超高效合相色譜法定性與定量分析補(bǔ)腎健腦顆粒

朱瑞娟王 波 胡芳 李燦柳小亞封士蘭*周圍*

1(蘭州大學(xué)藥學(xué)院,蘭州 730000) 2(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心,蘭州 730000)

超高效合相色譜法定性與定量分析補(bǔ)腎健腦顆粒

朱瑞娟1王 波2胡芳1李燦1柳小亞1封士蘭*1周圍*2

1(蘭州大學(xué)藥學(xué)院,蘭州 730000)2(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心,蘭州 730000)

用超高效合相色譜法(Ultra performance convergence chromatography,UPC2)建立補(bǔ)腎健腦顆粒及各藥材提取物的指紋圖譜,對(duì)補(bǔ)腎健腦顆粒主要色譜峰進(jìn)行歸屬分析,并測(cè)定有效成分β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量。樣品經(jīng)乙醇提取后,進(jìn)樣1 μL,用Waters ACQUITY UPC2TMBEH柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)分離,柱溫為40℃,以超臨界CO2-0.05%H3PO4-甲醇溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫,流速為0.8 mL/min。分析補(bǔ)腎健腦顆粒和各藥材提取物的UPC2指紋圖譜,利用各峰相對(duì)保留時(shí)間、紫外光譜圖及部分對(duì)照品歸屬主峰。結(jié)果表明,補(bǔ)腎健腦顆粒UPC2指紋圖譜中15個(gè)主峰來源明確,其中12號(hào)峰為β-蛻皮甾酮,含量為380 μg/g, 15號(hào)峰為松果菊苷,含量為9.562 mg/g。與HPLC和UPLC法相比,本方法簡(jiǎn)便、快速,精密度高,重現(xiàn)性好。

超高效合相色譜;補(bǔ)腎健腦顆粒;β-蛻皮甾酮;松果菊苷

1 引 言

補(bǔ)腎健腦膠囊臨床上主要用于治療兒童多動(dòng)癥,且療效顯著[1]。但該制劑存在工藝簡(jiǎn)單粗糙,服用量大,質(zhì)量難以控制,小兒服用順應(yīng)性不好的缺點(diǎn),并且沒有定性定量方法控制其質(zhì)量。因此本研究在保證療效的基礎(chǔ)上將補(bǔ)腎健腦膠囊制成顆粒劑,克服了其服用困難的缺陷,并采用色譜法對(duì)該制劑進(jìn)行定性與定量分析,以控制其質(zhì)量。補(bǔ)腎健腦顆粒是由肉蓯蓉、懷牛膝、遠(yuǎn)志、石菖蒲等藥材經(jīng)過提取、濃縮、干燥、粉碎、制粒工序制成的復(fù)方制劑。本研究用HPLC法和UPLC法分析補(bǔ)腎健腦顆粒,在多次優(yōu)化色譜條件后,都不能將β-蛻皮甾酮和松果菊苷分離。因此,采用一種新的分離技術(shù)—超高效合相色譜(Ultra performance convergence chromatography,UPC2)[2,3],建立了補(bǔ)腎健腦顆粒及其組成藥材的指紋圖譜,歸屬分析了補(bǔ)腎健腦顆粒指紋圖譜中主要色譜峰,并建立β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量測(cè)定方法,該方法能將β-蛻皮甾酮和松果菊苷有效分離,與HPLC和UPLC方法相比,更簡(jiǎn)便、快速,且分離度高,重復(fù)性好。本實(shí)驗(yàn)利用UPC2定性定量分析了補(bǔ)腎健腦顆粒,在復(fù)雜中藥制劑質(zhì)量控制方面提供了新的思路。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

2695高效液相色譜儀、2996PDA檢測(cè)器(Waters公司);ACQUITY超高效液相色譜儀、ACQ-PDA檢測(cè)器(Waters公司);ACQUITY超高效合相色譜儀、ACQ-UPC2-PDA檢測(cè)器(Waters公司);KQ-400DB超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);EYELAOSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化)。

