基于介電電泳的微流控細(xì)胞分離芯片的研究進(jìn)展

陳 禮 鄭小林 胡 寧 楊 軍 羅洪艷 姜 帆 廖彥劍

(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，視覺(jué)損傷與再生修復(fù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400030)

1 引言

細(xì)胞分離作為一個(gè)重要的純化過(guò)程［1］，在生物研究和分析診斷中有著極其重要的應(yīng)用。許多基于細(xì)胞的研究領(lǐng)域，如臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品加工以及制藥工業(yè)等都需要進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的高靈敏度檢測(cè)和高純度加工，上述基礎(chǔ)及應(yīng)用研究工作的開(kāi)展都依賴于細(xì)胞分離技術(shù)［2～5］。針對(duì)懸浮液中生物微粒的電磁操作是目前生物分析領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，細(xì)胞分離也是其中一個(gè)重要內(nèi)容。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法主要分為兩類［6］:第一類是依靠細(xì)胞本身的尺寸、重力特性進(jìn)行分離，如離心法、重力沉積法等，這類方法分離精度較低，分離時(shí)間較長(zhǎng)且操作復(fù)雜，對(duì)細(xì)胞活性有較大影響;第二類則需要細(xì)胞間接帶電或者外加磁性物質(zhì)，最后在電場(chǎng)或者磁場(chǎng)作用下進(jìn)行細(xì)胞分離，如電泳法、磁性分離法等，這類方法通常需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，在細(xì)胞表面附著其它物質(zhì)，且在分離之后難以去除附著物，對(duì)于細(xì)胞存活率影響較大，操作流程繁瑣，價(jià)格不菲。同時(shí)，上述細(xì)胞分離方法通常需要旋流器、流式細(xì)胞儀等專業(yè)設(shè)備，存在體積大、操作人員需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)、成本昂貴等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。

由電泳技術(shù)發(fā)展而來(lái)的介電電泳(Dielectrophoresis，DEP)［7］打破了前者要求微粒帶電的限制，能讓電中性微粒在空間非均勻直流或者交流電場(chǎng)的作用下，發(fā)生極化而沿場(chǎng)強(qiáng)變化方向受到介電電泳力(凈力)，并在介電電泳力作用下發(fā)生移動(dòng)。自1978年P(guān)ohl［8］將介電電泳引入生物和化學(xué)領(lǐng)域，特別是將該技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)電泳無(wú)法高效解決的細(xì)胞分離和操縱難題以來(lái)，該技術(shù)就一直受到各國(guó)研究者的重視并不斷發(fā)展完善［9］。較傳統(tǒng)電泳方法而言，該技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)［10～12］，如不需要標(biāo)記抗體，從而可避免細(xì)胞在分離過(guò)程中因抗體反應(yīng)而發(fā)生生物性質(zhì)改變;所用低強(qiáng)度的交變電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的作用是“非破壞性”的，大量研究結(jié)果已經(jīng)證明其不會(huì)改變細(xì)胞的生長(zhǎng)及分裂性質(zhì);使用靈活，電場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、相位都容易調(diào)控，便于自動(dòng)化操作;同時(shí)，介電電泳分離方法還可與其它方法結(jié)合使用，以達(dá)到最佳的細(xì)胞分離檢測(cè)效果。

近年來(lái)，隨著介電電泳技術(shù)的理論成熟和微流控芯片加工技術(shù)的飛速發(fā)展，利用微流控芯片體積小、造價(jià)低廉、液體流動(dòng)可控、消耗試樣和試劑極少、通量高、檢測(cè)分析精度好等優(yōu)點(diǎn)，在芯片上開(kāi)展基于介電電泳的細(xì)胞分離成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)［13～16］?；诮殡婋娪镜奈⒘骺丶?xì)胞分離芯片結(jié)合了介電電泳和微流控芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，分離目標(biāo)不僅局限于細(xì)胞，也可以進(jìn)行微米尺度的礦物顆粒［17］、聚苯乙烯微球［18］、液滴［19］、細(xì)菌［20～21］和酵母菌［22］等目標(biāo)物的分離純化，甚至還可以分離納米尺度的病毒［23］、納米粒子、DNA［24］、碳納米管［25～26］等。

本文介紹基于介電電泳的微流控細(xì)胞分離芯片的研究現(xiàn)狀，總結(jié)了影響介電電泳分離的關(guān)鍵因素，對(duì)不同類型的微流控細(xì)胞分離芯片進(jìn)行了介紹，并對(duì)該技術(shù)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

