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    基于super—BSA技術(shù)開(kāi)發(fā)甜瓜含糖量和酸度性狀的功能性分子標(biāo)記

    2015-07-04 09:58:30張紅吳海波李寐華熊韜王廣智伊鴻平
    中國(guó)瓜菜 2015年6期
    關(guān)鍵詞:含糖量酸度甜瓜

    張紅 吳海波 李寐華 熊韜 王廣智 伊鴻平

    摘 要: 為達(dá)到選育甜酸味品系、縮短育種周期、提高選擇準(zhǔn)確率的目的,本研究基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(SLAF-seq)的選擇性基因型鑒定和集群分離分析(Super-BAS),結(jié)合生物信息學(xué)方法,以‘風(fēng)味4號(hào)甜瓜F2群體甜味、酸味、不甜不酸3個(gè)極端表型群體為試驗(yàn)材料,精細(xì)定位甜瓜含糖量、酸度性狀相關(guān)基因并開(kāi)發(fā)功能性標(biāo)記。結(jié)果顯示:(1)將甜瓜含糖量、酸度性狀定位在雙親基因組;(2)獲得1個(gè)含糖量性狀相關(guān)候選基因,3個(gè)酸度性狀相關(guān)候選基因;(3)針對(duì)候選基因開(kāi)發(fā)出1個(gè)含糖量性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01和3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。本研究開(kāi)發(fā)的功能性分子標(biāo)記為甜瓜品質(zhì)性狀基因的分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的標(biāo)記基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞: 甜瓜; 含糖量; 酸度; 精細(xì)定位; 功能分子標(biāo)記

    Abstract: SLAF-seq-based selective genotyping and bulked segregant analysis(Super-BSA),together with bioinformatic methods were performed in three extreme phenotypes populations(sweetness,acidity and neither sweet nor sour) from the F2 population of a flavorful melon(Cucumis melo L.) ‘Fengwei No. 4; fine mapping of its genes related to sugar content and acidity traits was achieved and functional markers were developed. Results showed that:(i) both sugar content and acidity traits were mapped in parental genome;(ii) one sugar content trait-related candidate gene and three acidity trait-related genes were obtained;(iii) one sugar content(SLAF18745-S01) and three acidity (SLAF36334-S02,SLAF50072-S03 and SLAF31212-S04)trait-related gene functional molecular markers were developed based on the candidate genes. In conclusion,the functional molecular markers developed in this study provide an important marker foundation for molecular marker-assisted selection of quantitative trait loci of melons,which can reduce breeding cycles and improve the accuracy of selection.

    Key words: Melon; Sugar content; Acidity; Fine mapping; Functional molecular markers

    甜瓜(Cucumis melo L.)屬葫蘆科甜瓜屬,是一種重要的園藝作物,我國(guó)甜瓜的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。甜瓜是一種高多態(tài)性物種,含有各種不同果實(shí)風(fēng)味的基因型[1-3]。

    大多數(shù)果實(shí)的風(fēng)味由糖、有機(jī)酸及果實(shí)特征香氣組成,糖含量是影響甜瓜果實(shí)品質(zhì)的主要因子[4],蔗糖是甜瓜果實(shí)成熟所積累的主要成分[5-7]。甜瓜栽培種果實(shí)有機(jī)酸含量很低,但甜瓜種(Cucumis melo)中存在高有機(jī)酸含量的遺傳變異[8-11]。近年來(lái),育成了具有獨(dú)特酸甜味的甜瓜栽培種[12-14]。甜、酸等風(fēng)味的變化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,受一系列相關(guān)基因的影響和調(diào)控[15]。定位甜瓜含糖量、酸度性狀相關(guān)基因并開(kāi)發(fā)功能性標(biāo)記,為提高甜瓜果實(shí)品質(zhì)性狀選育效率及甜瓜分子育種提供思路。在現(xiàn)有甜瓜育種實(shí)踐中,對(duì)含糖量、酸度等風(fēng)味性狀大多是通過(guò)表現(xiàn)型間接對(duì)基因型進(jìn)行選擇,致使育種周期長(zhǎng),效率低,制約著甜瓜品種改良的進(jìn)程[16]。分子標(biāo)記輔助選擇,尤其是對(duì)與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的功能性分子標(biāo)記的選擇可極大提高選擇的效率,加速遺傳改良[17-18]。

