三黃瀉心湯有效成分逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)急性腎損傷的機制研究

白羽，肖簫，薛瑩雪，張楠，徐廣宇

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；3.北華大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

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三黃瀉心湯有效成分逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)急性腎損傷的機制研究

白羽1，肖簫1，薛瑩雪1，張楠2，徐廣宇3Δ

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；3.北華大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的 研究三黃瀉心湯有效成分對脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導(dǎo)急性腎損傷的逆轉(zhuǎn)機制。方法 將C57BL/6小鼠隨機分為6組：對照組、LPS組、大黃酸組、小檗堿組、黃芪苷組和地塞米松組，每組8只，對照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL，其余各組腹腔注射LPS(0.1 mL/g)。除LPS組外，其余各組在注射LPS 2 h之前分別注射大黃酸(0.1 mL/g)、小檗堿(0.1 mL/g)、黃芩苷(0.1 mL/g)、地塞米松(0.001 mL/g)。作用1 d后斷頭處死小鼠并采血，使用診斷試劑盒及全自動生化分析儀檢測尿素氮及肌酐情況；酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對血清中TNF-α和IL-6濃度進(jìn)行定量；取腎臟組織進(jìn)行HE染色及免疫組化；Western blot法檢測凋亡蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，其余各組小鼠血中的尿素氮、肌酐、TNF-α和IL-6含量明顯下降(P<0.05)。HE染色見LPS處理的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、脫落，管腔狹小且出現(xiàn)管型及滲出物，腎間質(zhì)水腫，有炎癥細(xì)胞的浸潤。而其余各組與LPS相比上述癥狀均明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示LPS組Bax、Caspase3的表達(dá)明顯增多，而其余各組的表達(dá)減少。但Bcl-2在LPS組明顯減少，在其余各組卻增多。Western blot結(jié)果顯示LPS組凋亡蛋白Bax、Cleave-caspase3、CytoC表達(dá)增多，而其余各組較LPS組減少。但Bcl-2在LPS組表達(dá)減少而在其余各組的表達(dá)增多。結(jié)論 三黃瀉心湯有效成分能逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷，其作用機制與糖皮質(zhì)激素地塞米松的作用相類似。

三黃瀉心湯；大黃酸；小檗堿；黃芩苷；急性腎損傷

急性腎損傷是由多種治病因素導(dǎo)致的腎功能急劇惡化的臨床急癥，部分繼發(fā)于腎臟基礎(chǔ)疾病，但也常常由腎外因素所導(dǎo)致[1]。由于起病后腎功能急轉(zhuǎn)直下，常常導(dǎo)致臨床治療難以趕上腎功能惡化的速度，因而病死率極高。近年來提出的急性腎損傷治療方案主要以血液凈化及皮質(zhì)醇激素治療為主，但這些治療費用昂貴，亦或副作用較多，使臨床治療陷入了僵局[2-3]。三黃瀉心湯的有效成分為大黃酸、小檗堿和黃芪苷，具有抗氧化應(yīng)激，清除炎性介質(zhì)的作用[4]。本實驗旨在通過研究三黃瀉心湯有效成分對急性腎損傷的逆轉(zhuǎn)作用，為臨床中急性腎損傷的救治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇4～6周雄性C57BL/6小鼠48只，體質(zhì)量18～20 g，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：SCXK-(吉)2003-0001。

1.2 藥品與試劑 大黃酸、小檗堿、黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為0757-200405、110713-200208、110715-200514)；地塞米松(山東新華有限公司，批號：37020644)；LPS(英國Sigma公司，110M4086V)。

組織裂解液RIPA(購自北京諾博萊德科技有限公司)；NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒(購自上海索萊寶生物科技有限公司)；Bax、Bcl-2、CytoC、caspase3、β-actin抗體(購自Santa Cruz Biotechnology)；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(購自美國R&D公司)；肌酐、尿素氮試劑盒(購自南京建成生物科技公司)；免疫組化試劑(購自北京中杉公司)。

1.3 主要實驗儀器 臺式控溫離心機(德國Eppendorf公司)；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜裝置(上海儀器總場)；倒置顯微鏡、全自動顯微鏡數(shù)碼攝像機(日本OLYMPUS)；電泳儀(美國Bio-rad)。