2 介電電泳細(xì)胞分離的基本理論

帶電粒子在直流電場(chǎng)作用下于一定介質(zhì)中所發(fā)生的定向運(yùn)動(dòng)，稱為電泳;非帶電顆粒(電介質(zhì))在電場(chǎng)作用下的定向運(yùn)動(dòng)叫電介質(zhì)電泳(Dielectrophoresis，DEP)，簡(jiǎn)稱“介電電泳”［27］。電泳和介電電泳有著本質(zhì)的區(qū)別。電泳的粒子帶電，而介電電泳的顆粒為電中性。懸浮于鹽溶液中的細(xì)胞可以在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，這是因?yàn)榧?xì)胞表面具有一定的電荷(通常為負(fù)電荷)，可以吸附被極化的水分子層，它與介質(zhì)之間存在著電位差，此電位差產(chǎn)生了細(xì)胞電泳運(yùn)動(dòng)的驅(qū)動(dòng)力。電中性顆粒(例如細(xì)胞)處于非均勻電場(chǎng)時(shí)，電介質(zhì)顆粒中的電荷在電場(chǎng)極化作用下發(fā)生移動(dòng)從而構(gòu)成一個(gè)電偶極子，該細(xì)胞電偶極子在電場(chǎng)中受到電場(chǎng)力的作用。該電場(chǎng)力即為介電電泳力，簡(jiǎn)稱DEP力［28，29］。

當(dāng)微粒和溶液處于交流電場(chǎng)中時(shí)，微粒和溶液都會(huì)受到極化作用，當(dāng)微粒比溶液受到的極化作用強(qiáng)時(shí)，微粒受到的沿場(chǎng)強(qiáng)增大方向的力大于溶液，從而使中性微粒聚集在電場(chǎng)的極大值處，這一現(xiàn)象稱為正介電電泳，所受的力為正介電電泳力，簡(jiǎn)稱pDEP力;反之則為負(fù)介電電泳，所受的力為負(fù)介電電泳力，簡(jiǎn)稱 nDEP 力［30］。

對(duì)球形顆粒或者球形細(xì)胞(半徑為r，相對(duì)介電常數(shù)為εP，電導(dǎo)率為σp)懸浮于流體介質(zhì)(相對(duì)介電常數(shù)為εf，電導(dǎo)率為σf)的情形，處于外加非均勻交變電場(chǎng)中且電場(chǎng)的相位不發(fā)生變化時(shí)，根據(jù)偶極子模型可以得到作用在其上的DEP力(FDEP)，其簡(jiǎn)化計(jì)算公式［31，32］為:

式中:ε0為真空介電常數(shù);ω為外加電場(chǎng)信號(hào)的角頻率;Erms為外加電場(chǎng)的均方根。DEP力的方向取決于K*(ω)實(shí)部部分(Clausius-Mossotti因子，簡(jiǎn)稱CM因子，用fCM(ω)表示)的符號(hào)。當(dāng)Re［K*(ω)］＞0時(shí)，顆粒在非均勻外加電場(chǎng)的作用下從低電場(chǎng)區(qū)域被吸引至高電場(chǎng)區(qū)域，為正介電電泳(pDEP);反之，當(dāng)Re［K*(ω)］＜0時(shí)，將從高電場(chǎng)區(qū)域被排斥至低電場(chǎng)區(qū)域，則為負(fù)介電電泳(nDEP)。式(1)所示DEP力(FDEP)的計(jì)算有一個(gè)前提，那就是施加的非均勻交變電場(chǎng)的相位不發(fā)生變化。當(dāng)相位發(fā)生變化的時(shí)候，式(1)就不再適用了，此時(shí)的介電電泳力與K*(ω)的虛部部分有關(guān)，計(jì)算較為復(fù)雜，稱為行波DEP［33，34］。

細(xì)胞在介電電泳力作用下可改變其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)或趨勢(shì)，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞操作。根據(jù)細(xì)胞在緩沖液中所受介電電泳力的差異，可以進(jìn)行細(xì)胞的分離。通常情況下，在分離樣本和緩沖液環(huán)境固定后，CM因子只與電場(chǎng)信號(hào)頻率有關(guān)，因此在實(shí)驗(yàn)中CM因子-頻率圖譜是選定合適的介電電泳分離頻段的重要依據(jù)［35］。要分離兩種不同細(xì)胞的混合樣品，可以借助介電電泳力的差異設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案。目前經(jīng)典的方案有兩種:(1)使一種細(xì)胞的CM因子為正值，受到正介電電泳作用，運(yùn)動(dòng)方向?yàn)榭拷姌O方向(高電場(chǎng)區(qū)域)，另一種細(xì)胞的CM因子為負(fù)值，受到負(fù)介電電泳作用，運(yùn)動(dòng)方向?yàn)檫h(yuǎn)離電極方向(低電場(chǎng)區(qū)域);(2)兩種細(xì)胞受到同一類型介電電泳力時(shí)(pDEP或nDEP)，借助介電電泳力大小的差異實(shí)現(xiàn)樣本在芯片內(nèi)部運(yùn)動(dòng)軌跡差異達(dá)到分離的目的。

3 不同類型的微流控細(xì)胞/微粒分離芯片

由公式(1)可知，影響細(xì)胞DEP作用的因素有細(xì)胞尺寸、細(xì)胞和懸浮液的相對(duì)介電常數(shù)和電導(dǎo)率、電場(chǎng)梯度的大小、電信號(hào)頻率等。其中，電場(chǎng)梯度的產(chǎn)生主要取決于電極形狀，因而電極形狀的選擇對(duì)介電電泳細(xì)胞分離芯片的設(shè)計(jì)非常重要［36，37］;而外加信號(hào)的類型將直接影響分離操作，因此激勵(lì)信號(hào)的優(yōu)化配置顯得尤為關(guān)鍵。此外，選擇合適的懸浮液也是必須考慮的因素。

