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    塞來昔布聯(lián)合放療對人膽管癌細(xì)胞凋亡的作用研究

    2015-07-02 09:28:42王陽鄒明雷呂晶晶付培彪
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2015年10期
    關(guān)鍵詞:放療

    王陽 鄒明雷 呂晶晶 付培彪

    [摘要] 目的 研究人膽管癌細(xì)胞在塞來昔布和放療作用下發(fā)生凋亡的作用機(jī)制。 方法 將QBC939細(xì)胞株分為四組:對照組、塞來昔布組(C組)、放療組(R組)和塞來昔布聯(lián)合放療組(C+R組,聯(lián)合組),分別進(jìn)行不同濃度的塞來昔布和不同劑量X線作用后,采用CCK-8法、流式細(xì)胞技術(shù)和Western blot等方法分別檢測各組細(xì)胞生長、凋亡率及survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 聯(lián)合組的凋亡率明顯增加,從3.527%升至23.364%(P<0.05),survivin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論 應(yīng)用塞來昔布對接受放療的人QBC939細(xì)胞株有凋亡增敏作用,下調(diào)survivin的表達(dá)是其機(jī)制之一。

    [關(guān)鍵詞] 塞來昔布;膽管細(xì)胞癌;放療;survivin基因

    [中圖分類號] R735.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2015)10-0019-03

    膽管細(xì)胞癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,因其解剖位置特殊,早期診斷較困難,可手術(shù)切除的患者不到20%,放化療是中晚期患者主要治療手段,但放療效果受到腫瘤敏感性的限制。塞來昔布作為一種COX-2抑制劑,在近年研究中被認(rèn)為具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[1,2]。本研究探討體外條件下塞來昔布對接受X線放療的人QBC939細(xì)胞凋亡的作用及可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料及細(xì)胞培養(yǎng)

    QBC939人膽管癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫,塞來昔布購自南京德寶生化有限公司,細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,兔抗人survivin多克隆抗體及β-actin購自Santa-Cruz公司,CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物科技研究所。細(xì)胞培養(yǎng)條件:37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究時(shí)間2012年1月~2013年1月。

    1.2 CCK-8法檢測細(xì)胞生長

    取傳代培養(yǎng)的對數(shù)生長期QBC,939細(xì)胞制成1×105個(gè)/L細(xì)胞懸液,種植在96孔板中,每孔100 μL。設(shè)為調(diào)零組(不含細(xì)胞的培養(yǎng)液),對照組(常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞,不接受塞來昔布及放療),實(shí)驗(yàn)組(分別加入濃度為25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L的塞來昔布,X線放療劑量分別為2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy),實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后實(shí)驗(yàn)組每孔加CCK-8試劑10 μL,再培養(yǎng)2 h后,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定每孔的吸光度,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,并進(jìn)一步計(jì)算出塞來昔布的IC50=64.2 μmol/L。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇濃度65 μmol/L塞來昔布。X線放療的IC50為5.83 Gy,選擇劑量6 Gy用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)×100%。

    1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

    將實(shí)驗(yàn)分為四組,每組樣本數(shù)為10,分組設(shè)置如下:對照組單純培養(yǎng)細(xì)胞;塞來昔布組(C組)加入濃度65 μmol/L塞來昔布;放療組(R組)給予劑量6 Gy X線照射;塞來昔布聯(lián)合放療組(C+R組)先給予濃度65 μmol/L塞來昔布24 h后更換培養(yǎng)液,再給予劑量6 Gy的X線照射細(xì)胞,各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞并離心,按試劑盒說明書進(jìn)行檢測,凋亡細(xì)胞的比例由Cell Quest Pro 軟件計(jì)算,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 Western blot蛋白檢測

    收集上述各組細(xì)胞,每組樣本數(shù)為10,加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,調(diào)整各組總蛋白,使各組總蛋白濃度相同。經(jīng)15%SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉后加入一抗(兔抗人survivin多克隆抗體),工作濃度為1∶1000,再加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體),工作濃度為1∶6000。同樣方法進(jìn)行內(nèi)參蛋白(β-actin)的抗體孵育。發(fā)光、顯影、定影后制成膠片,掃描后用凝膠圖像處理體統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的凈光密度值。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞的凋亡率

    如圖1所示每組細(xì)胞的流式圖,結(jié)果顯示聯(lián)合組的凋亡率明顯高于對照組、塞來昔布組及放療組(P<0.05,見表1)。結(jié)合圖1及表1結(jié)果,推斷塞來昔布對QBC939的X線放療有增敏作用。

    2.2 Survivin蛋白的表達(dá)

    聯(lián)合組survivin蛋白表達(dá)較其他各組要明顯減弱(圖2),用相關(guān)軟件計(jì)算出各條帶的灰度值,將目的蛋白survivin/β-actin灰度值作為最終結(jié)果,以x±s表示(表1),多組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示聯(lián)合組survivin蛋白表達(dá)下降,從而加速細(xì)胞凋亡。

