韌革菌Stereum sp.YM F1.1660的化學成分研究

田夢青，李建芳，李國紅

(云南大學云南省生物資源保護與利用重點實驗室，云南昆明 650091)

韌革菌Stereum sp.YM F1.1660的化學成分研究

田夢青，李建芳，李國紅

(云南大學云南省生物資源保護與利用重點實驗室，云南昆明 650091)

對韌革菌屬真菌Stereum sp.YMF1.1660發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及菌絲的甲醇提取物的化學成分進行了研究，從中分離得到6個化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析鑒定為butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)、butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)、dibutyl phthalate(Ⅳ)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)和6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ是首次從韌革菌屬真菌中分離得到。

韌革菌;發(fā)酵液;菌體;化學成分

韌革菌屬真菌主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，生于木屑或埋藏的腐木上。研究表明，該屬真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類豐富、結(jié)構(gòu)多樣，包括苯丙呋喃、酚類、酮類以及萜類化合物，尤其能夠產(chǎn)生豐富的倍半萜類化合物［1］。其中一些化合物表現(xiàn)出抗菌活性［2］、殺線蟲活性［3］、抗氧化活性［4］、抗腫瘤活性［5］等。為了對韌革菌屬真菌的化學成分進行比較全面的了解，作者對該屬真菌Stereum sp.YMF1.1660發(fā)酵液的化學成分進行了研究，并對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株Stereum sp.YMF1.1660，自行保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.2 試劑與儀器

所用有機溶劑均為重蒸工業(yè)純試劑。

Sephadex LH-20型柱層析凝膠，Pharmacia公司; 200～300目柱層析硅膠、薄層層析(TLC)用硅膠G板，青島海洋化工廠;D101大孔吸附樹脂，天津興南允能高分子技術(shù)有限公司;Bruker DRX-500型超導(dǎo)核磁共振儀;Finnigan LCQ-Advantage型質(zhì)譜儀。

1.3 菌株的發(fā)酵及發(fā)酵液的濃縮萃取

菌株Stereum sp.YMF1.1660在PDA培養(yǎng)基上活化7 d，待菌絲長滿平板、生長旺盛時，將其轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中［裝液量為200 mL·(500 mL三角瓶)-1］，于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d。再將活化菌株以5%的接種量接種于PDB培養(yǎng)基中［裝液量為250 mL ·(500 mL三角瓶)-1］，共發(fā)酵30 L，于28℃、160 r· min-1搖床培養(yǎng)12 d。

經(jīng)過發(fā)酵的培養(yǎng)物，用紗布將菌絲和發(fā)酵液分開。發(fā)酵液減壓濃縮至2 L，用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取數(shù)次，至萃取相中無明顯顏色為止，再將萃取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下濃縮至干，得到乙酸乙酯萃取物1.1660A(1.9 g)、正丁醇萃取物1.1660B(34.59 g)。菌絲在45℃烘箱中烘干，再用甲醇浸泡提取，得到甲醇提取物1.1660C(5.35 g)。

1.4 菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取部分的分離

將1.9 g乙酸乙酯萃取物1.1660A上甲醇凝膠柱，得到6個組分(A1～A6)。

將組分A4(672 mg)上甲醇凝膠(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到4個組分(A4-1～A4-4)。其中組分A4-2(357 mg)用等量硅膠拌樣，自然風干，二氯甲烷及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為100∶1、50∶1的二氯甲烷-丙酮依次梯度洗脫，根據(jù)薄層層析展板、顯色合并相同餾分，得到3個組分(A4-2-1～A4-2-3)。其中組分A4-2-1(70 mg)上甲醇凝膠(40 g)柱得到2個組分(A4-2-1-1～A4-2-1-2)。將組分A4-2-1-1用等量硅膠拌樣，自然風干，三氯甲烷及硅膠裝柱，干法上樣，用純?nèi)燃淄橄疵?，得到化合物?7 mg)。

將組分A5(840 mg)上甲醇凝膠柱得到3個組分(A5-1～A5-3)。其中A5-1(330 mg)用甲醇溶解后用硅膠拌樣，二氯甲烷及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為400∶1、300∶1、200∶1、50∶1、10∶1、2∶1、0∶1的二氯甲烷-丙酮依次梯度洗脫，根據(jù)薄層層析展板、顯色合并相同餾分，得到化合物Ⅱ(6 mg)。

1.5 菌株發(fā)酵液正丁醇萃取部分的分離

將34.59 g正丁醇萃取物1.1660B用D101大孔吸附樹脂柱層析，用體積比為0∶1、30∶1、60∶1、100∶1的乙醇-水依次梯度洗脫，得到4個組分(B1～B4)。

