‘馬哈利’櫻桃雄性不育細胞學觀察

李 彬，蔡宇良＊，趙曉軍，宛 甜，高天翔

（1 西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西楊凌712100；2 銅川市園藝工作站，陜西銅川727031）

‘馬哈利’櫻桃（Prunusmahaleb‘Mahaleb’）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus），是西北農(nóng)林科技大學園藝學院從匈牙利引進的櫻桃育種資源植物，由于其抗根癌病性強，又具有矮化、耐鹽堿等許多優(yōu)良的生物學特性［1］，是世界性的甜櫻桃砧木，現(xiàn)己成為西北地區(qū)甜櫻桃的主要砧木之一。關于‘馬哈利’生殖發(fā)育的研究較少，張雪等［2］對‘馬哈利’櫻桃的大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育進行了研究，但并沒有涉及到雄性不育的情況，‘馬哈利’櫻桃結實率低可能與雄性不育有關。果樹雄性不育的現(xiàn)象非常普遍，前人在果樹雄性不育的機理上也做了相關基礎研究，劉玲等［3］在棗中發(fā)現(xiàn)了雄性不育的現(xiàn)象；沈元月等［4］在白桃的雄性不育研究中發(fā)現(xiàn)了小孢子消失的現(xiàn)象；杏的雄性不育品種‘Trevatt Blue’（P.armeniaca）中也觀察到了小孢子的退化問題［5］，櫻桃的雄性不育研究未見報道，本試驗就在‘馬哈利’櫻桃觀察到了雄性不育現(xiàn)象。

有效利用‘馬哈利’櫻桃雄性不育株，能夠大幅度提高雜交效率［6］，而且在保持苗木一致性，保證栽培苗木整齊度方面也有很大的意義［7］。本研究在對‘馬哈利’櫻桃雄配子體發(fā)育過程進行解剖學研究的基礎上，以期在試驗站保存的‘馬哈利’野生種質(zhì)資源中尋找到雄性不育株系，通過對不育株和正常可育株花藥發(fā)育過程的比較，闡明其雄性不育發(fā)生的時期、方式和特征，完善對‘馬哈利’櫻桃生殖生物學的研究，為進一步利用‘馬哈利’櫻桃雄性不育特性培育櫻桃優(yōu)質(zhì)苗木提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料獲得與采集

試驗材料采自西北農(nóng)林科技大學眉縣櫻桃試驗園。試驗品種為正常開花結實的‘馬哈利’實生種，共6株，經(jīng)過花粉活力測定等試驗，確定其中1株為雄性不育株，其余5株為正常發(fā)育株（對照）。取樣時間為2013年8月到2014年5月，2014年3月1日花芽萌動開始至成熟花粉形成（4月1日）期，每天采集不同發(fā)育狀態(tài)的花芽或花蕾20個，其余時間每2周取樣1次，每次采集10個樣。

‘馬哈利’花芽取樣時從整個樹體的東西南北四個方向，上中下三層以及內(nèi)外膛分別取樣，以確保試驗結果不會因為花芽受到環(huán)境因素與生長狀態(tài)的影響而造成誤差。

開花期取少量未經(jīng)授粉‘馬哈利’新鮮花芽，剝?nèi)∑渲谢ǚ?，常?guī)石蠟切片方法（如下）和常規(guī)干燥處理，分別用作顯微鏡和電鏡掃描材料。

1.2 方 法

1.2.1 石蠟切片 用于細胞學觀察的花芽，采用FAA 固定液固定，4 ℃冰箱保存。按照常規(guī)石蠟切片法制片，分別經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋步驟后切片，期間采取愛氏蘇木精整體染色，對樣品進行橫切與縱切，切片厚度8μm，中性樹膠封片［8］，選取具有代表性并且清晰的樣本，在Olympus BX－51型光學顯微鏡下進行觀察并照相。

1.2.2 掃描電鏡 用于電鏡下掃描的材料，用戊二醛固定，經(jīng)過脫水、臨界點干燥、上銅臺噴金等步驟，在JSM－6360LV 掃描電鏡下對花藥和花粉進行觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 ‘馬哈利’櫻桃雄性不育系花藥的發(fā)育過程

‘馬哈利’櫻桃雄性不育系的花藥發(fā)育在孢原細胞時期到四分體時期的表現(xiàn)與正常株系植株的表現(xiàn)基本一致，都是在3月初花芽分化結束，3月1日左右開始出現(xiàn)雄蕊原基（圖版Ⅰ，1），孢原細胞隨后分化形成，具有很明顯的細胞核?；ㄋ幈谟涉咴毎至旬a(chǎn)生的初生壁細胞分裂分化而成，由外向內(nèi)共有表皮、藥室內(nèi)壁、中層（2層）和絨氈層5層細胞。

