水稻香味基因分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

閆 影，諸光明，張麗霞，萬常照，曹黎明，趙志鵬，吳書俊＊

（1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物育種栽培研究所，上海201403；2上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海201800）

隨著當(dāng)前城鄉(xiāng)居民稻米消費水平的提高，高端優(yōu)質(zhì)大米市場開發(fā)的經(jīng)濟價值和市場前景日益受到關(guān)注。而香味作為評價優(yōu)質(zhì)米的一項重要指標(biāo)，由于其在大米儲藏和米飯蒸煮過程中散發(fā)出怡人香氣，一直受到消費者的青睞，市場上的高檔大米也大多為香米。長期以來，優(yōu)質(zhì)香味米品種的選育受到廣泛重視。傳統(tǒng)育種過程中鑒別水稻材料是否具有香味通常采用咀嚼法［1］或KOH 法［2］，這2 種方法主要依賴人的感官進(jìn)行判定。如咀嚼法依靠味覺，咀嚼樣品多時誤差較大，而且香味以粒為單位分離，低世代單株上會出現(xiàn)既有香粒也有非香粒，鑒定結(jié)果難以準(zhǔn)確可靠；KOH 法除了費時費工，且在鑒定葉片時易受強烈的葉綠素氣味干擾，同樣存在準(zhǔn)確性差的問題。另外遺傳研究表明，香味為單隱性質(zhì)量性狀，在雜交分離后代中，純合香型單株或籽粒一般只占25%左右（香∶非香為1∶3），按傳統(tǒng)檢測方法易使一半含有香味基因的優(yōu)良雜合個體在選擇過程中被淘汰，不利于優(yōu)良香型新品種的選育［3］。因此，如何準(zhǔn)確、快速、簡單地對香味進(jìn)行鑒定一直是香稻育種中的難題之一。

研究表明，香稻含有多種揮發(fā)性化合物，而直接與水稻香味相關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)為2－乙酰－1－吡咯啉（2－acetyl－1－pyrroline，2AP）［4－5］。由于甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2功能的缺失會導(dǎo)致2AP前體物質(zhì)的增加，從而積累2AP 使稻米產(chǎn)生香味［6］。自Bradbury等首先發(fā)現(xiàn)水稻第8染色體Badh2基因第7外顯子8bp缺失及3bp突變產(chǎn)生無功能蛋白導(dǎo)致水稻香味以來，該基因序列已經(jīng)有13處位點的變異被相繼報道［7－8］。同時根據(jù)香味基因序列差異開發(fā)了一系列的分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記鑒定香味基因作為一種快速、準(zhǔn)確、有效的手段已經(jīng)開始應(yīng)用于香稻分子育種。

王軍等［9］針對第2外顯子7bp和第7外顯子8 bp缺失分別設(shè)計了檢測香味基因的InDel標(biāo)記In－Del－E2和InDel－E7。邵高能等［10］在香稻品種‘在妙香糯’中發(fā)現(xiàn)Badh2的等位基因在第4和5外顯子之間共發(fā)生了803bp的缺失，并開發(fā)了可以檢測該基因型的分子標(biāo)記FMbadh2－E4－5。本研究針對Badh2基因第7外顯子處同時存在8bp缺失及3 bp突變的序列特點利用擴增受阻突變體系PCR（ARMS，amplification refractory mutation system）技術(shù)進(jìn)行等位基因特異擴增，開發(fā)了新的功能標(biāo)記YY5－YY8。

本研究利用前面所述的2個分子標(biāo)記InDel－E2和FMbadh2－E4－5，以及本實驗開發(fā)的分子標(biāo)記YY5－YY8，對80份來源廣泛的香稻資源進(jìn)行香味基因檢測，旨在明確這些資源的香味基因突變類型，有助于科學(xué)、合理選擇香稻資源開展優(yōu)質(zhì)香稻分子育種，大幅提高優(yōu)質(zhì)香稻育種效率。

1 材料和方法

1．1 水稻材料

本研究中80份香稻資源來源于中國不同生態(tài)區(qū)以及泰國、越南、日本等地，大致可分為三大類：粳稻、秈稻和糯稻（表1），同時以非香粳稻品種‘秀水123’為實驗對照。所有水稻材料均于2013年夏季種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗站，常規(guī)水肥管理。

1．2 分子標(biāo)記

本實驗所用3個分子標(biāo)記InDel－E2、FMbadh2－E4－5和YY5－YY8分別是針對香味基因Badh2 在其第2、4、5、7外顯子等3個主要變異區(qū)域相關(guān)堿基缺失或突變而設(shè)計，其中InDel－E2和FMbadh2－E4－5分別為王軍等和邵高能等所開發(fā)，YY5－YY8為本研究所自主設(shè)計。各標(biāo)記擴增產(chǎn)物大小及其引物序列見表2，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)過預(yù)備實驗，該3個標(biāo)記均表現(xiàn)反應(yīng)體系穩(wěn)定、實驗重復(fù)性好、結(jié)果清晰可靠。