將組分B2(1.24 mg)上甲醇凝膠(140 mg)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到3個組分(B2-1～B2-3)。其中組分B2-2(645 mg)用等量硅膠拌樣，自然風干，乙酸乙酯及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為100∶1、80∶1、50∶1、20∶1的乙酸乙酯-甲醇依次梯度洗脫，得到4個組分(B2-2-1～B2-2-4)。將組分B2-2-2用等量硅膠拌樣，自然風干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為300∶1、200∶1、100∶1、50∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脫，得到化合物Ⅲ(5 mg)。將組分B2-2-3(71 mg)用等量硅膠拌樣，自然風干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為80∶1、50∶1、20∶1、10∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脫，得到化合物Ⅳ(5 mg)。

1.6 菌絲甲醇提取部分的分離

將5.35 g甲醇提取物1.1660C用甲醇溶解，等量硅膠拌樣，自然風干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1的石油醚-丙酮依次梯度洗脫，根據(jù)薄層層析展板、顯色合并相同餾分，得到10個組分(C1～C10)。

將組分C4(53 mg)重復(fù)上2次丙酮凝膠(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，得到3個組分(C4-1～C4-3)。其中組分C4-2(40 mg)用等量硅膠拌樣，自然風干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1的石油醚-丙酮依次洗脫，得到4個組分(C4-2-1～C4-2-4)，將組分C4-2-2(8.5 mg)上丙酮凝膠(20 g)柱，分離得到化合物Ⅴ(4 mg)。

將組分C7(120 mg)上甲醇凝膠(70 g)柱，流速控制在每滴8～9 s，分離得到3個組分(C7-1～C7-3)。其中組分C7-2(80 mg)用等量硅膠拌樣，自然風干，石油醚及硅膠裝柱，干法上樣，用體積比為30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1的石油醚-丙酮依次洗脫，分離得到化合物Ⅵ(12 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)表征

化合物Ⅰ:無色油狀物;ESI-MS，m/z:237［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ:4.27(1H，d，J= 7.8 Hz)，3.87～3.95(2H，m)，3.70(1H，m)，3.58 (1H，m)，3.26～3.38(3H，m)，3.20(1H，m)，1.65 (2H，m)，1.45(2H，m)，0.98(3H，t，J=7.6 Hz);13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ:71.0(t，C-1)，33.3(t，C-2)，20.6(t，C-3)，14.6(q，C-4)，104.8(d，C-1')，75.6(d，C-2')，78.6(d，C-3')，72.1(d，C-4')，78.3(d，C-5')，63.3(t，C-6')。與文獻［6］報道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅰ為butyl-β-D-glucopyranoside。

化合物Ⅱ:黃色油狀物;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:3.90(3H，s，MeO)，3.88(3H，s，MeO)，4.62 (2H，s，H-7)，6.86(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.93(1H，s，H-2);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:56.4(MeO)，56.3(MeO)，65.7(C-7)，111.0(C-5)，111.6(C-2)，129.8(C-6)，134.0(C-1)，149.1(C-4)，149.6(C-3)。與文獻［7］報道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅱ為(3，4-dimethoxyphenyl)methanol。

化合物Ⅲ:無色油狀物;ESI-MS，m/z:237［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ:4.84(1H，m，overlap with water)，4.00(1H，m)，3.89～3.93(2H，m)，3.69～3.72(2H，m)，3.60～3.62(2H，m)，3.41(1H，m)，3.31(1H，m)，1.58(2H，t，J=5.8 Hz)，1.40(2H，q，J=7.6 Hz)，0.95(3H，t，J=7.4 Hz);13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ:109.8(d，C-1')，84.7(d，C-4')，83.8 (d，C-2')，79.2(d，C-3')，72.3(d，C-5')，69.0(t，C-1)，65.0(t，C-6')，33.3(t，C-2)，20.7(t，C-3)，14.6 (q，C-4)。與文獻［6］報道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅲ為butyl-β-D-glucofuranoside。

化合物Ⅳ:無色油狀物;ESI-MS，m/z:579［2M+ Na］+，279［M+H］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ: 7.71(2H，m)，7.52(2H，m)，4.30(4H，t，J=6.8 Hz)，1.73(4H，tt，J=7.1 Hz)，1.47(4H，qq，J=7.5 Hz)，0.96(6H，t，J=7.5 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:168.0(C-7)，132.7(C-1/2)，131.3(C-3/4)，129.2(C-5/6)，65.9(C-1'/1'')，31.0(C-2'/2'')，19.6(C-3'/3'')，14.1(C-4'/4'')。與文獻［8］報道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅳ為dibutyl phthalate。