3.1 基于細(xì)胞尺度效應(yīng)的介電電泳分離芯片

細(xì)胞的尺寸從幾微米到幾十乃至上百微米，對(duì)于不同尺寸的細(xì)胞，在非均勻電場(chǎng)中，所受到的介電電泳力FDEP與細(xì)胞半徑r的三次方成正比，因此可以利用此原理進(jìn)行細(xì)胞分離。下面介紹幾種利用此類方法進(jìn)行分離的微流控芯片。

3.1.1 DEP與Field-Flow-Fractionation(FFF)聯(lián)用法分離芯片 根據(jù)層流理論，在微管道中流動(dòng)的液體流層與管壁、流層與流層之間的粘性力導(dǎo)致管壁處流層流速最低，管軸處速度最大，且越靠近管軸處速度越大，速度與管軸處的距離成拋物線分布。Wang等［38，39］發(fā)展了基于DEP力場(chǎng)的流動(dòng)分離方法(圖1)，當(dāng)流場(chǎng)以圖示方向流動(dòng)時(shí)，電極陣列置于流道的底部，形成非均勻電場(chǎng)，通過(guò)選擇合適的頻率使細(xì)胞受nDEP力作用，而nDEP力將把顆粒推離流道底部;顆粒最終的位置取決于DEP力在垂直方向上的分量FDEPz與顆粒重力及浮力合力Fsed的平衡關(guān)系。由于DEP力與顆粒半徑成正比，不同尺度的顆粒將承受不同的DEP力，它們?cè)诖怪狈较虻钠胶馕恢?h1和h2)也會(huì)同。不同的顆粒將分別處于拋物線速度剖面的不同層，由此具有不同的移動(dòng)速度(v1與v2)。當(dāng)在管內(nèi)流動(dòng)一段時(shí)間和距離之后，各尺寸不同的粒子就會(huì)在距離上產(chǎn)生差異，此時(shí)在管口分時(shí)收集就可達(dá)到分離不同種細(xì)胞或者微粒的目的。

圖 1 DEP-FFF 細(xì)胞分離微流控芯片［38，39］Fig.1 Dielectrophoresis-field-flow-fractionation(DEP-FFF)cell separation microfluidic chip

3.1.2 DEP與曲率誘導(dǎo)聯(lián)用法分離芯片 Zhu等［40］在2011年提出了一種介電電泳細(xì)胞分離芯片。該芯片在蛇形通道內(nèi)使用曲率誘導(dǎo)介電電泳，成功地用于分離酵母菌和3 μm尺寸的聚苯乙烯顆粒(圖2)，分離效率高達(dá)95%。該芯片由4個(gè)流通池和連接流通池的蛇形分離通道構(gòu)成(圖2a)。其工作原理如圖2b所示:混合樣品(顆粒)從A口流入，B口流入緩沖液。當(dāng)混合微粒運(yùn)動(dòng)到轉(zhuǎn)彎位置的時(shí)候，選擇合適的頻率使白色顆粒CM因子為負(fù)，藍(lán)色顆粒CM因子為正，這樣在轉(zhuǎn)彎時(shí)藍(lán)色顆粒由pDEP產(chǎn)生的向心力繼續(xù)留在內(nèi)側(cè)流層中，而白色顆粒受到nDEP作用向外側(cè)流層偏移，這樣經(jīng)過(guò)數(shù)十個(gè)蛇形轉(zhuǎn)彎通道的曲率誘導(dǎo)介電電泳作用積累，使白色顆粒在外側(cè)流層中，藍(lán)色顆粒留在內(nèi)側(cè)流層。在出口處，在外側(cè)流層中的白色顆粒從C口流出，在內(nèi)側(cè)流層中的藍(lán)色顆粒從D口流出，達(dá)到分離的目的。研究人員借助Comsol模擬(圖2c和2d)其分離過(guò)程，結(jié)果顯示，借助曲率誘導(dǎo)介電電泳效應(yīng)，能夠?qū)?xì)胞尺寸不一和CM因子不同的兩種細(xì)胞進(jìn)行分離。

該類分離芯片可用于對(duì)介電電泳極性相反(一種為pDEP，另一種為nDEP)的細(xì)胞進(jìn)行分離，分離精度較高，操作簡(jiǎn)便，但缺點(diǎn)是只能分離兩種細(xì)胞或者微粒，且需實(shí)驗(yàn)前需測(cè)得兩種細(xì)胞或者微粒的正-負(fù)介電電泳臨界頻率。