1.4 方法 取大黃酸1 mg溶于10 μL 1 mol/LNaOH中，加90 μL PBS中低溫保存，使用時稀釋1000倍。分別取小檗堿、黃芩苷1 mg溶于100 μL DMSO中，低溫保存使用前稀釋1000倍。1 mg LPS溶于1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，地塞米松為原液(5 mg/mL)。

1.4.1 實驗分組：參照陳燕[5]對急性腎損傷小鼠模型的構(gòu)造并稍作修改，將48只C57BL/6小鼠，隨機分為6組(n=8)，即對照組、LPS組、大黃酸組、小檗堿組、黃芪苷組和地塞米松組。對照組小鼠給予腹腔注射0.5 mL生理鹽水，其余各組給予腹腔注射LPS(0.1 mL/g)。其中大黃酸組、小檗堿組、黃芪苷組在注射LPS 前2 h分別給予腹腔注射大黃酸、小檗堿、黃芪苷0.1 mL/g。地塞米松組在注射LPS前2 h腹腔注射地塞米松0.001 mL/g。各組在LPS注射1 d后斷頭處死小鼠。收集血液1.5 mL以備生化及炎癥因子等檢測使用，分別取6組腎臟組織凍存固定，以備后續(xù)試驗使用。

1.4.2 檢測血液生化指標(biāo)及血清中TNF-α和IL-6的含量：將上述步驟制備的小鼠血液置于室溫3000 r/min離心10 min，得到血清樣本，使用診斷試劑盒及全自動生化分析儀檢測尿素氮及肌酐情況。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書的步驟，對血清中TNF-α和IL-6濃度進(jìn)行定量。

1.4.3 腎臟組織HE染色及凋亡蛋白表達(dá)的測定：將保存的小鼠腎臟組織固定后，通過HE染色方法用倒置顯微鏡(×400)觀察各組腎臟組織的形態(tài)。腎臟組織的凋亡蛋白的表達(dá)采用免疫組化法測定Bax、Bcl-2、Cyto C、Caspase3的表達(dá)，并在顯微鏡觀察組織中蛋白表達(dá)情況。

1.4.4 Western blot檢測：參照陳燕[5]的方法并稍作修改對小鼠的腎臟進(jìn)行Western blot檢測。腎臟總蛋白、胞漿及胞核蛋白的提?。簩?00 mg腎臟組織用液氮處理后研磨成粉末，移至離心管。向離心管中加入800 μL組織裂解液RIPA。冰上孵育10 min后置于室溫10 min，于4 ℃，12000 r/min，離心20 min。收集上清液后分裝。于-80 ℃保存。參照NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒說明書的步驟提取細(xì)胞核和胞漿蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白濃度測定采用二喹啉甲酸法測定細(xì)胞漿、細(xì)胞核提取物及總蛋白。之后配置聚丙烯酰胺凝膠，依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL顯色。使用GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)對特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以β-actin或LaminB1作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)及TNF-α和IL-6含量的測定 與對照組相比，LPS組中尿素氮、肌酐、TNF-α和IL-6顯著升高(P<0.05)，表明急性腎損傷模型復(fù)制成功。與LPS組相比，大黃酸組、小檗堿組、黃芪苷組、地塞米松組的尿素氮、肌酐、TNF-α和IL-6均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組尿素氮、肌酐、TNF-α和IL-6比較Tab.1 Comparison of urea nitrogen, serum creatnine, TNF-α and IL-6 of every ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group；#P<0.05，與LPS組相比，compared with LPS group

2.2 腎臟組織HE染色及凋亡蛋白表達(dá)的測定 光鏡下觀察HE染色的腎臟組織，經(jīng)LPS處理的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、脫落，管腔狹小且出現(xiàn)管型及滲出物，腎間質(zhì)水腫，有炎癥細(xì)胞的浸潤。而其余各組與LPS相比上述癥狀明顯減輕。見圖1。

圖1 腎臟組織形態(tài)學(xué)的HE染色(×400)Fig.1 Kidney tissue morphology of HE staining(×400)

