格列齊特脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評價

劉力銘，王洪光

（青島科技大學化工學院，山東青島 266042）

格列齊特脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評價

劉力銘，王洪光

（青島科技大學化工學院，山東青島 266042）

采用薄膜分散法制備格列齊特脂質(zhì)體，以粒徑和包封率為考核指標，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化制備條件，測定最優(yōu)條件制備格列齊特脂質(zhì)體的平均粒徑和包封率。確定最優(yōu)制備條件為：藥脂比1∶10（g∶g）、超聲時間10min、成膜溫度60℃、緩沖液pH值6。所制備脂質(zhì)體的平均粒徑為（108.3±12.4）nm、包封率為（72.19±3.6）%、平均Zeta電位為（－40.8±2.3）mV，且在4℃下保存穩(wěn)定性好。電鏡照片顯示，所制備脂質(zhì)體圓整度好、粒徑均一、無粘連。表明采用薄膜分散法制備格列齊特脂質(zhì)體工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

格列齊特；脂質(zhì)體；薄膜分散法；包封率

格列齊特（gliclazide），又名達美康，主要用于成年后發(fā)病單用飲食控制無效的，且無酮癥傾向的輕、中型糖尿?。?］；能改善糖尿病人眼底病變以及代謝、血管功能的紊亂；可與雙胍類口服降血糖藥合用于單用不能控制的糖尿病患者，與胰島素合用治療胰島素依賴型糖尿病，可減少胰島素用量。近年來，人們開始研究脂質(zhì)體作載體來降低藥物毒性，提高藥物的組織相容性、細胞親和性、靶向性和緩釋性［2］。目前，國內(nèi)已有格列齊特緩釋片和緩釋膠囊出售，尚無格列齊特注射液問世。由于格列齊特緩釋片存在單次給藥量大，若出現(xiàn)嘔吐、血小板減少、貧血等不良反應時不能及時停藥等缺點，因此，作者嘗試制備格列齊特脂質(zhì)體以降低其毒性。

作者選用大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，采用薄膜分散法制備格列齊特脂質(zhì)體。以平均粒徑和包封率為考核指標，優(yōu)化了脂質(zhì)體的制備工藝，為進一步生產(chǎn)格列齊特注射液提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

格列齊特（含量99%），天津鑫鑫制藥廠；大豆卵磷脂（化學純），天津博迪化工股份有限公司；膽固醇（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；維生素E（含量98%），鄭州荔諾生物科技有限公司；氯仿（分析純），煙臺三和化學試劑有限公司；甲醇（色譜純），天津科密歐化學試劑有限公司；Sephadex G-10葡聚糖凝膠，北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司。

UV1000型紫外分光光度計，北京萊伯泰科有限公司；IT-09A5型恒溫磁力攪拌器，上海一恒科學儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90型納米粒度和Zeta電位及分子量分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.2 脂質(zhì)體的制備

分別精密稱取0.3g大豆卵磷脂、0.15g膽固醇、0.05g維生素E和0.03g格列齊特于燒杯中，加入適量氯仿，將燒杯置于恒溫磁力攪拌器上，常溫下攪拌至完全溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，減壓蒸餾除去氯仿，燒瓶內(nèi)壁出現(xiàn)一層透明薄膜。燒瓶中加入磷酸鹽緩沖液使膜充分水化，然后將燒瓶置于超聲波清洗器內(nèi)超聲，生成乳白色半透明溶液，分別過0.45μm和0.22μm微孔濾膜各3次，即得格列齊特脂質(zhì)體［3］。

1.3 優(yōu)化實驗

以藥脂比（格列齊特與大豆卵磷脂的質(zhì)量比，g∶g，下同）、超聲時間、成膜溫度和緩沖液pH值作為考察因素，以包封率為考核指標進行單因素實驗；在單因素實驗基礎上，進行4因素3水平正交實驗，確定最優(yōu)條件；以篩選出的最優(yōu)條件制備脂質(zhì)體，重復3次，測定脂質(zhì)體平均包封率、平均粒徑和平均電位，并觀察脂質(zhì)體形態(tài)，驗證最優(yōu)制備條件。

1.4 標準曲線的繪制

精密稱取20mg格列齊特置于250mL容量瓶中，加入pH值7.4的磷酸鹽緩沖液，振搖、溶解，定容，得濃度為0.08mg·mL－1格列齊特標準溶液。分別精密量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL標準溶液于25mL容量瓶中，加緩沖液定容、搖勻，在226nm處測吸光度。以濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，擬合得標準曲線方程：A＝0.039c＋0.0035，R2＝0.9999。結(jié)果表明，格列齊特在3.456～20.738μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

1.5 回收率實驗

精密稱取16mg、20mg和24mg格列齊特，分別加入50mL空白脂質(zhì)體溶液。搖勻后加入甲醇超聲破膜，用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液定容。測定格列齊特脂質(zhì)體溶液的吸光度，根據(jù)吸光度計算與空白脂質(zhì)體混合后的藥物含量，按式（1）計算回收率：