    現(xiàn)有技術(shù)中,功能性分子標(biāo)記作為與表型相關(guān)的由功能基因序列中功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)開(kāi)發(fā)而成的分子標(biāo)記[19],其開(kāi)發(fā)必須具備以下2個(gè)條件:(1)有確定功能的候選基因并已知等位基因的序列信息;(2)在多個(gè)材料中對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行調(diào)查,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行序列分析,結(jié)合性狀和基因序列信息進(jìn)行基于連鎖不平衡(LD)的關(guān)聯(lián)分析[20]。功能基因定位是功能性分子標(biāo)記發(fā)掘的基礎(chǔ),目前功能基因定位常用的方法有基于傳統(tǒng)遺傳圖譜定位與集群分離分析法(BSA)?;趥鹘y(tǒng)遺傳圖譜對(duì)甜瓜糖、酸性狀進(jìn)行了QTL定位[8,21-23],但該方法的周期長(zhǎng)、密度低、成本高;而集群分離分析法(BSA)可快速、有效尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記,但混池個(gè)數(shù)有限,一般不超過(guò)10個(gè),關(guān)聯(lián)分析假陽(yáng)性幾率大,標(biāo)記密度低。近年來(lái)發(fā)展的選擇性基因型鑒定和集群分離分析(Super BSA),利用SLAF-seq(Specific Location Amplified Fragments sequence,特定位置擴(kuò)增片段測(cè)序)[24],選擇均勻分布在整個(gè)基因組、且避開(kāi)重復(fù)序列區(qū)域的特異片段進(jìn)行高深度測(cè)序,通過(guò)比較SNP標(biāo)記的不同基因型在2個(gè)混池中出現(xiàn)頻率的差異,確定與性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記。Super BSA分子標(biāo)記密度高,30~200個(gè)體的混池,保證了基因定位的功效和準(zhǔn)確性。同時(shí),由于SLAF標(biāo)簽中的多態(tài)性位點(diǎn)已經(jīng)定位在基因組上,可以根據(jù)基因組的位置使用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記。這些近幾年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù),通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇可以將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型,具有重要的意義,但是至今未見(jiàn)開(kāi)展甜瓜含糖量、酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記方面的研究和報(bào)道。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    高糖甜瓜自交系‘壽星為母本、高新果味自交系‘新果味為父本進(jìn)行雜交,得到雜種F1即‘風(fēng)味4號(hào);由雜種F1自花授粉獲得F2代群體,對(duì)父母本、F1及每個(gè)F2代單株果實(shí)的含糖量、酸度利用PAL-1糖度測(cè)定儀(日本ATATO公司)、STARTER300便攜式pH計(jì)[奧豪斯儀器(上海)有限公司]測(cè)量并結(jié)合品嘗進(jìn)行鑒定。

    1.2 含糖量、酸度性狀相關(guān)基因定位

    通過(guò)CTAB法[25]提取每份材料的基因組DNA,將5株父本、5株母本及甜味、酸味、不甜不酸各50個(gè)單株的基因組DNA等量混合,形成5個(gè)混池。利用酶切預(yù)測(cè)軟件SLAF_Predict(北京百邁客公司開(kāi)發(fā))分析甜瓜基因組,分別對(duì)5個(gè)混池基因組進(jìn)行雙酶切,混池中各個(gè)樣品同一位點(diǎn)處的DNA片段序列經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、Illumina GA IIx(Illumina,San Diego,CA,USA)測(cè)序。Blat比對(duì)軟件對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行聚類、Cap snp 軟件檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性,獲得多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽[26]。

    選擇不甜不酸混池中a/b > 3或者b/B > 3的純和標(biāo)記對(duì)含糖量、酸度性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)定位。分別計(jì)算群體ac(不甜不酸)與ab(含糖量)之間和ac(不甜不酸)與aa(酸度)之間來(lái)源于不同基因型的差異比值,得到差異標(biāo)記。將與含糖量、酸度性狀關(guān)聯(lián)的差異標(biāo)記通過(guò)blat軟件比對(duì),在雙親基因組上定位,注釋標(biāo)記物理位置所在的基因,獲得與含糖量、酸度性狀相關(guān)的功能基因,挑選出處于功能基因外顯子的SLAF標(biāo)簽。

    1.3 功能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及穩(wěn)定性檢測(cè)

    利用Primer Premier 5.0軟件,對(duì)功能基因外顯子的SLAF標(biāo)簽設(shè)計(jì)引物,對(duì)甜味、酸味、不甜不酸及酸甜味材料基因組DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR體系25 μL,含100 ng·μL-1模板DNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、5 U·μL-1 DNA Taq 酶0.3 μL、ddH2O 17.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性50 s,45~60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。用6% PAGE膠銀染檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將只在母本、甜味及父本、酸味單株中有擴(kuò)增產(chǎn)物,而在不甜不酸單株中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記分別作為含糖量、酸度性狀功能性標(biāo)記。