采用免疫組化的方法檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3的表達(dá)。在注射LPS后的小鼠腎臟組織發(fā)生了凋亡，由圖中可看出LPS的凋亡程度嚴(yán)重，而其余各組的凋亡程度有不同程度的減輕。與對照組相比，LPS組Bax、Caspase3的表達(dá)明顯增多，而其余各組的表達(dá)減少但Bcl-2在LPS組明顯減少，在其余各組卻增多。見圖2。

圖2 免疫組化檢測腎臟組織Bax、Bcl-2和Caspase3的表達(dá)(×400)Fig.2 Organize the expression of Bax,Bcl-2 andCaspase3 immunohistochemical detection of kidneys(×400)

2.3 Western blot結(jié)果 與對照組相比，LPS組Bax、caspase3 的表達(dá)明顯增多(P<0.05)，Bcl-2明顯減少(P<0.05)，而CytoC的增多不明顯。與LPS組相比，大黃酸組、小檗堿組、黃芪苷組的Bax、CytoC、Cleaved caspase3的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)明顯增多，但3者之間的變化并不明顯。地塞米松組與LPS組相比Bax的表達(dá)明顯減少，Bcl-2的表達(dá)明顯增多(P<0.05)

圖3 三黃瀉心湯有效成分和地塞米松對LPS誘導(dǎo)AKI小鼠腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響A.免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2、CytoC、Cleaved caspase3在腎臟組織的表達(dá)；B.腎臟組織Bax、Bcl-2、CytoC、Cleaved caspase3與β-actin的灰度值1.對照組；2.LPS組；3.大黃酸組；4.小檗堿組；5.黃芪苷組；6.地塞米松組*P<0.05，與對照組相比；#P<0.05，與LPS組相比Fig.3 The effective constituent of Sanhuangxiexin Decoction and dexamethason on apoptosis-related protein expression of kidney tissues in LPS-induced acute kidney injury miceA.Expression of Bax,Bcl-2,CytoC and Cleaved caspase3 in kidney tissues detected by Western blot; B.Density ratio of Bax, Bcl-2,CytoC and Cleaved caspase3 with β-actin1.Control group;2.LPS group;3.Rhein group;4.Berberine group;5.Baicalin group;6.Dexamethasone group* P<0.05,compared with control group;#P<0.05,compared with LPS group

3 討論

急性腎損傷是由各種致病因素導(dǎo)致的腎功能迅速減退[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報道顯示近10年內(nèi)急性腎損傷的發(fā)病率及因急性腎損傷入院和入重癥監(jiān)護(hù)病房的患者數(shù)量逐年攀升[7-8]。目前大量的實驗室研究集中在糖尿病腎病后中藥的單體如大黃酸、小檗堿等對腎功能的逆轉(zhuǎn)及修復(fù)[9-10]。有體外實驗證實大黃酸可以抑制C-myc mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減少增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)而抑制系膜細(xì)胞的增殖[11]。同時大黃酸抑制系膜細(xì)胞增殖的效應(yīng)還與周期素激酶抑制劑p27表達(dá)的上調(diào)有關(guān)[12]。小檗堿能夠抑制p38MAPK信號通路對抗高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的增殖及纖維連接蛋白和膠原的表達(dá)[13]，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖及NF-kB的核轉(zhuǎn)位，使其下游因子ICAM-1、TGF-β1、iNOS及FN蛋白的表達(dá)減少[14]。而黃芩苷減輕糖尿病腎病的機制可能是通過提高SOD、GSH-PX等抗氧化酶在腎臟中的作用來清除氧自由基從而進(jìn)一步減輕腎臟的損傷[15]。但急性腎功能衰竭在發(fā)病機制中也存在多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生過多及超氧化物的損害的發(fā)生?，F(xiàn)代的研究證實糖皮質(zhì)激素能夠通過減輕炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，清除超氧化物進(jìn)而在急性腎損傷的過程中緩解急性期癥狀[16]。但上述中藥單體成分是否具有和糖皮質(zhì)激素相類似的作用相關(guān)的報道仍不多。本實驗中大黃酸、小檗堿、黃芩苷作用于小鼠后在使用LPS誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷，發(fā)現(xiàn)尿素氮、肌酐明顯較LPS組下降(P<0.05)，TNF-α、IL-6的量也明顯減少(P<0.05)。同時在腎臟組織的形態(tài)學(xué)、免疫組化及凋亡蛋白的表達(dá)上也有相同的結(jié)果。地塞米松能夠通過減輕腎小管細(xì)胞線粒體的損傷及對Bax/Bcl-2凋亡蛋白的直接調(diào)控而起到對急性腎損傷時細(xì)胞凋亡的抑制作用[16]。NF-κB是參與炎癥衍生的重要轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下是沒有活性的，但當(dāng)LPS和TNF-α等促炎因子的作用下促使IκB磷酸化導(dǎo)致IκB與NF-κB解離而降解成p56、p56進(jìn)入核內(nèi)而調(diào)節(jié)基因進(jìn)而產(chǎn)生IL-6、TNF-α等，導(dǎo)致炎癥因子的瀑布效應(yīng)。本實驗中發(fā)現(xiàn)三黃瀉心湯的有效成分能有有效減少TNF-α、IL-6的產(chǎn)生進(jìn)而抑制瀑布效應(yīng)的發(fā)生，為臨床當(dāng)中三黃瀉心湯治療急性腎損傷提供了理論基礎(chǔ)。