松果菊苷(MUST-13072403)、β-蛻皮甾酮(MUST-12122111),均購(gòu)自上海順勃生物技術(shù)有限公司;乙腈(色譜純,德國(guó)莫克公司);H3PO4(分析純,北京化工廠);甲醇(分析純,天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純,山東禹王試劑公司);純凈水(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生產(chǎn));補(bǔ)腎健腦顆粒(三批中試樣品,由蘭州中醫(yī)院腦病康復(fù)醫(yī)院提供);肉蓯蓉、懷牛膝、遠(yuǎn)志、石菖蒲藥材由蘭州黃河藥市提供。

2.2 色譜條件

采用Acqtity UPC2BEH色譜柱;系統(tǒng)背壓為1800 psi;色譜柱溫度為40℃;柱流速為0.8 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL;流動(dòng)相分別為超臨界CO2(流動(dòng)相A)和0.05%H3PO4-甲醇溶液(流動(dòng)相B),梯度洗脫:0～0.3 min,99%A;0.3～4 min,99%～90%A;4～16 min,90%～70%A;16～18 min,70%～60%A; 18～20 min,60%A;20～21 min,60%～99%A;21～25 min,99%A。檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

稱取松果菊苷對(duì)照品16.65 mg,加50%甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中,得666 mg/L的松果菊苷對(duì)照品溶液。稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品1.62 mg,用甲醇溶解并定容至50 mL,得32.4 mg/L β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液。

2.4 樣品溶液的制備

補(bǔ)腎健腦顆粒制備:按處方比例稱取肉蓯蓉、遠(yuǎn)志、懷牛膝、石菖蒲等適量,煎煮,收集濾液、濃縮、干燥、粉碎、加適量輔料制粒得補(bǔ)腎健腦顆粒。陰性樣品制備:按上述方法分別制備缺肉蓯蓉和缺懷牛膝的陰性樣品。

藥材提取物的制備:按處方分別稱取各藥材適量,按照處方提取工藝提取,收集濾液,濃縮,干燥,得藥材提取物。

2.5 供試品溶液的制備

分別取補(bǔ)腎健腦顆粒約1.00 g,各藥材提取物約0.50 g,精密稱定,置于50 mL圓底燒瓶中,加90%乙醇25 mL,回流提取2次,每次1 h,合并濾液,回收乙醇,殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?5 mL,用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑及提取條件的選擇

本研究旨在盡可能多且完全地提取樣品中的有效成分,根據(jù)各藥材所含主要有效成分的性質(zhì),本實(shí)驗(yàn)分別以50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、甲醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇對(duì)補(bǔ)腎健腦顆粒及各藥材提取物進(jìn)行超聲和回流提取,結(jié)果表明,90%乙醇回流提取,提取物指紋圖譜中峰最多。又考察提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取效率(峰面積)的影響,結(jié)果表明,25 mL溶劑提取兩次,每次30 min,提取效率最高。

3.2 色譜條件的選擇

考察了色譜柱對(duì)樣品分離效果的影響,分別選用ACQUITY UPC2TMHSS C18SB柱和ACQUITY UPC2TMBEH柱進(jìn)樣分析,結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)條件下ACQUITY UPC2TMBEH柱對(duì)樣品峰有較好的分離效果。由于流動(dòng)相對(duì)分離效果影響很大,本實(shí)驗(yàn)分別用超臨界CO2-甲醇、超臨界CO2-0.05%H3PO4-甲醇、超臨界CO2-乙腈、超臨界CO2-0.05%H3PO4-乙腈梯度洗脫,結(jié)果表明,有機(jī)溶劑采用甲醇時(shí),樣品峰有較好的分離,但有些峰峰形不好,稍有拖尾、峰形展寬。向有機(jī)溶劑中加入少量H3PO4,配成0.05%H3PO4-甲醇溶液,能改善峰形展寬及拖尾現(xiàn)象。因此選擇超臨界CO2-0.05%H3PO4-甲醇作為流動(dòng)相。

