N-乙酰半胱氨酸對重癥急性胰腺炎腸屏障作用的實(shí)驗(yàn)研究

汪潤芝，韓 真，何池義，劉銀華，汪佑霞，劉少鋒

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化系疾病的危重癥，臨床病死率常高達(dá)10% ～20%，甚至超過30%［1］。其病情演變過程十分復(fù)雜，隨著近年來深入的研究，腸屏障功能 (intestinal barrier function，IBF)損傷在SAP中的作用逐漸被認(rèn)識，目前認(rèn)為IBF破壞誘發(fā)和加重了SAP時全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)并引起多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是導(dǎo)致 死 亡 的 主 要 原 因［1－3］。N-乙 酰 半 胱 氨 酸(NAC)是一種抗氧化劑和體內(nèi)活性氧自由基清除劑，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其可對腸缺血再灌注、炎癥性腸病、創(chuàng)傷、感染等多種疾病相關(guān)的腸屏障功能障礙起到有效的防治作用［4－5］。本研究通過NAC干預(yù)探討其對SAP大鼠腸屏障損害時的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 54只健康清潔級SD雄性大鼠，體重(240±20)g，浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號［scxk(浙)20080033］。97%牛磺膽酸鈉購于上海晶純試劑有限公司。NAC購于杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司。DAO、SOD、MDA及GSH試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 分組與模型制備 54只SD雄性大鼠正常適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，假手術(shù)(Sham)組、NAC+SAP組和SAP組，每組18只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水。采用3%戊巴比妥鈉溶液 (40 mg/kg)腹腔麻醉，嚴(yán)格無菌條件下，上腹正中切口進(jìn)腹。SAP組，找到膽胰管，在肝門端以動脈夾暫時阻閉膽管，找到膽胰管匯入十二指腸乳頭處，4號頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近穿刺十二指腸壁，逆行刺入膽胰管內(nèi)并固定，于膽胰管入十二指腸端用小動脈夾暫時阻閉膽胰管，以0.2 ml/min的速度向膽胰管內(nèi)逆行推注50 g/L?；悄懰徕c溶液(1 ml/kg)，注射完畢后10 min去除動脈夾，逐層關(guān)腹，建立SAP模型。NAC+SAP組，建模前2 h先給予腹腔注射NAC 300 mg/kg。Sham組，開腹后僅翻動十二指腸和胰腺。3組大鼠術(shù)后10 min均尾靜脈注射5 ml/kg體質(zhì)量的生理鹽水，以補(bǔ)充術(shù)中丟失的液體，術(shù)后禁食，自由飲水。各組大鼠于術(shù)后6、12、24 h注射致死劑量的戊巴比妥鈉(200 mg/kg)分批處死，每批6只。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 嚴(yán)格無菌條件下迅速打開腹腔，取胰相同部位標(biāo)本2 cm左右，40 g/L甲醛溶液固定，修剪、脫脂、石蠟包埋和切片，HE染色，光鏡下觀察胰腺組織病理改變。取出小腸并用預(yù)冷的0.9%NaCl溶液沖洗。取末端回腸標(biāo)本2 cm，40 g/L甲醛溶液固定，修剪、脫脂、石蠟包埋和切片，HE染色，光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.2 血液檢測指標(biāo) 取腹主動脈血5 ml，4℃2 500 r/min離心10 min分離血漿，收集血漿置－70℃冰箱保存，活性比色法定量檢測血清二胺氧化酶(DAO)，全自動生化儀測定血淀粉酶(AMY)，均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 小腸組織氧化還原酶活性測定 取末端回腸組織4 cm，用預(yù)冷的0.9%NaCl溶液再次沖洗，濾紙吸干稱量，加入9倍體積的0.9%NaCl溶液，冷水浴中用眼科剪盡快剪碎，并在玻璃勻漿管中手工勻漿，制成小腸勻漿，高速冷凍離心機(jī)4℃ 先用600 r/min離心10 min后，取上清液于10 000 r/min離心20 min，最后再取上清液－70℃低溫保存，測SOD、MDA、GSH的活性，按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計分析方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，多組間計量資料比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)變化 光鏡下，Sham組大鼠胰腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，無異常改變，回腸絨毛結(jié)構(gòu)完整。而SAP組大鼠各時間點(diǎn)胰腺有不同程度的水腫、片狀出血，并見胰腺實(shí)質(zhì)和脂肪壞死及炎癥細(xì)胞浸潤;末端回腸黏膜均有不同程度水腫，絨毛稀疏、炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞脫落，上皮結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，黏膜下層血管擴(kuò)張，隨著建模時間的延長，改變更加明顯。NAC+SAP組可見胰腺滲出、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤較SAP組減輕;末端回腸黏膜絨毛略有減少、少量炎性細(xì)胞浸潤和上皮細(xì)胞脫落，小腸結(jié)構(gòu)的完整性較SAP組有改善。