    3 討論

    放射療法作為治療腫瘤的一種傳統(tǒng)手段,其療效受到腫瘤放療敏感性的限制。目前研究發(fā)現(xiàn)大部分腫瘤對輻射并不敏感,在很大程度上影響了放療效果。如何通過提高腫瘤的放射敏感性以提高放療療效,是近年來研究的熱門之一。塞來昔布是一種環(huán)氧化酶-2(COX-2)選擇性抑制劑,其放射增敏作用在近年研究中受到重視[2-4]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)氧合酶-2(COX-2)在上皮組織癌(包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、皮膚的鱗狀上皮細(xì)胞癌等)中廣泛存在且過度表達(dá),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[4]。COX-2促進(jìn)前列腺素E2(PGE2)生成,而PGE2具有放射保護(hù)作用,而放射治療在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)COX-2[4,5]。塞來昔布屬于非甾體類抗炎藥(NSAIDs),是一種選擇性環(huán)氧化酶抑制劑,可通過抑制環(huán)氧化酶-1及環(huán)氧化酶-2來阻止花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化,從而阻止PGE2的放射保護(hù)作用,發(fā)揮放射增敏劑的作用。研究發(fā)現(xiàn),塞來昔布作為一種新型COX-2選擇性抑制劑,可明顯降低消化道腫瘤的發(fā)病率[4],塞來昔布通過抑制腫瘤細(xì)胞放射損傷的修復(fù),改變腫瘤細(xì)胞的周期分布,抑制腫瘤新生血管形成以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等機(jī)制,在聯(lián)合放射治療可提高放療療效,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放射的敏感性[5-7]。聶亮琴[7]等將正常少突膠質(zhì)細(xì)胞(oln93)及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(u373)分別按空白處理、單獨(dú)接受塞來昔布或X射線、塞來昔布聯(lián)合X射線4種不同處理方式研究塞來昔布的放射增敏作用及其作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)塞來昔布能抑制oln93細(xì)胞和u373細(xì)胞生長,膠質(zhì)瘤細(xì)胞組放射增敏比高于正常膠質(zhì)細(xì)胞組,并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯,聯(lián)合組與照射組比較,u373細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,Cyclin B1、DNA-PKcs、MRE1l蛋白表達(dá)下降,提示塞來昔布對u373的放射增敏作用比oln93細(xì)胞明顯,其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布及DNA損傷修復(fù)有關(guān)。

    Survivin基因作為凋亡抑制家族的重要成員,是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制基因,survivin表達(dá)與腫瘤預(yù)后、放化療敏感性密切相關(guān)[8-11]。survivin與環(huán)氧化酶-2表達(dá)的關(guān)系是塞來昔布作用機(jī)制研究的方向之一。夏歷[12]等研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中survivin的表達(dá)與COX-2相關(guān)。李偉忠等[13]通過研究環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來昔布對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞COX-2、survivin表達(dá)的影響及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,發(fā)現(xiàn)塞來昔布下調(diào)survivin mRNA及其蛋白表達(dá)的同時(shí)抑制COX-2蛋白的表達(dá),但對COX-2 mRNA表達(dá)的抑制作用較弱,提示COX-2抑制劑塞來昔布下調(diào)survivin表達(dá)的作用可能與抑制腫瘤細(xì)胞生長等作用有關(guān)。方雷[14]等通過設(shè)計(jì)合成survivin 的 siRNA 序列并轉(zhuǎn)染等方式研究survivin基因沉默對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖及對化療藥物塞來昔布敏感性的影響,發(fā)現(xiàn) survivin基因沉默48 h后,MGC-803細(xì)胞的survivin基因和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),survivin基因沉默組細(xì)胞對塞來昔布的敏感性顯著增強(qiáng),提示survivin特異性siRNA能顯著沉默MGC-803細(xì)胞survivin基因,抑制細(xì)胞增殖,并增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞對塞來昔布的敏感性。

    使用塞來昔布來降低survivin的表達(dá)從而增加放療的敏感性是本研究的設(shè)想之一。有研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中,PGE2可以激活EGFR/PI3K途徑,通過EP1受體來上調(diào)survivin的表達(dá)[15]。本研究中,Western blot法檢測到survivin蛋白的表達(dá)在聯(lián)合組中明顯下降,提示在QBC939細(xì)胞株中,塞來昔布可以加速survivin蛋白的分解或降低survivin的mRNA表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合組的凋亡率明顯高于對照組、塞來昔布組及放療組,由此我們可以推斷,塞來昔布可以下調(diào)survivin表達(dá),發(fā)揮放療增敏作用。

    本研究通過塞來昔布聯(lián)合放療作用于人膽管癌QBC939細(xì)胞株,顯示塞來昔布能增強(qiáng)放療的敏感性,提高腫瘤細(xì)胞凋亡率,其機(jī)制之一可能是抑制survivin表達(dá)。本研究對膽管癌的治療提供了一種新思路,但是仍需更多研究來證實(shí)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2015-01-09)

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