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(編校：王冬梅)

Study on mechanism of active ingredients in Sanhuang Xiexin Decoction on acute kidney injury induced by lipopolysaccharide

BAI Yu1, XIAO Xiao1, XUE Ying-xue1, ZHANG-Nan2, XU Guang-yu3Δ

(1.Department of Pharmacy, Jilin Medical College, Jinlin 132013, China; 2.The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China； 3.Department of Pharmacy, Beihua University, Jinlin 132013, China)

ObjectiveTo research on reversal mechanism of active ingredients of Sanhuang Xiexin Decoction on lipopolysaccharide-induced acute kidney injury.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into 6 groups: control group, LPS group, rhein group, berberine group, baicalin group and dexamethasone group.8 mice in each group.Control group were injected intraperitoneally with 0.9%NaCl 0.5 mL, and the remaining groups were injected intraperitoneally with LPS 0.1 mL/g.The mice of rhein group, berberine group, baicalin group and dexamethasone group were respectively injected intraperitoneally rhein, berberine, baicalin(0.1 mL/g) and dexamethasone(0.0001 mL/g) 2 h before LPS injection.One day after LPS treatment, mice were decapitated and blood collected, diagnostic kits and automatic biochemical analyzer were used to detected urea nitrogen and creatinine.TNF-α and IL-6 concentrations in serum were detected by ELISA kit.HE staining and immunohistochemistry were performed in the kidney tissues.expression of apoptosis protein detected by Western blot.ResultsCompared to control group, the blood urea nitrogen, serum creatnine, TNF-α and IL-6 level were significantly lower(P<0.05).HE staining found the renal tubular epithelial cell which treated with LPS were swelling, degeneration, loss, narrow lumen and tube type and exudate, renal interstitial edema, inflammatory cells infiltration.And symptoms of the other group were significantly slight.Immunohistochemical results showed that the expression of Bax and Caspase3 in LPS group was obviously increased, while the expression of the others group was decreased,neither did Bcl-2.Western blot results showed that apoptosis proteins Bax, Cleave-caspase3, CytoC expression increased of LPS group, while the other groups were lower than LPS group.But Bcl-2 expression reduced in LPS group and increased in others group.ConclusionThe effective constituent of Sanhuang Xiexin Decoction can reversal of LPS induced acute kidney injury and its mechanism of action is similar to that of dexamethason.

Sanhuang Xiexin Decoction; rhein; berberine; baicalin ;acute kidney injury

吳階平醫(yī)學(xué)基金(320.6750.13216和320.6750.13229)，吉林省教育廳“十二五”，科學(xué)技術(shù)研究課題(吉教科合字[2014]第505號)

白羽，女，博士，講師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：baiyu218@163.com；徐廣宇，通訊作者，男，博士，講師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：xuguangyu2005@163.com。

R692

A

1005-1678(2015)08-0011-04