2.2 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清AMY和DAO的水平 SAP組、NAC+SAP組的血清AMY水平各時點(diǎn)與Sham組比較均明顯增高(P＜0.01);SAP組12、24 h的AMY水平較6 h時增高明顯(P＜0.05);NAC+SAP組各時間點(diǎn)間血清AMY水平無明顯變化(P＞0.05)，見表1。SAP組各時間點(diǎn)血清DAO均高于 Sham組，以12 h和24 h增高明顯(P＜0.05)。NAC+SAP組各時間點(diǎn)血清DAO水平與Sham組比較，有明顯增高(P＜0.05);其6 h時間點(diǎn)血清DAO水平與SAP組同時間點(diǎn)無明顯變化(P＞0.05)，而12、24 h時間點(diǎn)較SAP組同時間點(diǎn)顯著降低(P＜0.05)，尤其是24 h時間點(diǎn)較同組6、12 h時間點(diǎn)有顯著降低(P＜0.05，見表2)。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清淀粉酶水平比較(U/L，±s)Tab 1Comparison of the blood levels of AMY at distinct time points in different groups of rats(U/L，±s)

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清淀粉酶水平比較(U/L，±s)Tab 1Comparison of the blood levels of AMY at distinct time points in different groups of rats(U/L，±s)

a與Sham組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;b與SAP組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;c與組內(nèi)6 h時間點(diǎn)比較P＜0.05

組別 6 h(n=6)12 h(n=6)24 h(n=6)F P Sham 組 1 200.83 ±240.29 1 552.00 ±434.66 1 124.67 ±153 0.000 0.000 0.000.87 3.459 0.058 SAP 組 6 065.17 ±1 215.37a 8 155.50 ±832.26ac 9 243.67 ±1 921.42ac 5.509 0.016 NAC+SAP 組 5 554.67 ±856.61a 5 192.50 ±699.87ab 4 743.00 ±1 150.89ab 1.168 0.338 F 56.701 48.791 59.086 P

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清二胺氧化酶水平比較(U/ml，±s)Tab 2Comparison of the blood levels of DAO at distinct time points in different groups of rats(U/ml，±s)

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)血清二胺氧化酶水平比較(U/ml，±s)Tab 2Comparison of the blood levels of DAO at distinct time points in different groups of rats(U/ml，±s)

a與Sham組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;b與SAP組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;c與組內(nèi)6 h時間點(diǎn)比較P＜0.05;d與組內(nèi)12 h時間點(diǎn)比較P＜0.05

組別 6 h(n=6)12 h(n=6)24 h(n=6)F P 0.000 0.000 0.000 0.32 ±0.10 0.28 ±0.06 0.26 ±0.03 1.310 0.299 SAP 組 1.36 ±0.14a 1.61 ±0.20ac 1.67 ±0.22ac 4.730 0.026 NAC+SAP 組 1.33 ±0.16a 1.25 ±0.23ab 0.95 ±0.12abcd 7.766 0.005 F 112.234 88.188 139.661 P Sham組