1.6 包封率的測定

取2mL格列齊特脂質(zhì)體溶液上樣于Sephadex G-10柱（上樣前應先加空白脂質(zhì)體直至流出液為乳白色溶液），上樣結(jié)束后用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫速度為1mL·min－1，收集洗脫液，每份收集1mL，共收集30份。每份洗脫液分別用適量甲醇超聲破膜，再用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液定容至10mL，搖勻，測定吸光度［4］，以吸光度為縱坐標、洗脫時間為橫坐標繪制洗脫曲線。根據(jù)吸光度可以計算出每份樣品中的藥物含量，按式（2）計算包封率：

1.7 穩(wěn)定性實驗

將制備的格列齊物脂質(zhì)體分成3份，分別于4℃、25℃、50℃下保存30d，在第0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d、30d分別取樣測定包封率，繪制包封率曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 回收率實驗

經(jīng)計算得格列齊特回收率分別為（99.8±1.7）%、（100.5±2.6）%、（104.3±3.4）%（n＝3）。操作過程中，藥物的損失量一定，加入的藥物越多，藥物損失對結(jié)果的影響就越小，回收率越高。結(jié)果表明，制備脂質(zhì)體的輔料對樣品測定沒有影響，且方法簡便、重現(xiàn)性好。

2.2 洗脫曲線（圖1）

圖1 格列齊特脂質(zhì)體洗脫曲線Fig.1 The elution curve of gliclazide liposome

由于含藥脂質(zhì)體的粒徑大于游離藥物，因此，含藥脂質(zhì)體會先于游離藥物被洗脫出來［5］，即該洗脫曲線有兩個分離度較好的峰：第一個峰所對應的幾組樣品的藥物含量總和即為被包封的藥物含量，第二個峰所對應的幾組樣品的藥物含量總和即為未包封的藥物含量。

由圖1可看出，洗脫時間為5～11min所收集樣品為含藥脂質(zhì)體，洗脫時間為17～25min所收集樣品為游離藥物。分別計算每份樣品的藥物含量，計算脂質(zhì)體的包封率為62.63%。

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 藥脂比

保持超聲時間、成膜溫度和緩沖液pH值不變，分別制備藥脂比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的脂質(zhì)體溶液，測定包封率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同藥脂比下的包封率Fig.2 The entrapment efficiency of different drug-lipid ratios

由圖2可知，隨著藥脂比的減小（即大豆卵磷脂質(zhì)量的增加），包封率逐漸增大，但藥脂比為1∶10和1∶20時，包封率分別為53.21%和56.35%，相差不大。綜合考慮載藥量，選取適宜的藥脂比為1∶10。2.3.2 超聲時間

其它條件不變，制備超聲時間分別為5min、10 min、15min、20min的脂質(zhì)體溶液，測定包封率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同超聲時間下的包封率Fig.3 The entrapment efficiency of different ultrasonic times

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，包封率先增大后減??；當超聲時間為10min時，包封率最大，達到57.39%。這是因為，隨著超聲時間的延長，脂質(zhì)體粒徑會越來越小，而粒徑越小的脂質(zhì)體包封率也越低。因此，選取適宜的超聲時間為10min。

2.3.3 成膜溫度

其它條件不變，制備成膜溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃的脂質(zhì)體溶液，測定包封率，結(jié)果見圖4。

圖4 不同成膜溫度下的包封率Fig.4 The entrapment efficiency of different film-forming temperatures

由圖4可知，隨著成膜溫度的升高，包封率先增大后減?。划敵赡囟葹?0℃時，包封率最大，達到55.31%。這可能是因為，成膜溫度太高會增加膜分子的熱運動，膜的流動性增強，從而包封率降低。因此，選取適宜的成膜溫度為50℃。

2.3.4 緩沖液pH值

其它條件不變，制備緩沖液pH值分別為5、6、7、8的脂質(zhì)體溶液，測定包封率，結(jié)果見圖5。

圖5 不同緩沖液pH值下的包封率Fig.5 The entrapment efficiency of different pH values of buffer solution

由圖5可知，隨著緩沖液pH值的增大，包封率先增大后減小；緩沖液pH值為7時，包封率最大，達到56.24%。這是因為，當緩沖液pH值為7時，脂質(zhì)體的性質(zhì)最穩(wěn)定，緩沖液pH值過高或過低都會加速脂質(zhì)體的水解，降低包封率。因此，選取適宜的緩沖液pH值為7。

2.4 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取恰當?shù)乃剑肔9（34）正交實驗優(yōu)化制備條件，正交實驗的因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實驗的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實驗結(jié)果與分析Tab.2 The results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，各因素對包封率影響的大小順序為：B＞A＞D＞C，即超聲時間＞藥脂比＞緩沖液pH值＞成膜溫度；優(yōu)化組合為A2B2C3D1，即藥脂比為1∶10、超聲時間為10min、成膜溫度為60℃、緩沖液pH值為6。

