成熟玉米稈組織結構切片方法的比較研究

王 欣，隋方功，初慶剛＊

（1 青島農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東青島266109；2 青島農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，山東青島266109）

玉米屬于C4作物，具有高光合效率及低CO2補償點，有巨大的高產(chǎn)潛力；它能高效集約利用光熱等資源，在主要糧食作物中平均產(chǎn)量最高；它不僅是高產(chǎn)糧食作物，也是營養(yǎng)豐富的飼料作物和良好的工業(yè)原料作物。玉米是高稈植物，在生長發(fā)育過程中，如果栽培密度過大或突然遇到大風暴雨的襲擊，就可能出現(xiàn)倒伏情況。據(jù)統(tǒng)計，倒伏導致玉米減產(chǎn)15%～25%，嚴重時可達50%，中國每年因倒伏造成玉米的產(chǎn)量損失近100萬t［1］。防止倒伏是玉米高產(chǎn)栽培的主要目標之一。為了防止倒伏，越來越多的人關注成熟玉米稈，特別是成熟玉米稈的組織結構特點［2－7］。所以，如何獲得高質量的成熟玉米稈組織結構切片就成了一個很重要的問題。成熟玉米稈靠近表皮細胞的基本組織和維管束周圍的基本組織均已發(fā)育成為機械組織，其細胞壁木質化的程度高，其它的基本組織均為薄壁組織。由于其機械組織和薄壁組織的相間分布特點，成熟玉米稈的軟硬程度不均勻。同時，成熟玉米稈表皮細胞外切向壁含有大量硅質，也對切片造成很大影響［8］。由于成熟玉米稈這種材料的特殊性，制作成熟玉米稈組織切片十分困難［3］。盡管植物組織切片方法很多（徒手切片法，滑走切片法，冰凍切片法，石蠟切片法，薄切片法等），但是，哪一種方法適用于成熟玉米稈組織結構切片，目前的報道還沒有給出合適的方法。本研究在這方面進行了一些探索。

1 材料和方法

1．1 材 料

供試材料為‘鄭單958’玉米雜交種，取其成熟期健壯稈基數(shù)第三節(jié)間。

1．2 方 法

1．2．1 材料固定 將莖稈材料用FAA 固定液固定、抽氣后在4℃冰箱中保存。

1．2．2 材料去硅和軟化 材料固定后，經(jīng)過梯度復水，使用15%的氫氟酸水溶液去硅5～7d，如果需要軟化，在去硅后，用蒸餾水沖洗3次，使用10%乙二胺軟化7d。

1．2．3 薄切片脫脂 獲得薄切片后，用NaOH 無水乙醇飽和溶液脫脂3～5 min，然后清水沖洗，在40 ℃烘箱烘干備用。

1．2．4 制片 徒手切片法選用固定后去硅的材料，使用吉列雙面刀片做徒手橫切片，厚度大約20μm，用番紅－固綠染色。冰凍切片法選用固定后去硅的材料，采用冰凍切片機（Microm HM 525）在－25℃冷凍切片，切片厚度為20μm，用苯胺藍染色。石蠟切片法選用固定后先去硅后軟化的材料，采用常規(guī)石蠟法制片，厚度8～12μm。薄切片法選用固定后去硅的材料，采用SPURR 樹脂配方，用Leica EM UC6切片機切片，厚度為1μm，用甲苯胺藍染色。

1．2．5 觀察 徒手切片、冰凍切片、薄切片觀察用LeicaDM 2500萬能顯微鏡，觀察拍照。薄切片脫脂后采用掃描電子顯微鏡（JEOL 7500F）掃描觀察。

2 實驗結果

2．1 徒手切片法

切片厚度大約在20μm，玉米稈切片整體圖完整清晰（圖版Ⅰ，1、2），表皮下每一個維管束結構完整清晰，適合低倍、高倍物鏡觀察。表皮下維管束在高倍數(shù)下圖像清晰，能夠清晰看到維管束周圍厚壁細胞的層數(shù)（圖版Ⅰ，3）。

2．2 冰凍切片法

切片厚度20μm。玉米稈切片整體圖完整清晰（圖版Ⅰ，4、5），表皮下每個維管束結構完整清晰。表皮下維管束在高倍數(shù)下圖像清晰，能夠清晰地看到維管束周圍厚壁細胞的層數(shù)（圖版Ⅰ，6）。

2．3 石蠟切片法

成熟玉米稈如果不軟化或軟化時間不夠，材料硬度依然很大，材料在切片過程中碎化成粉末，無法進行后面的染色封片拍照；如果充分軟化，材料中非木質化加厚的部分由于軟化過度，整個材料會分散開，無法進行包埋切片。采用石蠟切片法無法獲得成熟玉米稈的組織切片。

2．4 薄切片法

圖片的清晰度很高，切片完整，切片厚度1μm。玉米稈切片整體圖完整清晰（圖版Ⅱ，1、2），能夠看到表皮下每一個維管束。每個維管束結構完整，更加清晰。表皮下維管束在高倍數(shù)下圖像清晰，能夠清晰地看到維管束周圍厚壁細胞的層數(shù)（圖版Ⅱ，3）。

通過對薄切片脫脂后進行電鏡掃描，獲得高倍數(shù)放大的圖像。表皮及表皮下機械組織圖像完整清晰，能夠清晰看到機械組織的層數(shù)（圖版Ⅱ，4）。表皮下維管束在高倍數(shù)下圖像清晰，能夠清晰地看到維管束下厚壁細胞的層數(shù)（圖版Ⅱ，5）。維管束下厚壁細胞的圖片也非常清晰，可以測量細胞壁的厚度、細胞腔大小等數(shù)據(jù)（圖版Ⅱ，6）。

