngⅡ)、醛固酮(aldosterone，ALD)、抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)含量的變化。大鼠處死后取心臟，常規(guī)HE染色，進行病理組織學檢查。結(jié)果 給予加味真武湯后，給藥組大鼠攝食、活動等較未給藥前改善。與模型組相比，加味真武湯高、中、低劑量組24h尿量、尿液中Na+及K+含量均不同程度增加(P<0.05)，但Cl-含量無顯著變化，降低左心室舒張末期壓力(left ventricular end dilated pressure，LVEDP)，升高左室內(nèi)壓峰值(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)及左室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)(P<0.05)，降低AngⅡ、ADH及ALD水平(P<0.05)。病理結(jié)果顯示，模型組心肌細胞明顯受損并有單核、淋巴細胞浸潤，高劑量組、陽性組心肌細胞基本恢復正常，中、低劑量組有一定程度的改善。結(jié)論 加味真武湯改善心衰大鼠的心功能，此作用可能與其降低AngⅡ、ALD、ADH水平，促進Na+、K+排泄，從而增加尿量有關。

加味真武湯；心衰；大鼠；保護作用

充血性心力衰竭是由多種病因所致的心臟排血功能不足，無法滿足機體各組織的需要，以致血液和體液的瘀積，出現(xiàn)氣急、水腫等臨床癥狀。中醫(yī)認為心衰的病因多半為心腎陽虛，血瘀水停之癥[1]。真武湯源自《傷寒論》，是公認的治療少陰陽虛水泛之癥的良方，廣泛應用于臨床以水液代謝失調(diào)為主的病癥，前人雖對真武湯利水作用機制進行過探討[2]，但未見對真武湯治療充血性心力衰竭進行系統(tǒng)、深入的機制方面的探討。本研究根據(jù)經(jīng)典的真武湯方子，依據(jù)文獻[3]制成加味真武湯，本文擬研究加味真武湯對阿霉素心衰模型大鼠的作用并首次從利尿角度探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠60只，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由河南省實驗動物中心提供，質(zhì)量合格證號41003100000439。本實驗遵循《實驗動物保護條例》相關規(guī)定。

1.1.2 試劑與儀器：注射用鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：121104)，以0.9%NaCl配制成1.5 mg/mL及1.0 mg/mL濃度備用。氫氯噻嗪片(常州制藥有限公司，批號：12061712)，以0.5%的CMC-Na配制成5.39 mg/ mL混懸液備用。戊巴比妥鈉(德國Merck公司，批號：K2208)，肝素鈉(常州千紅生化制藥股份有限公司，批號：130606)，加味真武湯劑(組方：附子12 g，桂枝10 g，人參10 g，黃芪15 g，茯苓15 g，芍藥12 g，白術15 g，生姜15 g，川穹15 g，丹參18 g，澤瀉10 g)由鄭州人民醫(yī)院藥劑科加工，生藥濃度為3 g/mL。HE染色液(北京索萊寶科技有限公司)，ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

RM-6240型多道生理記錄儀(成都儀器廠)，A3原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，ICS-90離子色譜儀(賽默飛世爾科技公司)，H1-Synegy型多功能酶標儀(Gene Company Limited)，LEICA RM2235型生物組織切片機(德國LEICA公司)，XSP-24N型光學顯微鏡(南京江南光電集團股份有限公司)，DM-BA300數(shù)碼生物顯微鏡(廈門麥克奧迪公司)。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素模型的制備：正式實驗前1個月先進行預實驗，取10只動物按文獻方法[4-6]用阿霉素尾靜脈注射造模，即分別于1、3、5周尾靜脈注射阿霉素溶液3 mg/kg，于第2、4、6周尾靜脈注射阿霉素2 mg/kg，共注射6次。造模結(jié)束頸總動脈插管測動物心功能，取心臟，常規(guī)HE染色，進行病理組織學檢查。以心功能嚴重下降，病理鏡檢心肌呈慢性心衰樣病變?yōu)樵炷３晒酥?。本實驗中造模成功率約為90%。