1．3 DNA 提取和PCR 擴增

利用CTAB 法提取水稻葉片全基因組DNA［11］。

反應(yīng)體系20μL，包 含DNA模 板2．0μL，1 0mmol／L dNTP 0．4μL，25mmol／L MgCl21．6μL，10×Buffer 1．6μL，引物等體積混合液1．6μL，1 U／μLTaq酶0．2μL，加ddH2O 12．6μL。所用試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

表1 本實驗所用水稻材料Table 1 Rice varieties of this experiment

表2 本實驗所用3個分子標(biāo)記詳細(xì)信息Table 2 Detailed information of three molecular markers in this experiment

反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃～60℃退火30s，72℃復(fù)性30s，共33個循環(huán)；72℃延伸10min，10℃保存。

1．4 電泳檢測

標(biāo)記YY5－YY8和FMbadh2－E4－5的擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，GelRed染料染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；標(biāo)記InDel－E2的擴增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 香味基因新功能標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)Badh2基因的克隆結(jié)果，針對第7外顯子處8bp缺失和3bp突變，利用軟件Prime premier 5．0設(shè)計該突變類型的功能標(biāo)記YY5－YY8（圖1）。

該標(biāo)記由4 個序列組成，PCR 擴增時，外部上下游序列在香稻基因序列和非香稻基因序列中均可以在相應(yīng)位置結(jié)合，而內(nèi)部上游序列只與非香稻或是非本突變類型香稻基因序列相應(yīng)位置結(jié)合，內(nèi)部下游序列只與本突變類型香稻基因序列相應(yīng)位置結(jié)合。所以擴增產(chǎn)物為583和169bp片段時，則該材料 為該突變類型香稻；產(chǎn)物為5 9 1和449bp片段時，則材料為非香稻或非本突變類型香稻。

圖1 基因badh2第7外顯子缺失位置區(qū)域序列及分子標(biāo)記YY5－YY8Fig．1 Base sequences of deleted region in exon 7of gene badh2and molecular marker YY5－YY8

以已知屬于該突變類型的香稻材料‘太湖香粳’和‘紫香糯861’，非該突變類型香稻材料‘大華香粳’和‘南粳46’，以及非香材料‘秀水123’的基因組DNA 為模板，利用標(biāo)記YY5－YY8進(jìn)行PCR 擴增，電泳檢測結(jié)果表明，‘太湖香粳’和‘紫香糯861’可擴增出大小分別為583和169bp的2個片段，‘大華香粳’、‘南粳46’和‘秀水123’擴增出大小分別為591和449bp 的2 個片段（圖2），證明標(biāo)記YY5－YY8可用于篩選出基因Badh2第7外顯子8bp缺失和3bp突變導(dǎo)致香味的水稻材料，而不能區(qū)分其他突變類型香稻材料和非香稻材料。

2．2 香稻材料基因型的分子標(biāo)記檢測

2．2．1 標(biāo)記YY5－YY8的檢測結(jié)果 分別以80份香稻材料的基因組DNA 為模板，利用標(biāo)記YY5－YY8進(jìn)行PCR 擴增。電泳結(jié)果（部分結(jié)果如圖3，A）表明，共有‘廣陵香糯’、‘廣陵香粳’及‘江西香稻’等26份材料可擴增出大小分別為583和169bp的2個片段，說明這些香稻材料在Badh2基因第7外顯子處存在8bp缺失和3bp突變，屬于同一種香味基因變異類型。其余材料均擴增出大小分別為591和449bp的2個片段，說明這些香稻材料不屬于第7外顯子變異類型。

2．2．2 標(biāo)記InDel－E2檢測結(jié)果 分別以80份香稻材料的基因組DNA 為模板，利用標(biāo)記InDel－E2進(jìn)行PCR 擴增。電泳結(jié)果（部分結(jié)果如圖3，B）表明，共有‘大華香粳’、‘豐優(yōu)香’及‘關(guān)西香’等37份香稻材料可擴增出大小為100bp的片段，說明這些香稻材料在Badh2基因第2外顯子處存在7bp缺失，屬于同一種香味基因變異類型。其余材料均擴增出一條大小為107bp的片段，說明這些香稻材料不屬于第2外顯子變異類型。

2．2．3 標(biāo)記FMbadh2－E4－5檢測結(jié)果 分別以80份香稻材料的基因組DNA 為模板，利用標(biāo)記FMbadh2－E 4－5進(jìn)行PCR擴增。電泳結(jié)果（部分結(jié)果如圖3，C）表明，所有材料均擴增出一條大小為1 123bp的片段，表明這些香稻材料在Badh2基因第4、5外顯子處不存在缺失，均不屬于這種香味基因變異類型。

