蟾酥毒理學(xué)及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

翟金曉，劉 偉

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063；2.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 生物化學(xué)與分子生物學(xué)，江蘇 蘇州215123）

鑒定綜述
R e v i e w

蟾酥毒理學(xué)及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

翟金曉1，2，劉 偉1

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063；2.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 生物化學(xué)與分子生物學(xué)，江蘇 蘇州215123）

蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺或皮膚腺分泌物,經(jīng)加工干燥而成。臨床上廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、強(qiáng)心、麻醉止痛等方面。蟾酥的化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用很強(qiáng)，且毒性很大，有關(guān)蟾酥中毒案件時(shí)有報(bào)道。本文結(jié)合近年來關(guān)于蟾酥的研究作一綜述,總結(jié)了蟾酥的化學(xué)成分、毒理學(xué)、藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及檢測(cè)方法等,以期為法醫(yī)毒理學(xué)工作者提供參考。

蟾酥；蟾蜍甾烯類；中毒；毒物學(xué)；檢測(cè)；LC-MS/MS

蟾蜍為蟾蜍科蟾蜍屬動(dòng)物，蟾蜍屬動(dòng)物有260余種，其中我國(guó)有13個(gè)亞種的蟾蜍屬動(dòng)物，資源較為豐富，在全國(guó)大部分地區(qū)均有分布[1]。蟾蜍全身皆可入藥，如蟾酥、蟾皮、干蟾、蟾蜍頭、蟾蜍舌、蟾蜍肝、蟾蜍膽等。而中藥蟾酥的來源為中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑框蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物。蟾酥具有抗腫瘤升壓、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性，同時(shí)毒性又很大，因此，有關(guān)蟾酥中毒案件時(shí)有報(bào)道[2-4]。本文綜述了蟾酥的化學(xué)成分、毒理學(xué)、藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及檢測(cè)方法方面的研究，以期為法醫(yī)毒理學(xué)工作者提供參考。

1 蟾酥的化學(xué)成分

蟾酥的化學(xué)成分復(fù)雜，迄今為止，從蟾酥中分離得到的化學(xué)成分主要包括蟾蜍甾烯類、吲哚類生物堿、環(huán)酰胺和小分子環(huán)肽、甾醇及其他類化合物，蟾蜍甾烯類分為蟾毒配基和蟾蜍毒素兩類，蟾蜍毒素為蟾毒配基3位被精氨酸二碳酸酯、硫酸酯等取代的衍生物[5]。它們既是蟾酥的有效成分，又是其毒性成分。蟾蜍甾烯類（bufadienolides）成分是一類C-17位連接α-吡喃酮環(huán)（六元不飽和內(nèi)酯環(huán)），A/B環(huán)順式或反式稠合，B/C環(huán)反式稠合，而C/D為順式稠合，C-3多羥基取代的甾體類化合物。該類成分多具有強(qiáng)心、局部麻醉、抗休克、抗病毒等多種藥理活性，尤其是其抗腫瘤活性十分顯著，腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制率IC50為1~100nmol/L。對(duì)于蟾酥及其制劑中蟾蜍甾烯類化學(xué)成分的研究有著重要的意義。

馬驍馳等[6]對(duì)蟾酥的氯仿萃取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，分離得到3個(gè)主要的蟾蜍甾烯類成分：華蟾酥毒基（cinobufagin，1）、脂蟾毒配基（resibufagenin，2）和蟾毒靈（bufalin，3），和5個(gè)甾體類化合物，利用核磁共振氫譜（1H-NMR），碳譜（13C-NMR）鑒定這些化合物，分別為：蟾毒它靈（bufotalin，4），南美蟾毒精（marinobufagin，5），華蟾毒它靈（cinobufotalin，6），12β-羥基-蟾毒靈（12β-hydroxyl-bufalin，7），5，7β-二羥基-脂蟾毒配基（5，7β-dihydroxyl-resibufagenin，8）（結(jié)構(gòu)式見圖1）。脂蟾毒配基和華蟾酥毒基是蟾蜍甾烯類的主要代表物質(zhì)，是蟾酥的主要活性成分和毒性成分。