細(xì)胞半徑是標(biāo)志細(xì)胞大小的參數(shù)，常用作細(xì)胞分選的特征參數(shù)。介電電泳力FDEP與細(xì)胞半徑r的三次方成正比，使得基于介電電泳和細(xì)胞尺寸差異的分離方法更容易得以實(shí)現(xiàn)。與尺寸相關(guān)的DEP分離方法也常與其它方法聯(lián)合使用，如DEP與超聲聯(lián)用、DEP與磁場(chǎng)聯(lián)用、DEP與光鑷技術(shù)聯(lián)用等［31，32］，在此就不一闡述。此外，基于細(xì)胞尺度效應(yīng)的介電電泳分離芯片在某些方面亟需改進(jìn):(1)在理論和仿真研究中，細(xì)胞模型的建立還有待進(jìn)一步完善。由于大多數(shù)細(xì)胞是球型，因此在進(jìn)行理論仿真時(shí)候常把細(xì)胞看作是雙層球殼，但事實(shí)上很多細(xì)胞是長(zhǎng)條狀、棒狀或者其它不規(guī)則形狀。(2)在實(shí)際樣本中，細(xì)胞(粒子)間的區(qū)別低于實(shí)驗(yàn)中選取的特定樣本，也就是說(shuō)，當(dāng)兩種細(xì)胞在尺寸、形狀上具有一定的相似性時(shí)，對(duì)于這類性質(zhì)差別不大的分離對(duì)象，還需進(jìn)一步提高介電電泳的分辨率。而且，對(duì)于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞壁的存在也會(huì)使細(xì)胞理論模型和實(shí)際情況有所區(qū)別。

圖2 曲率誘導(dǎo)介電電泳細(xì)胞分離芯片［40］(a)芯片實(shí)物圖;(b)原理圖;(c)芯片入口流路分布圖;(d)芯片出口流路分布圖。Fig.2 Cell separation microfluidic chip via curvature-induced dielectrophoresis:(a)Picture of microfluidic chip;(b)Illustration of sheath-flow focusing and dielectrophoretic separation of particles;(c)and(d)Numerical prediction of the flow of inlet and outlet［40］

3.2 基于電極優(yōu)化的介電電泳分離芯片

在基于介電電泳的細(xì)胞分離研究中，電場(chǎng)梯度同樣是影響細(xì)胞DEP作用的重要因素。微流控芯片上的非均勻電場(chǎng)主要是由電極產(chǎn)生的，所以電極的形狀和分布對(duì)FDEP的分布具有決定意義［41］。芯片電極的分類方法比較多，沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如按照電極形狀可分為叉指電極、城墻狀電極、螺旋電極、對(duì)電極等;按照電極的分布可分為底部電極、側(cè)壁電極、和空間電極等，其中側(cè)壁電極還可分為單側(cè)電極、雙側(cè)電極等;按照電極的材質(zhì)和制作工藝可分為金屬電極、碳電極、復(fù)合電極等;按照電極的配置方式可分為二維平面電極、三維立體電極等。本文將按照電極的結(jié)構(gòu)將電極分為陣列式電極、環(huán)狀電極、柱狀電極和不規(guī)則電極等類型。

3.2.1 陣列式電極 陣列電極分離芯片的設(shè)計(jì)思路是通過(guò)在微流控芯片上集成陣列化微電極(不同或同種結(jié)構(gòu))，實(shí)現(xiàn)大量生化樣品的在線分離和富集。電極的形狀、大小和位置直接影響非均勻電場(chǎng)的分布，而電極的厚度則影響芯片的鍵合和系統(tǒng)的集成化。Yang等［42］對(duì)平面交錯(cuò)式陣列電極設(shè)計(jì)的DEP芯片(圖3a)采用多物理量耦合分析軟件(FEMLAB)進(jìn)行仿真，計(jì)算了圖3b中右上角所示電極結(jié)構(gòu)的電場(chǎng)分布。電極陣列中高電場(chǎng)區(qū)域始終位于電極邊緣處，該處適合做正介電電泳運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)富集。在電極的寬度和間距相等時(shí)，低電場(chǎng)區(qū)域出現(xiàn)在電極的中心位置和相鄰電極的中心線位置，且場(chǎng)強(qiáng)相等;如果電極的寬度大于電極的間距，則低電場(chǎng)區(qū)域集中于電極平面的中心線位置;如果電極的寬度小于電極的間距，則低電場(chǎng)區(qū)域集中于相鄰電極間距的中心線位置，在該處適合作負(fù)向介電電泳的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)富集。Yang等［42］設(shè)計(jì)的芯片管道高度不到100 m，在2 V和2 MHz的電信號(hào)條件下，能夠保證99%的捕獲效率，從而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的正介電電泳分離和富集。

陣列式電極以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，具有很多優(yōu)點(diǎn):可在有限的區(qū)域內(nèi)分列排布大量電極;適用于高通量的分析檢測(cè)要求，分離效率高且速度快。但陣列式電極對(duì)電極加工工藝和流程要求較高，電極間隙和相鄰電極間的距離有較為嚴(yán)格的要求，在設(shè)計(jì)芯片時(shí)，應(yīng)先根據(jù)適用對(duì)象和目標(biāo)使用數(shù)值模擬軟件得到其最佳的物理分布位置［43］。

3.2.2 環(huán)狀電極 隨著介電電泳技術(shù)的發(fā)展，單純的針狀或者對(duì)狀電極已經(jīng)不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要。而且，隨著分離的細(xì)胞種類多樣化，對(duì)電場(chǎng)梯度的要求也越來(lái)越高。因此，一些新型電極，如環(huán)狀電極被設(shè)計(jì)出來(lái)(圖4)［44，45］。環(huán)狀電極的特點(diǎn)在于其電極形狀不是傳統(tǒng)的城墻形狀或者叉指形狀，而是根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象靈活多變，大多比較復(fù)雜，電極曲線比較光滑，如常見(jiàn)的螺旋電極。