初生造孢細胞是由孢原細胞分裂而來，發(fā)育形成小孢子母細胞（圖版Ⅰ，2）后進入減數(shù)分裂時期。小孢子母細胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂形成2個子核，隨后進入減數(shù)分裂Ⅱ期，再次分裂之后形成四面體形狀的四分體，外面由胼胝質(zhì)壁包圍（圖版Ⅰ，3）?；ㄋ幈诩毎麆t伴隨著小孢子發(fā)育過程也持續(xù)產(chǎn)生著變化，早期的絨氈層細胞呈長方形，細胞較大，細胞質(zhì)濃厚，排列整齊。發(fā)育過程進行到單核小孢子形成時，絨氈層細胞明顯退化（圖版Ⅰ，4）直至完全消失，花藥壁最終分化發(fā)育成4室蝶形腔狀形。小孢子細胞從四分體中分離出后，細胞質(zhì)濃，細胞核大且位于細胞中央，經(jīng)過單核靠邊期（圖版Ⅰ，5）后，最終經(jīng)過發(fā)育后形成成熟花粉粒（圖版Ⅰ，6）。

與對照相比，雄性不育株系花藥發(fā)育則從四分體時期開始出現(xiàn)異常，在形成正常的四分體之后，絨氈層細胞液泡增大且細胞形狀不規(guī)則（圖版Ⅰ，7），并沒有正常退化而是向藥室中央收縮，排列開始混亂（圖版Ⅰ，8），在此過程當中，四分體形態(tài)變異，出現(xiàn)了退化的跡象。絨氈層細胞繼續(xù)擴增，把敗育的小孢子圍在藥室中央，形成整體團塊狀，最終，異常的絨氈層和敗育的小孢子核、質(zhì)開始互融，小孢子已經(jīng)完全無法正常發(fā)育并逐漸解體（圖版Ⅰ，9），最后全部消失，不育株的花藥內(nèi)花粉囊成為了同為蝶形腔狀形的空腔（圖版Ⅰ，10）。觀察還發(fā)現(xiàn)少部分不育株可以形成少量的成熟花粉，著色較深，但是大部分花粉粒在藥室破裂時著色淺呈現(xiàn)無活性狀態(tài)（圖版Ⅰ，11），出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。另外觀察到可育的花粉?？偸琴N近絨氈層和纖維層（圖版Ⅰ，12），一方面可能是為藥壁破裂散粉做準備，另一方面花粉為了吸收足夠的營養(yǎng)。

本試驗統(tǒng)計表明從雄性不育株上采集的樣品當中，91.67%實驗樣中的小孢子在四分體時期之前正常發(fā)育，從四分體時期開始絨氈層細胞和小孢子發(fā)育出現(xiàn)異常并且最終出現(xiàn)敗育的現(xiàn)象；其余8.33%的樣品發(fā)育情況并沒有出現(xiàn)異常，與花粉正常發(fā)育的對照組相比在發(fā)育過程并無區(qū)別，四分體時期之后小孢子發(fā)育成為花粉，絨氈層正常退化，但是在藥壁開裂時期只有極小部分花粉粒具有活力，絕大部分呈現(xiàn)出無活力的狀態(tài)，出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。

2.2 開花期花藥和花粉的掃描電鏡觀察

雄性不育系的植株與正常植株相比，除了在花粉發(fā)育過程當中的區(qū)別之外，在開花期也有很顯著的特征。在同一比例尺下，正常的花藥不僅體積大，而且飽滿，從外形上可以明顯看出4室蝶形的形狀（圖版Ⅰ，13），而敗育的花藥外形干癟，體積遠小于正?；ㄋ帲▓D版Ⅰ，14）。將花藥剝開繼續(xù)觀察，可以觀察到正常成熟花藥出粉量大（圖版Ⅰ，15），且花粉粒飽滿呈扁三角形狀，外具橫紋，且有3 個萌發(fā)溝（圖版Ⅰ，16）。相反可以看到，敗育花藥跟上述石蠟切片觀察結果相同，絕大部分花藥是空的（圖版Ⅰ，17），極個別有出粉的花粉粒也呈敗育狀，干癟并且看不出形狀（圖版Ⅰ，18）。

3 討 論

3.1 ‘馬哈利’雄性不育發(fā)生的形態(tài)與時期

‘馬哈利’櫻桃的小孢子形態(tài)在四分體時期前并沒有發(fā)現(xiàn)異常，隨后在四分體時期的絨氈層細胞排列混亂，部分細胞當中出現(xiàn)液泡，絨氈層膨大并與小孢子粘連在一起，阻礙了小孢子正常的減數(shù)分裂，最終一同降解消失，不能形成正常的花粉粒，最終出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，這與韓愛華等［9］對“新梨7號”花粉敗育途徑的研究、羅來水等［10］在桃樹雄性不育的研究等關于雄性不育株系花粉發(fā)育觀察的結果相一致。但關于其小孢子發(fā)育異常的生化及分子機制還有待進一步深入研究。