圖1 化合物1-8的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 蟾酥的毒理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)研究

蟾酥藥理活性強(qiáng)，臨床應(yīng)用廣泛、療效顯著，尤其在抗腫瘤、強(qiáng)心、麻醉止痛等方面具有極佳的療效。在臨床上，蟾酥被用于多種中藥成方制劑中。在蟾毒靈、華蟾毒精、六神丸、麝香保心丸、梅花點(diǎn)舌丸、蟾酥注射液等中均有蟾酥成分，如麝香保心丸由麝香、蘇合香、蟾酥和肉桂等七味中藥組成，用于治療心肌缺血引起的胸悶、心絞痛及心肌梗死等疾病。此外，蟾酥又是毒性很大的藥物，用藥不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用。梁曉萍等[7]總結(jié)出如長(zhǎng)期或過量服用蟾酥可出現(xiàn)循環(huán)、消化及神經(jīng)系統(tǒng)等的中毒癥狀。蟾蜍毒素及蟾蜍配基主要作用于心臟迷走神經(jīng)中樞或末梢，并可直接作用于心肌，引起心率緩慢、心律不齊等緩慢心律失常癥狀，使房室傳導(dǎo)阻滯，最后導(dǎo)致心跳停止于收縮期[8-9]；吲哚烷基類化合物有致幻作用；兒茶酚類化合物可引起各器官組織的微小血管劇烈收縮，導(dǎo)致組織缺血缺氧[10]。蟾酥吸收快，作用消失得也快，蓄積性很小。Xie JT等[11]和Ko RJ等[12]研究表明，人的蟾酥急性中毒癥狀表現(xiàn)為嘔吐、呼吸急促、肌肉痙攣、驚厥和心律不齊等。雖然人們對(duì)蟾酥毒性早有認(rèn)識(shí)，但目前研究主要集中在蟾酥的化學(xué)成分分析及藥理作用[13-15]，而對(duì)蟾酥的毒性作用機(jī)制仍不清楚。張慧卿等[16]研究也表明，蟾酥急性中毒癥狀多表現(xiàn)為嘔吐、呼吸急促、肌肉痙攣、驚厥和心律不齊等方面[17]。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蟾酥各種成分對(duì)小鼠半數(shù)致死量如下：蟾酥為41.0mg/kg（靜脈注射），96.6mg/kg（皮下注射），36.24mg/kg（腹腔注射）；蟾毒靈為2.2mg/kg（腹腔注射）；華蟾毒精為4.38mg/kg（腹腔注射）；脂蟾毒配基為4.25mg/kg（快速靜脈注射），15mg/kg（慢速靜脈注射），14mg/kg（腹腔注射），124.5mg/kg（皮下注射），64mg/kg（口服給藥）；蟾蜍它靈對(duì)狗的半數(shù)致死量約為0.36mg/kg（靜脈注射），口服最小致死量約為0.98mg/kg。靜脈或腹腔注射蟾酥注射液，小鼠急性中毒為呼吸急促，肌肉痙攣，心律不齊，最后麻痹而死，阿托品對(duì)此有一定的解毒作用，腎上腺素則無。蟾酥經(jīng)煮沸后毒性大減[18]。Ma H等[19]研究表明，中藥牛黃可有效緩解蟾酥所致的心律失常等副作用，可作為一種蟾酥中毒的解救劑。

由于蟾酥毒性較大，故其提取物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)是重要的研究課題。梁研等[20]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟾蜍甾烯在小腸中的吸收率是在胃中的2.5～7倍。極性小的蟾蜍甾烯比極性大的蟾蜍甾烯更容易被胃腸道吸收。小腸遠(yuǎn)端內(nèi)容物對(duì)蟾蜍甾烯的轉(zhuǎn)化能力較弱，盲腸內(nèi)容物對(duì)蟾蜍甾烯的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，華蟾毒精在盲腸中的轉(zhuǎn)化率超過了90%。