3.3 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)樣品進(jìn)樣分析,全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果248 nm波長(zhǎng)下的指紋圖譜樣品峰數(shù)最多,且吸收相對(duì)較強(qiáng),易于主峰歸屬研究。因此最終選擇248 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 專屬性考察取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液,按2.2節(jié)進(jìn)樣檢測(cè),比較陰性樣品色譜圖與對(duì)照品和樣品色譜圖(圖1),在松果菊苷和β-蛻皮甾酮峰吸收位置無干擾,表明本方法專屬性好。

3.4.2 線性考察取松果菊苷對(duì)照品溶液1.00,1.25,1.67,2.50,5.00和10.00 mL,置于10 mL棕色容量瓶中,用50%甲醇溶解并定容,得到質(zhì)量濃度分別為66.60,83.25,111.00,166.50,333.00和666.00 mg/L的系列溶液。按照上述色譜條件,每個(gè)濃度依次進(jìn)樣1 μL,以濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。取β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液1.00,1.25,1.67,2.50,5.00和10.00 mL,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得到質(zhì)量濃度分別為 3.24,4.05,5.40,8.10,16.20和32.40 mg/L的系列溶液。同樣色譜條件下,每個(gè)濃度依次進(jìn)樣1 μL,以濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸(表1)。補(bǔ)腎健腦顆粒在16min內(nèi)得到良好分離,在一定濃度范圍內(nèi),松果菊苷和β-蛻皮甾酮呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r＞0.9996),精密度RSD＜2%。

圖1 UPC2色譜圖(248 nm)A陰性;B補(bǔ)腎健腦顆粒(12 β-蛻皮甾酮;15松果菊苷);C對(duì)照品(12 β-蛻皮甾酮;15松果菊苷)Fig.1 Ultra performance convergence chromatograms(UPC2)(248 nm)of(A)negative;(B)Bushen Jiannao grains(12 β-ecdysterone;15 echinacoside)and(C)standard(12 β-ecdysterone standard;15 echinacoside)

表1 松果菊苷和β-蛻皮甾酮的線性關(guān)系Table 1 Linear relationship of echinacoside and β-ecdyserone

3.4.3 精密度、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)分別對(duì)精密度、重復(fù)性、加樣回收率進(jìn)行考察,松果菊苷和β-蛻皮甾酮日內(nèi)精密度的RSD分別為0.4%和0.3%;重復(fù)進(jìn)樣6次,兩個(gè)化合物的峰面積RSD分別為0.5%和0.5%;加樣回收實(shí)驗(yàn)(表2和表3)顯示,松果菊苷和 β-蛻皮甾酮的加樣回收率分別在99.7%～100.2%和99.8%～100.5%范圍內(nèi)。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)儀器精密度高,方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好。

表2 松果菊苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery of echinacoside

表3 β-蛻皮甾酮加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery of β-ecdyserone

3.5 UPC2與HPLC、UPLC對(duì)比分析

取2.5節(jié)制備的補(bǔ)腎健腦顆粒供試品溶液,在優(yōu)化條件下,分別用Waters高效液相色譜儀、超高效液相色譜儀和超高效合相色譜儀分析,248 nm下檢測(cè)。HPLC和UPLC指紋圖譜(圖2A和2B)顯示,兩種方法都不能將補(bǔ)腎健腦顆粒成分有效分離,且峰很少。而UPC2法(圖2C)與HPLC和UPLC法相比,樣品出峰數(shù)量明顯增多且各峰分離很好,松果菊苷和β-蛻皮甾酮峰均無干擾,且UPC2分析時(shí)間較HPLC縮短一半,充分體現(xiàn)了UPC2簡(jiǎn)便、快速、高分離度的特點(diǎn)。

圖2 UPC2色譜圖(248 nm)(A)補(bǔ)腎鍵腦顆粒;(B)遠(yuǎn)志;(C)肉蓯蓉;(D)石菖蒲;(E)懷牛膝Fig.2 Ultra performance convergence chromatogram(UPC2) (248 nm) of(A) Bushen Jiannao grains, (B)Polygala tenuifolia,(C)Cistanche and(D)Acorus graminus and(E)Achyranthes