2.3 小腸組織氧化還原酶活性測定結(jié)果 SAP組和NAC+SAP組的小腸組織中SOD和GSH水平與Sham組比較均明顯降低(P＜0.05)。隨著時間延長SAP組內(nèi)小腸組織中SOD和GSH水平進(jìn)一步下降，以24 h時間點(diǎn)明顯(P＜0.05)。NAC+SAP組的小腸組織中SOD和GSH水平在6 h時間點(diǎn)與SAP組比較無明顯變化(P＞0.05)，但12 h及24 h時間點(diǎn)明顯增高(P＜0.05);組內(nèi)12 h與24 h時間點(diǎn)小腸組織中SOD水平比較無差異(P＞0.05)，但均較6 h時間點(diǎn)升高(P＜0.05);而24 h時間點(diǎn)GSH水平較12 h明顯升高(P＜0.05);SAP組和NAC+SAP組的小腸組織中MDA水平與Sham組比較均明顯增高(P＜0.05);SAP組24 h時間點(diǎn)較6、12 h時間點(diǎn)明顯升高(P＜0.05)，NAC+SAP組的小腸組織中MDA水平在6 h時間點(diǎn)與SAP組比較無明顯變化(P＞0.05)，但12 h及24 h時間點(diǎn)降低明顯(P＜0.05，見表3 ～5)。

表3 各組小腸組織勻漿SOD活性的變化(U/mgprot，±s)Tab 3Changes of SOD levels in small intestine tissue in different groups of rats(U/mgprot，±s)

表3 各組小腸組織勻漿SOD活性的變化(U/mgprot，±s)Tab 3Changes of SOD levels in small intestine tissue in different groups of rats(U/mgprot，±s)

a與Sham組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;b與SAP組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;c與組內(nèi)6 h時間點(diǎn)比較P＜0.05

組別 6 h(n=6)12 h(n=6)24 h(n=6)F P Sham 組 32.62 ±4.04 32.18 ±3.71 30.83 ±3.54 0.367 0.699 0.000 0.000 0.000 SAP 組 17.33 ±2.49a 14.40 ±2.33ac 12.72 ±2.15ac 6.023 0.012 NAC+SAP 組 17.26 ±3.02a 25.30 ±3.42abc 25.20 ±3.09abc 12.582 0.001 F 44.523 46.780 57.788 P

表4 各組小腸組織勻漿GSH含量的變化(mg/gprot，±s)Tab 4Variation of GSH levels in small intestine tissue in different groups of rats(mg/gprot，±s)

表4 各組小腸組織勻漿GSH含量的變化(mg/gprot，±s)Tab 4Variation of GSH levels in small intestine tissue in different groups of rats(mg/gprot，±s)

a與Sham組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;b與SAP組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;c與組內(nèi)6 h時間點(diǎn)比較P＜0.05;d與組內(nèi)12 h時間點(diǎn)比較P＜0.05

組別 6 h(n=6)12 h(n=6)24 h(n=6)F P 0.000 0.000 0.000 4.27 ±0.47 4.17 ±0.40 4.02 ±0.39 0.544 0.592 SAP 組 1.17 ±0.20a 1.00 ±0.11a 0.85 ±0.14ac 6.266 0.011 NAC+SAP 組 1.32 ±0.13a 2.63 ±0.29abc 3.37 ±0.91bcd 20.831 0.000 F 198.876 174.830 50.651 P Sham組

表5 各組小腸組織勻漿MDA含量的變化(nmol/mgprot，±s)Tab 5Variation of MDA levels in small intestine tissue in different groups of rats(nmol/mgprot，±s)

表5 各組小腸組織勻漿MDA含量的變化(nmol/mgprot，±s)Tab 5Variation of MDA levels in small intestine tissue in different groups of rats(nmol/mgprot，±s)

a與Sham組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;b與SAP組同時間點(diǎn)比較P＜0.05;c與組內(nèi)6h時間點(diǎn)比較P＜0.05;d與組內(nèi)12 h時間點(diǎn)比較P＜0.05

組別 6 h(n=6)12 h(n=6)24 h(n=6)F P 0.000 0.000 0.000 0.44 ±0.04 0.46 ±0.06 0.49 ±0.08 0.950 0.409 SAP 組 1.76 ±0.20a 1.84 ±0.24a 2.20 ±0.24acd 6.179 0.011 NAC+SAP 組 1.72 ±0.18a 1.14 ±0.17abc 0.93 ±0.15abcd 36.177 0.000 F 139.248 92.860 161.656 P Sham組