劉冬等[21]建立了兔血漿中蟾毒靈（BL）及脂蟾毒配基（RBG）的液相色譜法（HPLC），并將該法用于蟾蜍甾烯類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)研究。該方法取新西蘭兔6只，雌雄各半，以0.35mg/kg劑量，由耳緣靜脈注射蟾酥提取物溶液（20%乙醇生理鹽水溶液配制，0.6g/L），分別于給藥后2，5，10，15，30，45，60，90min取血，每次約2.0mL，肝素抗凝，經(jīng)3500 r/min離心10min。測(cè)定兔血漿中BL，RBG質(zhì)量濃度，得血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，經(jīng)Kinetica 4.4.1軟件非房室模型擬合，得到兔在給藥后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（見圖2），發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基較其他成分在兔體內(nèi)代謝速度極快，且現(xiàn)有文獻(xiàn)及相關(guān)研究表明，華蟾酥毒基在大鼠以及犬體內(nèi)的代謝速度明顯慢于其在兔體內(nèi)的代謝。

圖2 BL，RBG兔血漿中的濃度-時(shí)間曲線（n=6）

3 蟾蜍甾烯類的提取與檢測(cè)

3.1 蟾酥的提取

蟾酥中的有毒成分較為復(fù)雜，一般是針對(duì)于蟾酥中蟾蜍甾烯類中的幾種主要物質(zhì)進(jìn)行提取檢測(cè)，蟾酥提取方法主要有溶劑提取法；提取工藝采用加熱回流法、超聲提取法、固相萃取法等。劉冬等[22]通過實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑對(duì)蟾酥有毒成分蟾毒靈（BL）、華蟾酥毒基（CBG）、脂蟾毒配基（RBG）的提取率的影響，發(fā)現(xiàn)，采用80%、90%乙醇及無水乙醇提取蟾酥提取液中的BL、CBG、RBG均較2010年版《中國(guó)藥典》蟾酥含量測(cè)定項(xiàng)中提取方法的提取率更高。袁旭江等[23]通過實(shí)驗(yàn)比較了加熱回流法和超聲提取法對(duì)蟾酥有毒成分華蟾酥毒基和脂蟾毒配基提取率的影響，結(jié)果表明加熱回流法的提取率更高。Yan Liang等[24]通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，與液液萃取法相比，固相萃取法不僅能清除生物樣本中的干擾物質(zhì)，而且還能夠提高目標(biāo)物的提取回收率。

3.2 蟾酥的檢測(cè)

蟾酥的藥理活性強(qiáng)，且毒性很大，人一旦服用不當(dāng)則會(huì)發(fā)生中毒甚至死亡的案件。因此，在法醫(yī)毒物學(xué)等領(lǐng)域，蟾酥有毒成分的檢測(cè)已受到研究人員的關(guān)注。目前針對(duì)蟾酥的檢測(cè)主要包括兩大領(lǐng)域：一是在藥物安全與質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域，通過一定的提取方法檢測(cè)蟾酥或蟾酥制品中的有毒成分蟾蜍甾烯類含量是否符合安全標(biāo)準(zhǔn)，含量是否在藥用劑量的安全量下限；二是在法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域，研究服用蟾酥或其制品后，蟾酥在人或動(dòng)物體內(nèi)的毒物動(dòng)力學(xué)情況，為蟾酥中毒案件的取材與鑒定提供一定的指導(dǎo)意義。

3.2.1 蟾酥中有毒成分的體外檢測(cè)方法

蟾酥中有毒成分的檢測(cè)方法主要有HPLC[25-31]、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法（LC-MS/MS）[32][包括高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/ESI-MS/MS）[33]和高效液相色譜-大氣壓電離串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法（HPLC/APCIMS/MS[34]）]等（表1）。通過分析蟾酥及其制品中的有毒成分及其含量，為藥物安全及其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