3.6 樣品的測(cè)定

取3批補(bǔ)腎健腦顆粒中試樣品和各藥材提取物適量,分別按2.4節(jié)制備供試品溶液,按2.2節(jié)方法檢測(cè),得到UPC2指紋圖譜(圖3)。計(jì)算補(bǔ)腎健腦顆粒中β-蛻皮甾酮和松果菊苷的含量,并通過保留時(shí)間和紫外光譜圖歸屬其UPC2指紋圖譜中主峰來源。結(jié)果表明,β-蛻皮甾酮(12號(hào)峰)平均含量為380 μg/g,松果菊苷(15號(hào)峰)平均含量為9.562 mg/g。各主峰來源明確,結(jié)果見表4。

圖3 色譜圖(248 nm)A補(bǔ)腎健腦顆粒HPLC圖(1,松果菊苷;2,β-蛻皮甾酮);B UPLC圖(1,松果菊苷; 2,β-蛻皮甾酮);C UPC2圖(12,β-蛻皮甾酮;15,松果菊苷)Fig.3 Chromatogram(248 nm).(A)HPLC chromatogram of bushen jiannao grains(1,echinacoside;2,β-ecdyserone);(B)UPLC chromatogram(1,echinacoside;2,β-ecdyserone);(C)UPC2chromatogram(12,β-ecdyserone; 15,echinacoside)

肉蓯蓉的主要有效成分為苯乙醇苷類,其中松果菊苷含量較高[4～7],常以松果菊苷含量作為肉蓯蓉質(zhì)量控制指標(biāo)。懷牛膝的主要活性成分為蛻皮甾酮等[8],常以β-蛻皮甾酮作為懷牛膝質(zhì)量控制指標(biāo)。石菖蒲的主要有效成分是α-細(xì)心醚和β-細(xì)辛醚[9],該制劑為水煎煮,無法檢測(cè)到α-細(xì)心醚和β-細(xì)辛醚。遠(yuǎn)志的主要有效成分為皂苷類[9～11],文獻(xiàn)[12～14]報(bào)道,遠(yuǎn)志和石菖蒲配伍時(shí),遠(yuǎn)志中皂苷元含量大幅度降低,本實(shí)驗(yàn)嘗試檢測(cè)了遠(yuǎn)志皂苷,但在該制劑中未檢測(cè)到。因此,本研究最終選擇了以松果菊苷和β-蛻皮甾酮作為補(bǔ)腎健腦顆粒定量分析指標(biāo),指紋圖譜中其他主要色譜峰作為定性分析指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)建立的UPC2方法,簡(jiǎn)便、快速,與HPLC和UPLC相比,既節(jié)省時(shí)間、溶劑,又能使補(bǔ)腎健腦顆粒樣品峰完全分離,體現(xiàn)了其環(huán)保,高靈敏度,高分離度的優(yōu)勢(shì)?？捎糜趶?fù)雜中藥制劑質(zhì)量的監(jiān)測(cè)。

表4 各峰歸屬分析結(jié)果Table 4 Identification of each peak

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藥典委搭建開放、公益、合作實(shí)驗(yàn)平臺(tái)新版藥典亟需高精尖技術(shù)支持

近日,中國(guó)藥典委員會(huì)在北京為其“ChP-Waters聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室”舉行建設(shè)座談會(huì)暨揭牌儀式。中國(guó)藥典委員會(huì)秘書長(zhǎng)張偉表示:“聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室的舉辦是中國(guó)藥典委員會(huì)自身發(fā)展的需求,也是更好地開展藥典標(biāo)準(zhǔn)制定、滿足公眾用藥安全的需求,是中國(guó)藥典委員會(huì)不斷深化藥品標(biāo)準(zhǔn)形成機(jī)制改革的新探索和新嘗試?！?/p>

記者了解到,聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室作為一個(gè)公益項(xiàng)目,自宣布開建以來就獲得行業(yè)的廣泛關(guān)注。