3 分析與討論

玉米稈表皮有硅質細胞，內(nèi)含質地堅硬的硅質顆粒，表皮細胞外切向壁硅化，這些硅質的存在對切片刀的損害極大，會使切片產(chǎn)生劃痕、碎裂，影響切片質量。所以，切片前必須去硅。對禾本科植物進行切片觀察，不管采用什么切片方法，都應該首先去硅后再進行后續(xù)的實驗。在本實驗中，采用15%的氫氟酸水溶液浸泡材料5～7d，能夠有效去除莖稈表面的硅質。

由于玉米不像喬木等木本植物材料內(nèi)外木質化程度差別不大，成熟玉米稈表皮下機械組織和維管束周圍的機械組織木質化程度高，其它的基本組織細胞為薄壁細胞，使用物理或化學的軟化方法，難以達到合適的軟化程度［9］。

徒手切片法的優(yōu)點是操作簡單，不需要機械設備，由于沒有經(jīng)過早期的化學處理，比較能保持活體的情況，在組織化學上及許多一般的結構觀察上常常得到應用。材料不能太大，一般以材料斷面不超過5mm×5mm 為宜。切片最重要的是平而薄，該方法對于成熟玉米稈比較合適，但是該方法切片厚度較厚而且厚度不好控制，厚的切片清晰度不好。

冰凍切片法是利用滑走切片機，裝上特別設計的冷凍器而進行切片。此種方法可以適用于含水較多的材料［10］，成熟玉米稈的含水量較低，表皮細胞壁硅化和硅質細胞對刀的損害較大，容易劃傷材料。所以成熟玉米稈在采用冰凍切片法獲取組織切片前一定要去除材料表面的硅質。這種方法對于成熟玉米稈不是很適合，如果要用這種方法，一定要使組織材料切口小于3 mm×4 mm。切片的材料面積較小，不利于觀察統(tǒng)計。采用冰凍切片法可以獲得成熟玉米稈組織切片。

石蠟切片法不能獲得合格的成熟玉米莖稈切片。成熟玉米稈木質化的機械組織非常發(fā)達，材料經(jīng)過高濃度酒精和二甲苯處理后會變得異常硬而脆，材料硬度遠高于石蠟，而且石蠟切片所用的金屬刀硬度也很難切割材料，所以很難切出完整的切片。莖稈軟化后再進行石蠟切片也有很大難度，由于成熟玉米稈機械組織和基本組織（薄壁組織）相間分布，機械組織軟化成功時，基本組織細胞出現(xiàn)破裂。采用石蠟切片法很難獲得成熟玉米稈結構組織切片。盡管有采用常規(guī)石蠟制片法研究成熟玉米稈的報道，但從圖示中可以看出維管束周圍的機械組織并沒有發(fā)育［11］。機械組織發(fā)達的玉米稈無法采用石蠟切片獲得高質量的切片。

成熟期玉米稈薄切片在切片前需要經(jīng)過3～5d的去硅后才可以切片，否則對刀和材料的損害都非常大［12］。薄切片法可以獲得清晰度很高的切片，但是薄切片對于材料大小要求較嚴格，一般材料斷面低于1mm2。成熟玉米稈較粗，維管束多而散生，采用這種方法一般只能切出一個完整的維管束，獲得的組織切片較小，不利于玉米稈結構大范圍的觀察。獲得的薄切片也可以通過NaOH 無水乙醇的飽和溶液去除材料中的樹脂、干燥后，在放大倍數(shù)更大的掃描電子顯微鏡下掃描觀察?？傮w而言，薄切片可以獲得較高質量的成熟玉米稈局部組織切片，特別是適合研究材料結構范圍不大，但是放大倍數(shù)要求較高時使用。

綜上所述，徒手切片法、冰凍切片法和薄切片法可以獲得合格的成熟玉米稈的組織結構切片，石蠟切片法不能獲得合格的成熟玉米稈的組織結構切片。徒手切片法是最適合成熟玉米稈組織結構觀察研究的制片方法。

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PC．薄壁細胞；S．厚壁組織圖版Ⅰ 1．成熟玉米稈徒手切片整體圖；2．成熟玉米稈局部徒手切片圖；3．成熟玉米稈維管束徒手切片圖；4．成熟玉米稈冰凍切片整體圖；5．成熟玉米稈局部冰凍切片圖；6．成熟玉米稈維管束冰凍切片圖。PC．Parenchyma cell；S．SclerenchymaPlateⅠ Fig．1．Whole figure of mature maize stalk with freehand section；Fig．2．Freehand slice figure of partial mature maize stalk；Fig．3．Freehand slice figure of mature maize stalk showing vascular bundle；Fig．4．Overall figure of mature maize stalk with frozen section；Fig．5．Partial figure of mature maize stalks with frozen section；Fig．6．Mature maize stalk vascular bundle with frozen section．

PC．薄壁細胞；S．厚壁組織圖版Ⅱ 1．成熟玉米稈薄切片整體圖；2．成熟玉米稈局部薄切片圖；3．成熟玉米稈維管束薄切片圖；4．成熟玉米稈表皮掃描圖；5．成熟玉米稈維管束掃描圖；6．成熟玉米稈維管束周圍機械組織掃描圖。PC．Parenchyma cell；S．SclerenchymaPlateⅡ Fig．1．Mature maize stalk overall figure with thin section；Fig．2．Mature maize stalk partial figure with thin section；Fig．3．Mature maize stalk showing vascular bundles with thin section；Fig．4．Epidermis scan of mature maize stalk；Fig．5．Vascular bundle scan of mature maize stalk；Fig．6．Mature maize stalk mechanical structure around vascular bundles．