3 討論

重癥急性胰腺炎發(fā)病兇險，并發(fā)癥多，病死率高，而其中20% ～80%的死亡原因與SAP時腸道屏障功能受損、細(xì)菌移位，并發(fā)器官功能衰竭有關(guān)［6－7］。SAP時由于微循環(huán)障礙和缺血再灌注損傷、炎癥介質(zhì)的過度釋放、腸上皮細(xì)胞凋亡以及腸道營養(yǎng)缺乏等導(dǎo)致腸屏障功能受損。腸屏障功能損害時腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的易位進(jìn)一步刺激已活化的單核巨噬細(xì)胞，釋放過量的細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥介質(zhì)的“瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)”，導(dǎo)致SIRS及MODS。因此，維持腸屏障功能的完整性是改善SAP預(yù)后，降低并發(fā)癥和病死率的重要措施。

SAP時腸道血流減少、缺血再灌注損傷以及釋放過量的細(xì)胞因子，產(chǎn)生大量的氧自由基，破壞了腸道屏障。DAO是位于腸黏膜上絨毛細(xì)胞中高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，以空、回腸活性最高，其他組織或細(xì)胞中幾乎不存在。如果血漿中活性增高提示有腸屏障破壞［8］。本研究通過膽胰管內(nèi)逆行推注50 g/L?；悄懰徕c溶液建立SAP大鼠模型，檢測大鼠血DAO水平發(fā)現(xiàn)明顯升高，證明了SAP時確有腸道屏障功能受損。多項(xiàng)研究表明小腸細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡在維持小腸細(xì)胞的功能及腸屏障的完整性方面起著重要的作用。氧化應(yīng)激發(fā)生時，自由基產(chǎn)生和清除之間的生理平衡被打破，結(jié)果是一些過氧化物質(zhì)增加［4－5，9］，如 MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，組織中MDA含量可直接客觀地反映脂質(zhì)過氧化的程度［10］。而SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶，GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的三肽化合物，是細(xì)胞重要的穩(wěn)定性保護(hù)因子，小腸組織中SOD和GSH水平下降，反應(yīng)腸道抗氧化能力的降低。本研究檢測了SAP大鼠小腸組織中SOD、GSH和MDA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸組織中SOD和GSH水平均明顯降低;MDA水平明顯增高(P＜0.05)，證明了SAP時小腸組織發(fā)生了氧化還原功能失調(diào)，從而導(dǎo)致了腸屏障功能的破壞。

NAC為左旋精氨酸的天然衍生物，是一種抗氧化劑及體內(nèi)活性氧自由基清除劑。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)NAC通過其強(qiáng)有力的抗氧化作用，可對腸缺血再灌注、炎癥性腸病、燒傷、熱損傷、感染等多種疾病相關(guān)的腸屏障功能障礙起到有效的防治作用［4－5，11］。本研究在大鼠SAP建模前2 h先給予腹腔注射NAC，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過NAC預(yù)處理的大鼠，胰腺實(shí)質(zhì)及脂肪組織壞死減輕，中性粒細(xì)胞浸潤減少。末端回腸結(jié)構(gòu)的完整性較SAP組有改善，12 h后血清淀粉酶、DAO水平較SAP組同時間點(diǎn)顯著降低(P＜0.05)。在6 h時間點(diǎn)時小腸組織中SOD、GSH和MAD水平與SAP組比較差異不明顯，但12 h后SOD和GSH水平明顯增高、MAD水平明顯降低(P＜0.05)。說明了NAC可以增加小腸組織SOD和GSH水平，減少過氧化物質(zhì)的生成，維持小腸細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，從而減輕小腸組織損傷，能有效保護(hù)腸道屏障功能，對預(yù)防和治療SAP繼發(fā)腸黏膜屏障損害具有重要意義。

總之，重癥急性胰腺炎發(fā)病兇險，死亡原因與SAP時腸道屏障功能受損細(xì)菌移位等有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)防和治療SAP大鼠繼發(fā)的腸黏膜屏障損害具有重要意義，為臨床上NAC預(yù)防和治療SAP時腸屏障功能受損提供理論基礎(chǔ)。

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