圖2 YY5－YY8對5份材料電泳檢測圖Fig．2 5materials were genotyped with YY5－YY8marker

3個標(biāo)記檢測統(tǒng)計結(jié)果見表3。由表3可以看出，80份香稻材料被分為2種香味基因突變類型，其中26份材料為第7外顯子突變類型，37 份材料為第2外顯子突變類型，無第4、5外顯子突變類型材料。

另外，本實驗材料中還有17份香稻均不屬于這3種突變類型，有可能是已發(fā)現(xiàn)的其他突變類型，因此需要進(jìn)一步搜集或開發(fā)可以鑒別出這些材料的功能分子標(biāo)記；也有可能是尚未發(fā)現(xiàn)的新香味基因，可以根據(jù)這些材料開展新基因的鑒定、定位及克隆。

3 討 論

圖3 3個標(biāo)記對部分香稻材料電泳檢測圖Fig．3 Some rice fragrant materials were genotyped with three molecular markers

表3 80份香稻材料分子標(biāo)記檢測結(jié)果分類Table 3 The detection results of 80fragrant rice materials with molecular markers

香味是稻米重要的食味品質(zhì)性狀，香稻資源遍布全球。到目前為止，認(rèn)為水稻香味主要與第8染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2 相關(guān)［12］，香味基因Badh2的致香環(huán)節(jié)是由其第2外顯子、第4、5外顯子及第7 外顯子相關(guān)區(qū)域堿基缺失引起的。已有研究表明，大多數(shù)的香稻材料都是由于在Badh2基因第2外顯子和第7外顯子處發(fā)生堿基缺失而產(chǎn)生香味［13－14］，在第4、5外顯子處發(fā)生堿基缺失的香稻材料報道極少，同時也有一些香稻材料在這3個區(qū)域都沒有發(fā)生堿基變異。本研究通過3個香味特異分子標(biāo)記在分子水平上對80份香稻資源進(jìn)行了檢測分類，共有63份香稻屬于Badh2基因第2外顯子和第7外顯子處發(fā)生堿基變異，沒有發(fā)現(xiàn)第4、5外顯子處發(fā)生堿基缺失的材料，另外也有17份香稻不屬于這3種基因變異類型。

充分挖掘利用香稻資源，結(jié)合分子標(biāo)記開展香味基因輔助選擇是當(dāng)前進(jìn)行優(yōu)質(zhì)香稻品種選育的主要策略，而分子標(biāo)記檢測的簡易程度和成本高低是影響分子育種效率的重要因素［15－16］。已有香稻鑒定及利用研究［17－18］主要圍繞Badh2基因第2 外顯子和第7外顯子堿基變異展開，且大多為設(shè)計的Indel類型標(biāo)記，多態(tài)性片斷僅有7或8bp堿基差異，必須借助聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察結(jié)果，操作程序繁瑣不便于大量開展標(biāo)記檢測工作。本研究針對前人研究的不足，除根據(jù)Badh2基因的3處堿基變異均設(shè)計了相關(guān)分子標(biāo)記進(jìn)行香稻資源檢測外，更主要圍繞第7外顯子處堿基變異特點利用擴增受阻突變體系PCR 技術(shù)開發(fā)了4 引物標(biāo)記，PCR 產(chǎn)物多態(tài)性差異顯著，借助瓊脂糖凝膠電泳即可觀察，電泳時間短，便于進(jìn)行大量香味材料檢測，更有利于提高香稻分子育種效率。

水稻香味的產(chǎn)生除了香味基因起主導(dǎo)作用外，還與產(chǎn)地氣候、土壤及水等因素密切相關(guān)［19－20］。水稻香氣的類型及濃淡主要是由香味遺傳基因或背景控制還是受生長環(huán)境因子決定，目前研究還沒有闡明。本研究旨在先通過分子標(biāo)記對香稻資源進(jìn)行香味基因分類，今后將利用氣相色譜－質(zhì)譜技術(shù)［21］對屬于同一香味基因類型的香稻資源進(jìn)行香味定量測定，結(jié)合對香味基因類型和生長環(huán)境因素的控制進(jìn)一步開展香味產(chǎn)生的內(nèi)外在機理研究。

［1］DHULAPPANAVAR C．V．Inheritance of scent in rice［J］．Euphytica，1976，25：659－662．

［2］SOOD B C，SIDDIQ E A．A rapid technique for scent determination in rice［J］．IndianJournalofGenetics＆ PlantBreeding，1978，38（2）：268－271．

［3］REN J SH（任鄄勝），XIAO P C（肖培村），CHEN Y（陳 勇），etal．Study on heredity of aroma genes in several maintainer lines of aromatic rice［J］．Seed（種子），2004，23（12）：24－28（in Chinese）．