    2 結(jié)果與分析

    母本‘壽星味甜(TSS >12,pH>6),父本‘新果味味酸(TSS?8,pH ?5),F(xiàn)1‘風(fēng)味4號(hào)酸甜味(TSS>12 ,pH?5),F(xiàn)2群體分離出4種類型,即甜味(TSS >12,pH>6)、酸味(TSS?8,pH ?5)、酸甜味(TSS >12,pH?5)和不甜不酸(TSS?8,pH>6)。采用Super-BSA技術(shù),父本、母本及3個(gè)混池共獲得12 438 270 reads。深度大于10x以上的基因型的SLAF標(biāo)簽 46 087個(gè),整體平均深度達(dá)161.81x,多態(tài)性的SLAF 標(biāo)簽4 480個(gè),分別得到與含糖量性狀相關(guān)差異標(biāo)記114個(gè)、酸度性狀相關(guān)差異標(biāo)記215個(gè)。其中,連續(xù)3個(gè)以上滿足分離比例的標(biāo)記所在的區(qū)域即為關(guān)聯(lián)區(qū)域,得到6個(gè)含糖量性狀相關(guān)候選區(qū)域,區(qū)域內(nèi)共有13個(gè)差異標(biāo)記,23個(gè)酸度性狀相關(guān)候選區(qū)域,區(qū)域內(nèi)共有48個(gè)差異標(biāo)記。13個(gè)甜味性狀差異標(biāo)記中1個(gè)被定位在雙親基因組上、并處在功能基因的外顯子中;48個(gè)酸度性狀差異標(biāo)記中3個(gè)定位在雙親基因組上并處在功能基因的外顯子中(表1)。

    對(duì)1個(gè)含糖量性狀相關(guān)功能基因及3個(gè)酸度性狀相關(guān)功能基因的SLAF標(biāo)簽的多態(tài)性序列,利用Primer Premier 5.0軟件各設(shè)計(jì)引物1對(duì),引物序列見(jiàn)表2,以父本、母本、甜味、酸味、不甜不酸味單株為材料,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以發(fā)展含糖量、酸度性狀功能性標(biāo)記。將只在母本、甜味及父本、酸味單株中有擴(kuò)增產(chǎn)物,片段分別為249、66、283、274 bp,而在不甜不酸單株中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記分別作為含糖量、酸度性狀功能性標(biāo)記。結(jié)果成功發(fā)現(xiàn)了1個(gè)含糖量性狀相關(guān)功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01(圖1),3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02(圖2)、SLAF50072-S03(圖3)和SLAF31212-S04(圖4)。

    進(jìn)一步對(duì)F1、F2單株材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證獲得的含糖量、酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記的穩(wěn)定性。含糖量性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01在F1及F2中甜味、酸甜味材料中擴(kuò)增出249 bp條帶,而F2中不酸不甜、酸味材料中沒(méi)有出現(xiàn)(圖5)。酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03、SLAF31212-S04只是在F1及F2中酸味、酸甜味材料中擴(kuò)增出66、283、274 bp條帶,而F2中不甜不酸、甜味材料中沒(méi)有出現(xiàn)(圖6、圖7、圖8),說(shuō)明4個(gè)功能性分子標(biāo)記是穩(wěn)定的。

    3 討 論

    前人基于傳統(tǒng)遺傳圖譜對(duì)甜瓜糖、酸性狀進(jìn)行了QTL定位[8,21-23],但并未進(jìn)行分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。Super BAS是利用生物信息學(xué)、高通量測(cè)序技術(shù),通過(guò)30~200個(gè)體較大規(guī)模的混池,10 000+SNP高密度掃描,獲得覆蓋全基因組的海量序列信息,從而保證了基因定位的功效和準(zhǔn)確性。目前利用高通量測(cè)序結(jié)合集群分離分析法(BSA)已成功精細(xì)定位水稻真菌稻瘟病[27]、小麥高籽粒蛋白含量基因GPC-B1[28]。本研究利用Super BSA技術(shù),通過(guò)對(duì)具有不同甜味、酸味性狀親本及極端子代DNA混池的全基因組DNA標(biāo)記高密度掃描,精細(xì)定位甜瓜含糖量、酸度性狀區(qū)域,開(kāi)發(fā)出1個(gè)含糖量性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01和3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。

    通過(guò)應(yīng)用甜瓜果實(shí)甜味、酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記,在不同世代間重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便,為甜瓜品質(zhì)性狀基因的分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要的標(biāo)記基礎(chǔ),可簡(jiǎn)便、快速的應(yīng)用于育種實(shí)踐,從而將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型。對(duì)于甜瓜含糖量、酸度性狀的改良和改善具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義,也為分子育種、系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)資源鑒定中分子標(biāo)記的篩選提供了一種重要的開(kāi)發(fā)途徑。

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