3.2.3 柱狀電極 在介電電泳分離芯片中，常用的二維電極具有許多局限性，而且加工工藝復(fù)雜。傳統(tǒng)芯片微電極是厚度為幾百納米的金屬薄膜平面電極，其加工方法是在采用電鍍或?yàn)R射的方法在基片上形成特定圖案的金屬電極，對(duì)于過(guò)量的部分利用剝離、蝕刻，結(jié)合某些特殊的光刻加工工藝去除［46］。但二維電極產(chǎn)生的電場(chǎng)隨著粒子距電極表面距離的增加而呈指數(shù)型衰減［47］，這意味著部分粒子由于距離電極較遠(yuǎn)，受到電場(chǎng)的作用微弱，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效控制。

為了解決上述問(wèn)題，近年來(lái)越來(lái)越多的芯片采用雙側(cè)平面電極或三維電極來(lái)產(chǎn)生三維電場(chǎng)。與二維電極相比，三維電極的魯棒性更好，可承受的電流密度更大，且在電流熱效應(yīng)作用下產(chǎn)生的焦耳熱較平面電極小，在平面電極發(fā)展的同時(shí)，三維電極以其空間的電場(chǎng)分布優(yōu)勢(shì)，需要電壓小且捕捉更牢靠的優(yōu)勢(shì)吸引了人們的視線［48］。三維電極中常采用柱狀電極，其使用頻率較高，加工難度較小，分離效果較好。

圖3 陣列式電極［42］Fig.3 Array of electrodes［42］a.電極結(jié)構(gòu)(Electrode structure);b.電場(chǎng)仿真(Simulation of field)。

圖 4 環(huán)狀電極［44，45］Fig.4 Ringlike electrodes［44，45］(a)螺旋電極(Picture of spiral electrodes);(b)同心環(huán)電極(Picture of concentric electrodes)。

Hunt等［49］設(shè)計(jì)并制作了圓柱狀電極微流控芯片(圖5a)，每個(gè)柱狀電極由單獨(dú)的引線供電，故可在同一芯片區(qū)域選擇不同幅值、頻率和相位的信號(hào)配合使用，使該電場(chǎng)區(qū)域適合進(jìn)行介電電泳分離活動(dòng)。

Iliescu等［50］設(shè)計(jì)并制作了三維正方體柱狀電極細(xì)胞分離微流控芯片(圖5b)，與Hunt等的圓柱形電極［49］相比，此電極截面為正方形，通過(guò)數(shù)值仿真可以看出正方形的4個(gè)頂點(diǎn)處電場(chǎng)梯度值最高，在介電電泳作用下，細(xì)胞吸附能力最強(qiáng)，較圓柱形電極的分離、富集效果更好，將其用于分離活、死酵母細(xì)胞的分離精度95%。

圖 5 三維電極［49，50］Fig.5 Three-dimensional(3D)electrodes［49，50］(a)圓柱狀電極(Picture of columnar electrodes);(b)正方體柱狀電極、電場(chǎng)仿真圖(Picture and the numerical simulation of electric field of the cubic electrode)。

當(dāng)然，柱狀電極只是三維電極的一個(gè)典型代表，三維電極作為近幾年來(lái)熱門(mén)的研究話題，其發(fā)展速度也是日新月異，各種形狀、各種材質(zhì)的三維電極已經(jīng)多次報(bào)道。

3.2.4 不規(guī)則電極 在介電電泳分離技術(shù)中，電極的設(shè)計(jì)占據(jù)了相對(duì)重要的地位。

由于分離目標(biāo)的多樣化，導(dǎo)致了電極形狀和結(jié)構(gòu)的多樣化。除了前面介紹的幾種常規(guī)電極，很多非常規(guī)的不規(guī)則電極也在使用。Hoettges等［51］發(fā)展了拉鏈狀環(huán)形電極(圖6a)，并使用其進(jìn)行了孢子的富集和分離，實(shí)驗(yàn)觀察到孢子聚集在拉練環(huán)狀的中心處，在該裝置中，孢子受到nDEP作用。Malnar等［52］設(shè)計(jì)的條狀電極尖端有三角形彎折(圖6b)，使得一種微粒被捕捉在電極處，而另一種微粒隨著流體的拖曳力流出。Gonzalez［53］設(shè)計(jì)了可分別加信號(hào)的棘齒狀電極(圖6c)，成功進(jìn)行了鐵磁礦物粒子和聚苯乙烯顆粒的捕捉和分離，分離效率高。Pethig等［54］設(shè)計(jì)了波浪形電極陣列，利用多重介電電泳和行波介電電泳的重疊，使得微粒達(dá)到分離目的(圖6d)。除了上述不同電極形狀之外，還有糖葫蘆狀、叉指電極等各式電極，其設(shè)計(jì)思路與分離對(duì)象也各不相同。