化合物Ⅴ:無色固體;ESI-MS，m/z:429［M+ H］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:6.53(1H，d，J= 8.4 Hz)，6.26(1H，d，J=8.5 Hz)，5.26(2H，m)，3.76 (1H，m)，1.01(3H，d，J=5.8 Hz)，0.94(3H，d，J= 6.7 Hz)，0.91(3H，s)，0.89(3H，d，J=6.7 Hz)，0.84 (3H，s)，0.83(3H，d，J=6.7 Hz);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:30.8(C-1)，35.0(C-2)，67.0(C-3)，39.9 (C-4)，83.4(C-5)，136.8(C-6 or C-22)，131.7(C-7)，80.7(C-8)，51.5(C-9)，37.5(C-10)，21.4(C-11)，37.8(C-12)，45.3(C-13)，52.1(C-14)，24.0(C-15)，29.1(C-16)，57.6(C-17)，13.1(C-18)，18.2(C-19)，40.3(C-20)，136.8(C-22 or C-6)，133.5(C-23)，44.3 (C-24)，34.4(C-25)，20.1(C-26)，20.4(C-27)，18.3 (C-28)。與文獻［9］報道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅴ為5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol。

化合物Ⅵ:白色針狀結(jié)晶;ESI-MS，m/z:413［M+ 1］+;1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ:0.60(3H，s)，0.83 (3H，d，J=6.5 Hz)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz)，0.92 (3H，d，J=6.8 Hz)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz)，1.08 (3H，s)，5.19(1H，dd，J=15.2 Hz，8.0 Hz)，5.23 (1H，dd，J=15.2 Hz，7.2 Hz)，4.07(1H，m)，3.63 (1H，m)，5.32(1H，brs);13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ:144.4(C-8)，135.8(C-22)，132.6(C-23)，118.0(C-7)，76.4(C-9)，74.1(C-6)，68.1(C-3)，56.4(C-17)，55.2(C-14)，44.2(C-10)，43.8(C-13)，43.2(C-24)，40.8(C-20)，39.9(C-4)，39.7(C-12)，37.6(C-5)，33.5(C-25)，31.3(C-1)，30.9(C-2)，28.3(C-16)，23.3(C-11)，22.5(C-15)，21.5(C-21)，21.2(C-21)，20.3(C-27)，20.0(C-26)，19.2(C-19)，17.6(C-28)，12.5(C-18)。與文獻［10］報道的化合物數(shù)據(jù)相比較，確定化合物Ⅵ為6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol。

2.2 化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)式及生物活性

化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅵ的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formu la of com poundⅠ～Ⅵ

化合物Ⅰ(butyl-β-D-glucopyranoside)和化合物Ⅲ(butyl-β-D-glucofuranoside)是文獻［6］報道的人工合成化合物，首次在韌革菌屬(Stereum)真菌中分離得到?；衔铫颍?3，4-dimethoxyphenyl)methanol］是Kanho等［7］用牽牛屬 (Pharbitisnil)的根對苯甲醛類(benzaldehyde-type)和乙酰苯類(acetophenone-type)衍生物進行生物轉(zhuǎn)化得到的，未報道其生物活性，其生物活性的篩選有待進一步研究?；衔铫?dibutyl phthalate)是Savard等［11］從青霉菌屬菌株 Penicillium bilaii PB-50中分離得到的，可顯著提高乳腺上皮細胞的增殖和泌乳能力［12］，此化合物也是首次在韌革菌屬(Stereum)真菌中分離得到。韓珊等［13］研究發(fā)現(xiàn)，化合物Ⅳ會導(dǎo)致板栗幼苗枯萎?；衔铫?5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol)是真菌中普遍存在的化合物?；衔铫?6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol)是陳曉梅等［10］從石斛小菇菌絲體的甲醇提取物中分離得到的，在韌革菌屬(Stereum)真菌中首次分離得到。

對所分離到的6種化合物進行殺線蟲實驗，結(jié)果表明，6種化合物均無殺線蟲活性。

3 結(jié)論

從韌革菌屬真菌Stereum sp.YMF1.1660發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及菌絲的甲醇提取物中分離得到6個化合物:butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)、(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)、butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)、dibutyl phthalate(Ⅳ)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)和6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ是首次從韌革菌屬真菌中分離得到。

［1］ ABRAHAM W R.Bioactive sesquiterpenes produced by fungi:Are they useful for humans as well?［J］.Current Medicinal Chemistry，2001，8(6):583-606.