張偉介紹,實(shí)驗(yàn)室聚集社會(huì)各種資源打造而成,旨在充分履行其開放、公益、創(chuàng)新和互利的使命,更好地服務(wù)和貢獻(xiàn)于中國(guó)藥典研究?！霸趯?shí)驗(yàn)室今后的發(fā)展運(yùn)營(yíng)中,仍然要堅(jiān)持公益性,堅(jiān)持為社會(huì)服務(wù)的宗旨,更希望有更多的企業(yè)和社會(huì)力量能加入到這一公益事業(yè)中來。”張偉強(qiáng)調(diào)。

“ChP-Waters聯(lián)合開放實(shí)驗(yàn)室”設(shè)立于北京振東光明藥物研究院實(shí)驗(yàn)大樓內(nèi),面積約400多平米。一方面將深入開展藥典標(biāo)準(zhǔn)研究,檢測(cè)方法和開發(fā)與驗(yàn)證工作;同時(shí)開展國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)的分析方法,及各論的數(shù)據(jù)比對(duì)工作。實(shí)驗(yàn)室還將為藥品監(jiān)管及藥品生產(chǎn)科研人員提供培訓(xùn),并就藥物開發(fā)研究開展廣泛的國(guó)際間技術(shù)交流。

鑒于實(shí)驗(yàn)室的開放性,各承擔(dān)藥典科研任務(wù)單位可根據(jù)需要,申請(qǐng)來人或帶課題到實(shí)驗(yàn)室利用先進(jìn)、新型的儀器設(shè)備進(jìn)行試驗(yàn)研究。雙方希望實(shí)驗(yàn)室最終成為中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域的一個(gè)國(guó)家級(jí)技術(shù)支持中心。

沃特世(Waters?)公司和世界各地的藥典委員會(huì)都有著非常廣泛、深入的合作,各個(gè)國(guó)家的制藥行業(yè)面臨著不同的挑戰(zhàn)。中國(guó)藥典包括很多傳統(tǒng)藥物、中藥,這些化合物的組成復(fù)雜得多,相應(yīng)的分析和理解也就更困難。沃特世可以幫助中國(guó)藥典針對(duì)這方面的內(nèi)容,比如中藥的分析、理解、驗(yàn)證、鑒別等,提供更高效的咨詢服務(wù)、進(jìn)行深度合作?！?/p>

Qualitative and Quantitative Analysis of Bushen Jiannao Grains by Ultra Performance Convergence Chromatography

ZHU Rui-Juan1,WANG Bo2,HU Fang1,LI Can1,LIU Xiao-Ya1,FENG Shi-Lan*1,ZHOU Wei*2
1(Department of Pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)
2(Central Laboratory of Technical Gansu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureall,Lanzhou 730000,China)

An ultra performance convergence chromatographic(UPC2)method was established for the attribution analysis of the main peaks as well as the quantitative determination of echinacoside and β-ecdyserone in Bushen Jiannao Grains.The samples were extracted with ethanol and separated on Waters ACQUITY UPC2TMBEH column(100 mm×3.00 mm,1.7 μm),with a gradient supercritical CO2-0.05% phosphoric acid-methanol solvent system at 40℃.The flow rate was 0.8 mL/min,the detection wavelength was set at 248 nm and the injection volume was 1 μL.Results showed that all the main peaks in the fingerprint were clearly attributed.The peak named 12 was β-ecdyserone with the content of 380 μg/g and the peak named 15 was echinacoside with the content of 9.562 mg/g.The method was simple,eco-friendly, accurate and reliable compared with HPLC and UPLC.

Ultra performance convergence chromatography;Bushen Jiannao Grains; Echinacoside; β-Ecdyserone

31 July 2014;accepted 18 September 2014)

2014-07-31收稿;2014-09-18接受

本文系蘭州市科技三項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(No.2012-2-70)資助

*E-mail:fengshl@lzu.edu.cn;zhouwei845@163.com

10.11895/j.issn.0253-3820.140655