圖6 各種不規(guī)則電極Fig.6 Different kinds of irregular electrodes(a) 拉鏈環(huán)狀電極(Zipper annular electrodes)［51］;(b) 彎折三角形電極(Bending triangle electrodes)［52］;(c) 棘齒狀電極(Ratchet electrodes)［53］;(d) 波浪形電極(Undulating electrodes)［54］。

以上分類是從電極形狀上考慮的，不能包含所有報(bào)道過(guò)的微電極，這是因?yàn)殡姌O分類方法較多，分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。在考慮芯片上微電極的設(shè)計(jì)時(shí)候，應(yīng)當(dāng)從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)對(duì)象出發(fā)，綜合電極形狀、電極厚度、加工難度以及組裝集成的難度等方面來(lái)考慮。二維平面電極已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種微流控芯片中，最近幾年三維電極以其獨(dú)特的空間電場(chǎng)分布優(yōu)勢(shì)正在逐漸擴(kuò)展到微流控芯片的各個(gè)領(lǐng)域，是微電極發(fā)展的主要方向與趨勢(shì)之一。

3.3 基于激勵(lì)信號(hào)優(yōu)化的介電電泳分離芯片

根據(jù)所施加的外加電場(chǎng)的種類不同，可以將介電電泳分離芯片分為直流式介電電泳芯片(DC-DEP Chip)、交流式介電電泳芯片(AC-DEP Chip)，而交流式介電電泳芯片還可細(xì)分為常規(guī)介電電泳芯片、行波介電電泳芯片。

3.3.1 直流式－介電電泳芯片(DC-DEP Chip) 根據(jù)介電電泳的定義，當(dāng)細(xì)胞處于非均勻直流電場(chǎng)中時(shí)，也會(huì)發(fā)生極化現(xiàn)象，產(chǎn)生介電電泳力。直流式-介電電泳芯片模式中，直流信號(hào)施加在介電電泳芯片微通道兩端，利用微通道內(nèi)加工的絕緣障礙可以使電力線發(fā)生扭曲，從而產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)，進(jìn)而產(chǎn)生極化現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)樣品的介電電泳富集、分離操控。Blanca和Cummings研究小組證明了集成圓形絕緣微柱陣列的介電電泳芯片對(duì)分散性微粒和聚苯乙烯的介電電泳誘捕能力［55，56］。Ciprian等［57］采用相同的集成有圓形絕緣微柱陣列的介電電泳芯片實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞的介電電泳富集，其富集效率達(dá)到75%。魏慶華等［58］采用SU-8聚合物材料制作的絕緣微柱介電電泳芯片(圖7)，用于分離和富集直徑為16 m的乳膠粒子。受到電場(chǎng)強(qiáng)度較大區(qū)域(微圓柱周圍)吸引的粒子將在圓柱周圍產(chǎn)生集中;而沒(méi)有受到吸引的粒子會(huì)在電場(chǎng)強(qiáng)度較小的區(qū)域(微圓柱與微圓柱之間)成串流動(dòng)，從而達(dá)到微粒分離的目的。

圖7 直流式-絕緣微柱電極［58］Fig.7 Direct current-insulated micro-column electrodes.

采用絕緣微柱構(gòu)建的介電電泳芯片，由于直流電壓同時(shí)作為待分析樣品的驅(qū)動(dòng)電壓和富集分離電壓，必然導(dǎo)致樣品緩沖液中電流值的增加，從而對(duì)生物樣品的活性造成破壞，如細(xì)胞膜被擊穿等。然而，在實(shí)際的科研中，使用直流介電電泳的機(jī)會(huì)較少，使用交流信號(hào)介電電泳則比較普遍，這是因?yàn)楸M管介電電泳理論上并沒(méi)有限制直流電的使用，然而高頻交流電的使用可以更有效地消除直流電所引起的電解、電熱等問(wèn)題，因此目前絕大部分實(shí)驗(yàn)中都使用高頻交流電產(chǎn)生所需的電場(chǎng)，以避免在電極附近區(qū)域過(guò)熱或發(fā)生電解。

3.3.2 交流式-介電電泳芯片(AC-DEP Chip) 在直流介電電泳中，電場(chǎng)會(huì)以焦耳熱的形式產(chǎn)生功率損耗，相應(yīng)的溫度變化可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響。目前己知較高的溫度(高于細(xì)胞生理溫度4℃以上)將導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡。而在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞動(dòng)力學(xué)過(guò)程和溫度呈指數(shù)關(guān)系，所以很小的溫度漂移也可能對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)造成影響。目前關(guān)于誘導(dǎo)細(xì)胞響應(yīng)所需要的最小的溫度漂移還不清楚。所以實(shí)驗(yàn)中必須盡力減小化溫度漂移。通常認(rèn)為保持溫度變化＜1℃是可以接受的，這個(gè)溫度變化和體內(nèi)溫度變化相近，不會(huì)對(duì)細(xì)胞有明顯影響。而交流電在降低功率損耗方面具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)，這就使得交流式－介電電泳在分離研究中較直流式-介電電泳具有更廣闊的應(yīng)用。