HPLC在蟾酥及其制品的檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛，通過對(duì)蟾酥或其中藥制品進(jìn)行一定的前處理，再進(jìn)行檢測(cè)。因蟾酥及其中藥制品成分復(fù)雜，故其前處理?xiàng)l件也較為復(fù)雜。一般的前處理方法是將蟾酥或其制品通過溶劑提取并配合加熱回流或超聲提取來提高提取率達(dá)到凈化目的。加熱回流法是指用乙醇等易揮發(fā)的有機(jī)溶劑提取原料成分，將浸出液加熱蒸餾，其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷卻，重復(fù)流回浸出容器中浸提原料，如上周而復(fù)始，直至有效成分回流提取完全的方法。而超聲提取法則是利用超聲波所產(chǎn)生的空化等特殊作用，將藥物中所含化學(xué)成分快速高效地提取出來的一項(xiàng)提取技術(shù)。這兩種前處理方法一般都是選用合適的溶劑如乙醇配合超聲提取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來進(jìn)行處理，將得到的提取物再通過不同的膜過濾后再進(jìn)行分析。而濾膜孔徑的大小也對(duì)其提取物的純度有一定的影響。如Yongmei Hu等[33]選用的是0.22 um的膜來進(jìn)行過濾，相比于傳統(tǒng)的0.45 um的濾膜孔徑小較多，從而達(dá)到了更好的分離純化效果。Min Ye等[34]在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用了硅膠柱色譜法對(duì)蟾酥提取物進(jìn)行了純化，并將得到的物質(zhì)通過制備液相色譜法進(jìn)一步純化，從而得到了較高的提取率。

而LC-MS/MS比之HPLC更為高效、靈敏，王兆基等[32]建立了華蟾毒它靈、蟾蜍靈、華蟾毒配基及脂蟾毒配基的LC-MS/MS檢測(cè)方法。比較了蟾酥樣本的液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法分析數(shù)據(jù)。對(duì)4個(gè)不同來源中華大蟾蜍及黑眶蟾蜍的蟾酥樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得華蟾毒它靈、蟾蜍靈、華蟾毒配基及脂蟾毒配基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.05%～5.12%。Yongmei Hu等[33]在實(shí)驗(yàn)中使用LC/ESI-MS/MS進(jìn)行分析，其得到的30種主要化合物的最低檢測(cè)限范圍為0.25～0.50 pg/uL，回收率高達(dá)83%～106%。

表1 蟾酥及其制品的前處理及檢測(cè)方法

3.2.2 生物檢材中蟾酥的主要化學(xué)成分檢測(cè)

生物檢材中蟾酥中的蟾蜍甾烯類化合物的檢測(cè)可為中毒判斷提供依據(jù)，目前對(duì)體內(nèi)蟾蜍甾烯類化合物的檢測(cè)方法主要HPLC[21，24]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[35]，高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC/TOFMS）[36]等。其中應(yīng)用最廣的為HPLC，劉冬[21]等人采用乙腈沉蛋白與液液萃取相結(jié)合方法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，建立了兔血漿中蟾毒靈及脂蟾毒配基的HPLC測(cè)定法，為中藥蟾酥提取物的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參考。

其次是LC-MS，陳建新等[31]建立了高效液相色譜-質(zhì)譜法鑒定大鼠灌胃給予蟾酥總內(nèi)酯提取物后血漿中蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物及其主要代謝物的分析方法，選用了乙腈沉淀蛋白法，鑒定了24種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物和20種可能的代謝物?？梢钥闯鲈摲椒焖?、靈敏，適用于血漿中微量蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物及其代謝物的測(cè)定。