60只大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組，模型組，加味真武湯高、中、低劑量組，氫氯噻嗪(陽性藥物)組。除空白對照組外，其余5組按上述方法造模?？瞻讓φ战M尾靜脈注射等體積0.9%NaCl溶液，尾靜脈注射體積約為0.2 mL/100g體質(zhì)量。

1.2.2 給藥途徑及劑量：于末次注射阿霉素后給予藥物進行干預。空白對照組和模型組給予0.5% CMC-Na，加味真武湯高、中、低劑量組給予40、20、10 g生藥/kg，氫氯噻嗪組給予氫氯噻嗪片10.78 mg/kg，共給藥2周。使用0.5%的CMC-Na稀釋混懸生藥原液及氫氯噻嗪片，灌胃給藥，給藥容積約為2 mL/200 g體質(zhì)量。

1.2.3 觀測指標：

①一般情況：給藥期間觀察動物的一般活動及生存率；

② 24 h尿量及尿液中Na+、K+及Cl-濃度檢測：給藥結(jié)束后用大鼠代謝籠收集24 h尿液，原子吸收分光光度計測尿液中Na+、K+的濃度，離子色譜儀測Cl-濃度；

③ 心功能指標檢測：用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉動物，頸總動脈插管，用多道生理記錄儀記錄左心室舒張末期壓力(left ventricular end dilated pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓峰值(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室壓力上升最大速率+dp/dtmax及左室壓力下降最大速率-dp/dtmax；

④ 血管緊張素(angiotensin，AngⅡ)、醛固酮(ALD)、抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)含量檢測：腹主動脈取血5 mL，EDTA抗凝，1000 g離心10 min，按照雙抗兩步夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色，450 nm處測血漿中AngⅡ、ALD、ADH的含量；

⑤ HE染色：處死大鼠后，快速取出心臟置于0.9%NaCl溶液中洗去血液。取心室心肌組織4%多聚甲醛固定液內(nèi)，常規(guī)石蠟包埋，取左心室肌切片，進行HE染色，光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 真武湯對阿霉素心衰大鼠一般狀態(tài)的影響 自造模第6天起，除對照組外，各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的進食減少，被毛無光澤、體質(zhì)量下降，自發(fā)活動減少等現(xiàn)象，以模型組為甚。實驗過程中，模型組有2只大鼠死亡，中、低劑量組各有1只動物死亡，解剖發(fā)現(xiàn)動物有明顯腹水、脹氣。給予加味真武湯后，給藥組存活動物攝食、活動較未給藥前改善。

2.2 加味真武湯對阿霉素心衰大鼠24 h尿量和尿液中Na+、K+、Cl-含量的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠24 h尿量、尿液中Na+、K+的含量顯著降低，Cl-含量顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，加味真武湯高、中、低劑量及氫氯噻嗪組24 h尿量、尿液中Na+及K+含量均顯著增加(P<0.01)。氫氯噻嗪組尿液中Cl-含量顯著增加(P<0.01)。見表1。

表1 加味真武湯對阿霉素心衰大鼠24 h尿量和尿液中Na+、K+、Cl-含量的影響Tab.1 Effect of Jiawei Zhenwu decoction on 24h urine volume, Na+, K+ and Cl- contents of rats with heart failure induced by adriamycin(±s)

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with blank control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.3 加味真武湯對阿霉素心衰大鼠心功能的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠LVEDP明顯升高(P<0.05)，LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均顯著降低(P<0.01)。加味真武湯高、中劑量及氫氯噻嗪組均可明顯降低LVEDP，升高LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax(P<0.01)。加味真武湯低劑量組顯著升高LVSP、降低LVEDP(P<0.01)，但對+dp/dtmax及-dp/dtmax無顯著影響。此結(jié)果顯示加味真武湯可改善阿霉素心衰大鼠心功能，具有一定的劑量依賴性。見表2。