［2］ YUN B S，LEE IK，CHO Y，et al.New tricyclic sesquiterpenes from the fermentation broth of Stereum hirsutum［J］.Journal of Natural Products，2002，65(5):786-788.

［3］ LIG H，DUAN M，YU Z F，et al.Stereumin A-E，sesquiterpenoids from the fungus Stereum sp.CCTCC AF 207024［J］.Phytochemistry，2008，69(6):1439-1445.

［4］ KIM Y H，YUN B S，RYOO IJ，et al.Methoxylar-icinolic acid，a new sesquiterpene from the fruiting bodies of Stereum ostrea［J］.Journal of Antibiotics，2006，59(7):432-434.

［5］ ISAKA M，SRISANOH U，SAPPAN M，et al.Sterostreins F-O，illudalanes and norilludalanes from culturesof the Basidiomycete Stereum ostrea BCC 22955［J］.Phytochemistry，2012，79:116-120.

［6］ 朱偉明，李順林，趙慶，等.藥用植物盆架樹中的縮醛［J］.云南植物研究，2007，29(6):708-712.

［7］ KANHO H，YAOYA S，KAWAHARA N，et al.Biotransformation of benzaldehyde-type and acetophenone-type derivatives by Pharbitis nil hairy roots［J］.Chemical＆Pharmaceutical Bulletin，2005，53(4): 361-365.

［8］ 李想，姚燕華，鄭毅男，等.紅樹林植物海漆的化學成分(Ⅰ)［J］.中國天然藥物，2006，4(3):188-191.

［9］ YUE JM，CHEN SN，LIN ZW，etal.Sterols from the fungus Lactarium volemus［J］.Phytochemistry，2001，56(8):801-806.

［10］ 陳曉梅，楊峻山，郭順星.石斛小菇中的甾醇類化合物［J］.藥學學報，2000，35(5):367-369.

［11］ SAVARD M E，MILLER JD，BLAIS L A，et al.Secondary metabolites of Penicillium bilaii strain PB-50［J］.Mycopathologia，1994，127(1):19-27.

［12］ 萬中英，佟慧麗，李慶章，等.王不留行增乳活性單體對奶牛乳腺上皮細胞增殖及泌乳性能的影響［J］.乳業(yè)科學與技術(shù)，2010，33 (2):66-68.

［13］ 韓珊，朱天輝.寄生隱叢赤殼菌致病毒素Cp-Ⅰ的分離純化和結(jié)構(gòu)分析［J］.菌物學報，2009，28(4):535-540.

Study on Chem ical Constituents of Stereum sp.YMF1.1660

TIAN M eng-qing，LI Jian-fang，LIGuo-hong
(Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resource，Yunnan University，Kunming 650091，China)

The chemical constituents of Stereum sp.YMF1.1660 were investigated.Six compounds including butyl-β-D-glucopyranoside(Ⅰ)，(3，4-dimethoxyphenyl)methanol(Ⅱ)，butyl-β-D-glucofuranoside(Ⅲ)，dibutyl phthalate (Ⅳ)，5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol(Ⅴ)and 6，9-epoxy-ergosta-7，22-dien-3-ol(Ⅵ)were isolated from its ethyl acetate and n-butanol extract of broth and methanol extract ofmycelia.And the compoundsⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ andⅥwere first isolated from Stereum sp..Their structureswere characterized and confirmed by spectroscopy analysis.

Stereum sp.;broth;mycelia;chemical constituents

R 284.1

A

1672-5425(2015)02-0029-04

版權(quán)聲明

《化學與生物工程》編輯部

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.007

國家973計劃項目(2013CB127505)，云南省自然科學基金資助項目(2013FB003)

2014-11-19

田夢青(1991-)，女，云南大姚人，碩士研究生，研究方向:微生物次生代謝產(chǎn)物，E-mail:793138039@qq.com;通訊作者:

李國紅，副研究員，E-mail:ligh@ynu.edu.cn。

為適應(yīng)我國信息化建設(shè)，擴大本刊及作者知識信息交流渠道，本刊已被《中國學術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)出版總庫》及CNKI系列數(shù)據(jù)庫、《萬方數(shù)據(jù)——數(shù)字化期刊群》、《中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(全文版)》、《臺灣華藝數(shù)據(jù)庫》等收錄。如作者不同意論文被收錄，請在來稿時向本刊聲明，本刊將作適當處理。