根據(jù)Laser針對CMS類型花粉敗育時期的統(tǒng)計結果和Kaul針對NMS類型敗育時期的統(tǒng)計結果來看［11］，四分體時期以后敗育比例達到70%，減數(shù)分裂前、減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后各時期敗育的比例大體相同，從孢原細胞分化開始，每個過程都可能出現(xiàn)導致雄性不育發(fā)生的異?，F(xiàn)象，本試驗結果中四分體時期以后出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，符合前人的研究結果。

3.2 ‘馬哈利’雄性不育發(fā)生的原因

在本次觀察過程中，還出現(xiàn)了一部分花粉未完全成熟時花藥壁就提前破裂散粉的情況，這部分花粉著色淺且活力弱，可能是‘馬哈利’雄性不育的另一種類型。結合絨氈層液泡化并且膨大的現(xiàn)象，以及對敗育花粉粒形態(tài)學觀察，可以確認‘馬哈利’雄性不育跟小孢子發(fā)育時期營養(yǎng)物質(zhì)的供應有著比較密切的聯(lián)系，而且發(fā)育不整齊，內(nèi)含物不足，形態(tài)不飽滿的花粉也會造成坐果率和結實率偏低。綜合‘馬哈利’敗育的整個過程，絨氈層細胞的異常分化起到了很大作用。絨氈層細胞是包裹在花粉母細胞之外、藥壁最內(nèi)層的一層細胞［12］。在花粉形成和發(fā)育的過程當中，絨氈層一個很重要的作用就是在小孢子發(fā)育過程當中轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)［13］。另外一方面，絨氈層在發(fā)育過程中也會分泌和提供胼胝質(zhì)酶、孢粉素和花粉囊液等對發(fā)育有重要影響的物質(zhì)［14］。參考前人研究和本試驗結果，‘馬哈利’在四分體時期絨氈層液泡化并且異常膨大，一方面，其細胞膨大的過程當中本身消耗了大量的物質(zhì)，造成了發(fā)育物質(zhì)對外運輸?shù)牟蛔?，同時擠壓了小孢子的發(fā)育空間；另一方面，絨氈層細胞異常發(fā)育導致分泌物不足或者沒有分泌物也嚴重影響了諸如四分體正常釋放小孢子或者小孢子正常減數(shù)分裂等發(fā)育過程。

另外，耿三省［15］、葉要妹［16］等在對辣椒、百日草等雄性不育系材料進行研究的過程當中，都對花器做了形態(tài)學觀察，部分植物的不育系會出現(xiàn)花朵張開度、花瓣或者花絲等數(shù)據(jù)有別于正常發(fā)育植株的情況，但是在本試驗觀察過程中發(fā)現(xiàn)，‘馬哈利’雄性不育系的花器與正?？捎仓甑幕ㄆ魇菦]有區(qū)別的，維管束和花絲等組織均正常發(fā)育，這為田間尋找雄性不育株系帶來了困難，但是從側面證明其他的藥壁組織的發(fā)育和‘馬哈利’雄性不育并沒有很明確的關系。

本試驗表明，藥壁組織及其他組織均沒有直接出現(xiàn)敗育或者營養(yǎng)供給異常的現(xiàn)象，表明‘馬哈利’雄性不育株系的花粉在發(fā)育過程當中破壞了絨氈層的正常發(fā)育，致使絨氈層細胞異常膨大和提前的程序性死亡，進而造成了小孢子的異常發(fā)育。一般認為絨氈層發(fā)育和行為的異常是雄性不育的基因調(diào)控所導致的，它們的表達與否涉及到了敗育現(xiàn)象是否出現(xiàn)［17］，目前關于‘馬哈利’雄性不育決定基因的研究還處于空白階段，雄性不育性狀的顯隱性、控制基因的作用時期以及發(fā)生敗育的過程當中水分營養(yǎng)運輸、內(nèi)源激素分泌等問題還需要通過分子標記和生理生化實驗來解決［18］，但關于其小孢子發(fā)育異常的生化及分子機制還有待進一步深入研究，這樣才能明確‘馬哈利’雄性不育的機理和原因，為進一步利用提供理論基礎和技術保障。

在果樹的發(fā)育過程中，其雄性育性是環(huán)境調(diào)控一定基因型表達出的結果，在考慮到雄性不育基因等遺傳因素帶來影響的同時，還發(fā)現(xiàn)‘馬哈利’的可育花粉總是靠近絨氈層，距離藥壁比較近，跟生境敏感型雄性不育的部分特征相似［19］，這表明‘馬哈利’雄性不育可能在一定程度上也會受到環(huán)境的影響，結合敗育過程跟營養(yǎng)物質(zhì)缺失有關，建議在‘馬哈利’小孢子分化發(fā)育的敏感時期，加強果園的水肥管理，盡量創(chuàng)造好的發(fā)育條件，提高受精成活率，達到育種和高產(chǎn)的目的。

圖版Ⅰ Ta.絨氈層；Tt.四面體型四分體PlateⅠ Ta.Tapetum；Tt.Tetrahedral tetrads

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