表2 加味真武湯對阿霉素心衰大鼠心功能的影響

**P<0.01，與空白對照組比較，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.4 加味真武湯對阿霉素心衰大鼠血漿中AngⅡ、ALD及ADH的含量的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠血漿中AngⅡ、ALD及ADH的含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，加味真武湯高、中劑量組及氫氯噻嗪組AngⅡ、ADH及ALD水平顯著降低(P<0.01；P<0.05)。加味真武湯低劑量組顯著降低AngⅡ、ADH水平(P<0.01)，但對ALD水平無顯著影響。見表3。

表3 加味真武湯對阿霉素心衰大鼠血漿AngⅡ、ALD及ADH含量的影響Tab.3 Effect of Jiawei Zhenwu decoction on AngⅡ, ALD and ADH contents of rats with heart failure induced by adriamycin(±s)

**P<0.01，與空白對照組比較，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.5 加味真武湯對大鼠心肌細胞的影響 病理鏡檢結(jié)果顯示，空白對照組大鼠心肌細胞排列整齊，無心肌纖維的破壞，細胞間隙正常，未見水腫(見圖1A)。模型組心肌細胞多灶性肌漿溶解，有不同程度的顆粒變性與空泡變性，細胞間隙明顯增寬，受累較重的心肌細胞肌原纖維溶解消失，呈小灶狀或片狀壞死，心肌壞死灶內(nèi)可見單核、淋巴細胞浸潤(見圖1B)。各給藥組心肌細胞損害程度較模型組有不同程度的減輕。高劑量組、陽性組僅見心肌纖維顆粒變形，未見肌漿壞死溶解和炎性浸潤，基本恢復正常(見圖1C、1D)。中劑量組、低劑量組心肌細胞多灶性壞死溶解、炎性細胞浸潤等病變程度較模型組減輕，有一定程度的改善(見圖1E、1F)。

圖1 大鼠心肌病理切片HE染色結(jié)果(HE，×400)Fig.1 HE staining result of myocardial pathological section of rats(HE，×400)

3 討論

充血性心力衰竭屬心悸、胸痹、喘癥、水腫等范疇，為臨床常見病及多發(fā)病?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》名之曰“水”。所論“水”之驚悸，喘呼、咳喘不能平臥、臥則喘甚，足脛腫，甚則腹大，頸脈張而動等癥狀，極符合現(xiàn)代所論之心衰[7-8]。真武湯是醫(yī)圣張仲景《傷寒論》中溫陽利水代表方，主治“少陰病陽虛水泛證”。充血性心力衰竭心排出量不足時，末梢循環(huán)減弱，與少陰病心腎陽虛推血無力，陽氣不能溫煦四肢的見癥是相同的[9]。據(jù)此許多學者應用真武湯治療CHF取得了顯著療效[10]。加味真武湯在經(jīng)典組方茯苓、附子、白術、生姜、白芍的基礎上加入桂枝、人參、川芎、丹參、黃芪等組成。諸藥相伍溫中有散，利中有化，脾腎雙補，陰水得制，具有益氣溫陽、強心活血利水、標本兼治的功效[3]。

經(jīng)過造模后阿霉素模型組大鼠心功能降低(P<0.01)，尿量減少(P<0.01)，Na+、K+排出減少(P<0.01)，AngⅡ、ALD、ADH增高(P<0.01)，結(jié)合病理結(jié)果提示用阿霉素制作心衰模型是成功的。本試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療后阿霉素心衰大鼠心功能明顯改善，左心收縮功能、舒張功能明顯上升(P<0.01)。

本試驗所用對照藥物氫氯噻嗪為中效利尿劑，長期應用可減輕心臟負荷，臨床上常用于充血性心力衰竭的治療。本試驗發(fā)現(xiàn)加味真武湯和氫氯噻嗪均可增加阿霉素所致的心衰大鼠24h尿量(P<0.05)，且加味真武湯高劑量的利尿作用與氫氯噻嗪相當，具有一定的劑量依賴性。對尿液離子含量的測定發(fā)現(xiàn)，加味真武湯中、高劑量組和氫氯噻嗪可明顯促進心衰大鼠尿液中Na+、K+的排泄作用(P<0.05)，與文獻的研究一致[2]。本研究未見尿液Cl-的含量有明顯改變。