［4］BUTTERY R G，LING L C，JULIANO B O，etal．Cooked rice aroma and 2－acetyl－1－pyrroline［J］．Agric．FoodChem．，1983，31（4）：823－826．

［5］TSUZUKI E，SHIMOKAWA E．Inheritance of aroma in rice［J］．Euphytica，1990，46（2）：157－159．

［6］CHEN S H，YANG Y，SHI W W，etal．Badh2，encoding betaine aldehyde dehydrogenase，inhibits the biosynthesis of 2－acetyl－1－pyrroline，a major component in rice fragrance［J］．PlantCell，2008，20（7）：1 850－1 861．

［7］MICHAEL J KOVACHA，MARIAFE N CALINGACIONB，MELISSA A FITZGERALD，etal．The origin and evolution of fragrance in rice（OryzasativaL．）［J］．PNAS，2009，106（34）：14 444－14 449．

［8］SHI Y Q，ZHAO G C，XU X L，etal．Discovery of a new fragrance allele and development of functional markers for identifying diverse fragrant genotypes in rice［J］．MolecularBreeding，2013，32（3）：701－708．

［9］WANG J（王 軍），YANG J（楊 杰），CHEN ZH D（陳志德），etal．Development and application of fragrance gene markers in rice［J］．MolecularPlantBreeding（分子植物育種），2008，6（6）：1 209－1 212（in Chinese）．

［10］SHAO G N，TANG A，TANG S Q，etal．A new deletion mutation of fragrant gene and the development of three molecular markers for fragrance in rice［J］．PlantBreeding，2011，130（2）：172－176．

［11］LIANG G H（梁國華），CAO X Y（曹小迎），SUI J M（隋炯明），etal．Fine mapping of rice semi－dwarf genesd－g［J］．ChineseScienceBulletin（科學(xué)通報），2004，49（8）：778－783（in Chinese）．

［12］BRADBURY L M T，F(xiàn)ITZGERALD T L，HENRY R J，etal．The gene for fragrance in rice［J］．PlanBiotechnologyJournal，2005，3（3）：363－370．

［13］XU X L（徐小龍），ZHAO G CH（趙國超），LI J Y（李建粵）．Development of molecular markers used to identify two type of fragrant rice and analysis of mutation sites ofBadh2gene in 24varieties of fragrant rice［J］．PlantDiversityandResources（植物分類與資源學(xué)報），2011，33（6）：667－673（in Chinese）．

［14］WANG J（王 軍），ZHONG W G（仲維功），CHEN ZH D（陳志德），etal．Progress of studies on the fragrance of rice and its application［J］．JournalofJinlingInstituteofTetchnology（金陵科技學(xué)院學(xué)報），2008，24（2）：53－57（in Chinese）．

［15］REN S J（任三娟），ZHOU Y F（周屹峰），SUN CH（孫 出），etal．Efficient selection of cytoplasmic male sterile（CMS）lines of Aromatic indica rice by fragrance（fgr）gene functional molecular marker 1F／1R［J］．JournalofAgriculturalBiotechnology（農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報），2011，19（4）：589－596（in Chinese）．

［16］ZHANG CH H（張春紅），ZHANG S B（張所兵），ZHAO Q Y（趙慶勇），etal．Study on aroma characteristics and molecular basis of Japonica rice（OryzasativaL．）cultivars with different fragrance alleles［J］．ChineseAgriculturalScienceBulletin（中國農(nóng)學(xué)通報），2009，25（21）：36－42（in Chinese）．

［17］LI H L（李洪亮），CHAI Y SH（柴永山），ZHANG Y L（張雨良），etal．Application of allele－specific amplification in the genetic improvement of rice fragrance［J］．Crops（作物雜志），2014，（2）：52－55（in Chinese）．

［18］LU Y T（陸艷婷），LIU Q L（劉慶龍），WANG J M（王俊敏），etal．Detection of rice fragrant gene by allele－specific amplification［J］．Acta AgronomicaSinica（作物學(xué)報），2008，34（2）：243－246（in Chinese）．

［19］趙國超．香稻分子育種及香味形成分子機理的初步研究［D］．上海：上海師范大學(xué)，2010．

［20］ZHANG X W（張現(xiàn)偉），WANG J（王 靜），TANG Y Q（唐永群），etal．Aroma genetic breeding and its cultivation of aromatic rice［J］．GenomicsandAppliedBiolog（基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)），2010，29（3）：550－555（in Chinese）．

［21］YING X H（應(yīng)興華），XU X（徐 霞），CHEN M X（陳銘學(xué)），etal．Determination of 2－acetyl－1－pyrroline in aroma rice using gas chromatography－mass spectrometry［J］．ChineseJournalofChromatography（色譜），2010，28（8）：782－785（in Chinese）．