(1)信號(hào)頻率恒定的介電電泳芯片 信號(hào)頻率恒定的介電電泳是最簡(jiǎn)單、最基本、最早研究的介電電泳形式。其特點(diǎn)是使用兩相相位相反的交流信號(hào)，形成非均勻電場(chǎng)，使細(xì)胞在非均勻電場(chǎng)中產(chǎn)生感應(yīng)偶極矩，從而受到介電電泳力的作用。根據(jù)細(xì)胞和懸浮液介電性質(zhì)的差異，細(xì)胞將向電場(chǎng)中電場(chǎng)最強(qiáng)(pDEP)或者最弱的地方運(yùn)動(dòng)(nDEP)。利用微加工技術(shù)，現(xiàn)已設(shè)計(jì)制作出多種具有確定電場(chǎng)分布的信號(hào)頻率恒定的介電電泳芯片，電極的形狀主要有多項(xiàng)式函數(shù)形、正弦函數(shù)形、城堡形以及可單獨(dú)尋址的圓形電極陣列等。

2005年，韓國(guó)的Doh等［59］報(bào)道了一種可連續(xù)分離細(xì)胞的微流控芯片(圖8)，在該芯片流路的底部或者通道側(cè)壁配置電極，施加恰當(dāng)?shù)慕涣餍盘?hào)，當(dāng)混合樣品流過(guò)分離通道的時(shí)候，一種細(xì)胞受正向介電電泳作用從而產(chǎn)生一個(gè)與流路垂直的遠(yuǎn)離原混合流體中心位置的橫向偏移量，隨著流動(dòng)的持續(xù)，這種橫向偏移量會(huì)越來(lái)越大，細(xì)胞將從出口1流出;而另一種細(xì)胞受負(fù)向介電電泳作用，則仍按原軌跡運(yùn)動(dòng)，從出口2流出。Doh等［59］使用該方法進(jìn)行了活、死酵母細(xì)胞的分離，由于缺乏對(duì)流體力與介電電泳力共同作用于樣品體系時(shí)受力情況的深入討論，采用該介電電泳芯片在出口處收集的酵母菌純度低于80%。

圖8 信號(hào)頻率恒定的介電電泳芯片［59］Fig.8 Dielectrophoretic chip with constant frequency signal［59］

信號(hào)頻率恒定的介電電泳芯片是使用非常廣泛的一種微流控芯片，該芯片對(duì)信號(hào)要求較低，只需選擇使兩種細(xì)胞分別處于正、負(fù)介電電泳的頻率即可完成分離，如果需要高精度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需考慮流場(chǎng)的影響。在條件不足的情況下，使用尋常的信號(hào)發(fā)生器也可以勉強(qiáng)用于實(shí)驗(yàn)，對(duì)信號(hào)源的依賴性較小，但是為了獲得更好的分離效果，信號(hào)源的帶負(fù)載能力是不能忽視的指標(biāo)。

(2)行波介電電泳芯片(Traveling wave dielectrophoresis，twDEP) 與信號(hào)頻率恒定的介電電泳不同，行波介電電泳一般采用四相交流信號(hào)，相鄰電極之間施加的信號(hào)相位差為90°。該方法一般通過(guò)在一系列線性排列的電極上施加上述交流信號(hào)，構(gòu)建一個(gè)空間行波電場(chǎng)，其相位沿著電極排列的方向變化。當(dāng)細(xì)胞處于這樣的電場(chǎng)中時(shí)不僅會(huì)受到由于電場(chǎng)強(qiáng)度分布不均勻產(chǎn)生的介電電泳力，即常規(guī)介電電泳力;同時(shí)也會(huì)受到由于電場(chǎng)相位分布不均勻而產(chǎn)生的介電電泳力，稱為行波介電電泳力［60］。細(xì)胞在行波介電電泳力作用下的運(yùn)動(dòng)稱為行波介電電泳。此處需注意的是，使用公式(1)計(jì)算行波介電電泳力并不合適，因?yàn)槌Ｒ?guī)的介電電泳所用交變電場(chǎng)的頻率和相位是固定值，然而行波介電電泳的相位不固定，需使用更為復(fù)雜的計(jì)算方法。

最早開(kāi)展這方面研究的是Masuda研究小組，他們于1980年代后期報(bào)道了在同步移動(dòng)電場(chǎng)的作用下可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與電場(chǎng)一起運(yùn)動(dòng)［61］。Fuhr及其合作者發(fā)展了他們的工作，研究了twDEP與電旋轉(zhuǎn)原理上的相似性，并提出了“異步”行波介電電泳的概念和具體實(shí)施方案［62］。目前，已有多種電極形狀和尺寸不同的行波介電電泳芯片被設(shè)計(jì)出來(lái)［63，64］。如圖9所示，圖中電極寬度與間距均為20 μm，電極與流動(dòng)方向平行，在不同電極上施加不同相位(相位相差90°)的信號(hào)產(chǎn)生twDEP力，不同細(xì)胞或顆粒在twDEP作用下的側(cè)向運(yùn)動(dòng)速度存在差別，最終，在twDEP作用下使顆粒產(chǎn)生垂直于流動(dòng)方向的運(yùn)動(dòng)，達(dá)到很好的空間效果［33］。行波介電電泳芯片對(duì)于信號(hào)要求較高，且電極分布需合理，理論較常規(guī)介電電泳較為復(fù)雜，但對(duì)于多種(大于兩種)細(xì)胞或者微粒的具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)，分離精度較高。