影響尿液生成的因素較多，本試驗以影響尿液生成的主要體液因子作為研究對象探討加味真武湯利尿作用的機制。已知醛固酮(ALD)是一種類固醇激素，具有保鈉排鉀作用?？估蚣に?ADH)由下丘腦分泌，主要作用是提高遠曲小管和集合管對水的通透性，促進水的吸收，是尿液濃縮和稀釋的關鍵性調(diào)節(jié)激素。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有強烈的縮血管作用，并通過增加醛固酮的分泌具有水鈉潴留作用，在心衰發(fā)生過程中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)加味真武湯各劑量組及氫氯噻嗪可不同程度減少AngⅡ、ALD及ADH的含量(P<0.05)。AngⅡ分泌的減少可抑制醛固酮的分泌，2者分泌量的減少均會促進鈉和水的排泄，減少水鈉潴留，減輕心衰大鼠的心臟負荷。AngⅡ分泌的減少會抑制ADH的分泌，從而降低遠曲小管和集合管對水的通透性，使水的重吸收減少，尿液體積增加。故而解釋了加味真武湯對心衰大鼠尿量增加及尿液中鈉、鉀排出的增加。本試驗中加味真武湯對氯離子未見明顯影響，其機制仍待進一步研究。

綜上所述，加味真武湯各劑量組不同程度改善心衰大鼠的心功能，可能與其降低AngⅡ、ALD、ADH水平，促進Na+、K+排泄，從而促進尿液的排出有關。

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(編校：王儼儼)

Protective effects of Jiawei Zhenwu decoction on rats with heart failure induced by adriamycin and its mechanism

YOU Guang-huiΔ

(Department of Pharmacy, Zhengzhou City People’s Hospital, Zhengzhou 450003, China)

ObjectiveTo explore the protective effects of Jiawei Zhenwu decoction on rats with heart failure induced by adriamycin and its mechanism.MethodsThe heart failure was established with adriamycin by tail intravenous injection. 3 mg/kg of adriamycin was injected on 1st, 3rdand 5thweek and 2 mg/kg of adriamycin was injected on 2nd, 4thand 6thweek, a total of 6 times. 60 rats were randomly divided into six groups, 10 rats in each group: blank control group, model group, low-, middle- and high-does Jiawei Zhenwu decoction(40,20,10 g/kg, intragastric administration), and hydrochlorothiazide group(positive drug group, 10.78 mg/kg, intragastric administration). The overt behavior was observed and 24 h urine volume, Na+, K+and Cl-content in urine, cardiac function and levels of angiotensin(AngⅡ), aldosterone(ALD) and antidiuretic hormone(ADH) in plasma were compared among each group.After the rat were sacrificed, the heart was taken out and stained by HE to analyse histopathologic examination. ResultsThe spontaneous activity and ingestion of rats improved after given Jiawei Zhenwu decoction. The 24h urine volume, Na+, K+content in urine increased of low-, middle- and high-does Jiawei Zhenwu decoction at different degrees(P<0.05), while there were no significant changes of Cl-contents; left ventricular end dilated pressure(LVEDP) decreased, left ventricular systolic pressure(LVSP), +dp/dtmaxand -dp/dtmaxincreased in low-, middle- and high-does Jiawei Zhenwu decoction at different degrees(P<0.05); the plasma levels of angiotensin(AngⅡ), aldosterone(ALD) and antidiuretic hormone(ADH) decreased(P<0.05).The pathological examination result showed that there was significant damage of myocardial cell and infiltration of monocyte and lymphocyte, myocardial cell of high-dose group almost returned to normal and middle-and low-dose group have improvement to some extent.ConclusionJiawei Zhenwu decoction could improve cardiac function, which may be related with the reduction of AngⅡ, ALD and ADH levels and promoting the excretion of Na+, K+so as to increase urine volume.

Jiawei Zhenwu decoction; heart failure; rats; protective effect

游廣輝，通信作者，男，本科，主管藥師，研究方向：藥學，E-mail：313397265@qq.com。

R541.6+1

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1005-1678(2015)11-0033-04