Cao Y等[36]在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用HPLC/TOF-MS檢測(cè)了犬單次灌胃給予六神丸后血液中的蟾蜍甾烯類物質(zhì)及其藥代動(dòng)力學(xué)特征。此方法中最低檢出限為0.15 ng/mL，適用于體內(nèi)痕量蟾蜍甾烯類物質(zhì)的檢測(cè)及其藥代動(dòng)力學(xué)考察。

4 研究展望

雖然生物檢材中蟾酥的檢測(cè)方法已有一些報(bào)道，但這些方法中的前處理方法較為復(fù)雜耗時(shí)，檢材比較單一，且方法大多未進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證。而在法庭毒物分析領(lǐng)域，蟾酥中毒后需要及時(shí)取材并進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，對(duì)于不同檢材，如血液、尿液及組織中蟾酥的分析均較為重要，這就需要建立一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法為蟾酥中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定提供依據(jù)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-（MS）n）是將HPLC的高分離能力和MS的高分辨能力相結(jié)合，已經(jīng)在藥物及毒物分析方面得到了廣泛的應(yīng)用，對(duì)體內(nèi)痕量毒藥物的檢測(cè)有一定的優(yōu)勢(shì)。因此，為滿足法醫(yī)毒物分析和臨床毒物分析的需要，可建立靈敏、簡(jiǎn)便的生物體液及組織中蟾酥有毒成分檢測(cè)的LC-MS/MS方法，為蟾酥中毒案件中痕量有毒成分的分析提供可靠的理論依據(jù)。

目前蟾酥毒理學(xué)方面也已有報(bào)道，但藥物動(dòng)力學(xué)方面現(xiàn)在主要以血液為檢材進(jìn)行相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)研究與分析，并未見組織分布、排泄等方面的研究。在法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域，毒物動(dòng)力學(xué)研究具有一定的指導(dǎo)意義，在藥物的毒性劑量下藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程會(huì)有所改變。因此，建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，研究蟾酥在動(dòng)物體內(nèi)的毒物動(dòng)力學(xué)過程能為法醫(yī)學(xué)鑒定中蟾酥中毒案件的取材及檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)提供更多有價(jià)值的參考信息。

另外，在已報(bào)道的研究中，因蟾酥所含化學(xué)成分復(fù)雜，各實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的化學(xué)成分并不統(tǒng)一，而在法醫(yī)毒物學(xué)方面，相關(guān)報(bào)道更是甚少，因此確定蟾酥中毒中的檢測(cè)目標(biāo)物及其可能代謝物，為法醫(yī)學(xué)鑒定中有關(guān)蟾酥中毒案件中的檢測(cè)與篩選評(píng)價(jià)、此類案件的鑒定提供可靠依據(jù)和指導(dǎo)信息。

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（本文編輯：卓先義）

Advances in the Study of Toxicology and Determ ination of Venenum Bufonis

ZHAIJin-xiao1,2,LIUWei1
(1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai200063,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Soochow University,Suzhou 215123,China)

Venenum bufonis is the dry powder of the secretion from Bufo bufogargarizan Cantor or B.melan ostictus Schneider’s ear gland or dermal gland.It is widely applied as anti-tumor agent,cardiotonic,narcotic analgesic,etc.in clinicalmedicine. Venenum bufonis’s chemical composition is very complex.It has strong toxicity as well as pharmacological effects.Therefore, cases of venenum bufonis poisoning have been reported now and then.This paper reviewed the studies of venenum bufonis’s chemical composition,toxicology,pharmacology,pharmacokinetics and analyzing methods in recent years,providing reference for forensic toxicology peers.

venenum bufonis;bufadienolides;poisoning;forensic toxicology;determination;LC-MS/MS

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.015

1671-2072-（2015）02-0080-06

2014-12-31

上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（14DZ2270800）

翟金曉（1989—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)毒物學(xué)研究。E-mail：zhaijinxiao@126.com。

劉偉（1963—），女，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)毒物學(xué)研究。E-mail：liuw@ssfjd.cn。