在分離操作中，外加電場(chǎng)信號(hào)是介電電泳分離活動(dòng)的核心因素，是分離活動(dòng)成功與否的關(guān)鍵，因此，針對(duì)不同的芯片結(jié)構(gòu)，不同的分離目標(biāo)以及對(duì)分離速度要求等因素的考慮，選擇合適的電場(chǎng)信號(hào)，能夠有效地提高分離效率。此外，除了外加信號(hào)的不同以外，流體的流動(dòng)作用不可忽視，流體流動(dòng)除了能推動(dòng)細(xì)胞向分離區(qū)域流動(dòng)外，還可改變細(xì)胞與電極之間的相對(duì)位置，對(duì)分離過(guò)程影響很大。單純依靠電場(chǎng)DEP作用只能在小范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操縱，想要分離過(guò)程滿足高通量和高效率，引入其它物理場(chǎng)是常采用的技術(shù)手段?，F(xiàn)階段大多數(shù)研究人員認(rèn)為多物理場(chǎng)之間是互不影響的，但事實(shí)卻并非如此。

圖9 行波介電電泳分離細(xì)胞微流控芯片［33］Fig.9 Traveling wave dielectrophoresis(TWDEP)microfluidic chip［33］

4 結(jié)論和展望

自從1991年英國(guó)學(xué)者Pethig利用交流電場(chǎng)將細(xì)胞從液體中成功分離以來(lái)，使用介電電泳分離細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)展了20余年的研究［8］。隨著微加工技術(shù)的發(fā)展，介電電泳和微流控芯片攜手，使細(xì)胞分離進(jìn)入了微觀時(shí)代。在這期間，介電電泳理論得到長(zhǎng)足的發(fā)展，新的細(xì)胞分離模型不斷出現(xiàn)，各種結(jié)構(gòu)的微流控細(xì)胞分離芯片被報(bào)道出來(lái)，從最開(kāi)始的單一非均勻電場(chǎng)到后來(lái)的多物理場(chǎng)相結(jié)合，每一次創(chuàng)新都是對(duì)該領(lǐng)域的重大貢獻(xiàn)。

基于介電電泳的細(xì)胞分離微流控芯片在未來(lái)的發(fā)展將著重于以下五方面:(1)在理論和仿真研究中，各種模型的建立還有待進(jìn)一步完善。此處的模型不僅是指細(xì)胞模型，而且還有多物理場(chǎng)耦合時(shí)互相影響的模型。(2)分離過(guò)程的高精度和高效率。更多不同結(jié)構(gòu)和不同分離方法的微流控芯片是有效的手段。(3)拓展介電電泳分離的應(yīng)用范圍?？梢詫?duì)其它的些粒子進(jìn)行分離，如礦物質(zhì)粒子、膠體粒子等，而且對(duì)于粒子的形態(tài)也可以廣泛化，除了固態(tài)粒子，液態(tài)粒子也可以考慮作為分離對(duì)象之一;此外，分離尺寸從微米粒子到納米粒子都可以作為適用范圍。(4)芯片上多功能集成。實(shí)驗(yàn)時(shí)需要在芯片上集成多種檢測(cè)分析方法，實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地觀察和分析細(xì)胞分離的進(jìn)程;為了排除細(xì)胞懸液中其它物質(zhì)的影響或者實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的富集，需要集成樣品前處理模塊;為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分析和再利用，需要集成細(xì)胞分離后的培養(yǎng)等模塊。(5)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的小型化、自動(dòng)化?，F(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)經(jīng)常使用高倍數(shù)顯微鏡配置成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，新的顯微成像方法如無(wú)鏡頭陰影成像技術(shù)［65］等可以用于實(shí)驗(yàn)，體積和造價(jià)均遠(yuǎn)低于前者;分離之后統(tǒng)計(jì)的方法也有待進(jìn)一步完善，現(xiàn)在的方法比較原始，采取顯微鏡視野下的人工計(jì)數(shù)得到結(jié)果，在今后的實(shí)驗(yàn)中可以考慮引入圖像處理的方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，效率更高，自動(dòng)化程度更高。此外，在有些方面還需要進(jìn)行改進(jìn)，如分離后細(xì)胞的存活率分析［66］等。

基于介電電泳的細(xì)胞分離微流控芯片的發(fā)展與數(shù)學(xué)、物理、生物、分析化學(xué)、微加工技術(shù)的研究緊密相關(guān)。一方面，細(xì)胞分離微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作，以微加工技術(shù)，數(shù)值模擬技術(shù)，生物標(biāo)志和化學(xué)分析為基礎(chǔ);另一方面，對(duì)基于介電電泳的細(xì)胞分離微流控芯片的研究，進(jìn)一步推動(dòng)微加工技術(shù)的發(fā)展，特別是芯片上細(xì)胞的操縱技術(shù)的發(fā)展，將對(duì)生物、分析化學(xué)技術(shù)的長(zhǎng)足發(fā)展貢獻(xiàn)一份力量。隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展，相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，高精度、高通量、高效率、多功能、便攜式、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的細(xì)胞分離微流控芯片將在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

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