2.5 驗證實驗

經(jīng)測定，3組最優(yōu)條件所制備脂質(zhì)體的平均包封率為（72.19±3.6）%，平均粒徑為（108.3±12.4）nm，平均Zeta電位為（－40.8±2.3）mV。表明所確定的制備條件是穩(wěn)定可行的。

2.5.1 脂質(zhì)體的納米粒度分析（圖6）

圖6 脂質(zhì)體的納米粒度分布Fig.6 The size distribution of liposome nanoparticles

由圖6可知，最優(yōu)條件所制備的脂質(zhì)體在100～200nm內(nèi)完全分布，分布窄且無雜質(zhì)，符合注射用脂質(zhì)體的要求。

2.5.2 脂質(zhì)體的Zeta電位分布（圖7）

圖7 脂質(zhì)體的Zeta電位分布Fig.7 Zeta potential pattern of liposome nanoparticles

平均Zeta電位在－30～－60mV之間的脂質(zhì)體溶液是穩(wěn)定、不易泄露的［6］。由圖7可知，所制備的脂質(zhì)體的平均Zeta電位為（－40.8±2.3）mV。電位為負電位，穩(wěn)定性好。

2.5.3 脂質(zhì)體的透射電鏡照片（圖8）

由圖8可知，所制備的脂質(zhì)體顆粒近似圓形、無粘連且粒徑均一。在進行透射電鏡檢測時，因為受到高溫干燥和電子束轟擊，會導致部分脂質(zhì)體顆粒破裂，因而透射電鏡照片中的粒子數(shù)較少。

圖8 格列齊特脂質(zhì)體透射電鏡照片F(xiàn)ig.8 TEM Image of gliclazide liposome

2.6 穩(wěn)定性實驗

測定3組樣品的包封率，繪制包封率曲線，見圖9。

圖9 包封率曲線Fig.9 The curve of entrapment efficiency

由圖9可知，在4℃下保存的脂質(zhì)體，包封率下降緩慢且30d后包封率仍在50%以上，而50℃保存的脂質(zhì)體在30d后包封率已經(jīng)降到30%以下，所以脂質(zhì)體溶液適宜在低溫環(huán)境下保存［7］。

2.7 討論

膜材中加入少量抗氧化物可有效抑制磷脂的氧化，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性［8］。實驗中加入的維生素E安全無害，不但可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，且對人體有益。

測定脂質(zhì)體包封率的方法主要有：高速離心法、超濾離心法和葡聚糖凝膠柱法［9］。高速離心法由于脂質(zhì)體粒徑太小，不能使載藥脂質(zhì)體和游離藥物完全分離，導致測量結(jié)果不準確；超濾離心法雖然測量準確，但測量費用昂貴，且操作復雜；葡聚糖凝膠柱法，方法簡單、測量準確、重現(xiàn)性好，可以有效地分離含藥脂質(zhì)體和游離藥物，因此選取葡聚糖凝膠柱法測量脂質(zhì)體包封率。

Sephadex G-10適用于分離小分子的脂溶性藥物，若所包封的藥物是水溶性藥物應該選取Sephadex G-50柱［10］。Sephadex G-10柱可有效地分離含藥脂質(zhì)體和游離的格列齊特。

3 結(jié)論

采用薄膜分散法制備格列齊特脂質(zhì)體，以粒徑和包封率為考核指標，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化制備條件。確定制備格列齊特脂質(zhì)體的最優(yōu)條件為：藥脂比1∶10（g∶g）、超聲時間10min、成膜溫度60℃、緩沖液pH值6。驗證實驗表明，所制備的脂質(zhì)體包封率達到（72.19±3.6）%，平均粒徑為（108.3± 12.4）nm，且粒徑分布均勻、形態(tài)規(guī)整，平均Zeta電位為（－40.8±2.3）mV，且在4℃下保存穩(wěn)定性好。本方法工藝簡單、條件溫和、重現(xiàn)性好，有望進一步制備格列齊特脂質(zhì)體注射液。

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Preparation and Quality Evaluation of Gliclazide Liposome

LIU Li-ming，WANG Hong－guang
（College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China）

Gliclazide liposomes were prepared by thin-film dispersion method.Using mean diameter and entrapment efficiency as evaluation index，the preparation conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment，and mean diameter and entrapment efficiency were measured.The optimal conditions were as follows：drug-lipid ratio of 1∶10（g∶g），ultrasonic time of 10min，film-forming temperature of 60℃，the buffer solution pH value of 6.The mean diameter，entrapment efficiency and average Zeta potential of gliclazide liposomes were（108.3±12.4）nm，（72.19±3.6）%and（－40.8±2.3）mV，respectively.The liposomes showed good stability under preservation at 4℃.TEM Image showed that the liposomes exhibited good spherical degree，uniform particle size and no adhesion.The results showed that the process of gliclazide liposomes prepared by thin-film dispersion method was stable and the quality could be controlled well.

gliclazide；liposome；thin-film dispersion method；entrapment efficiency

TQ 460.6

A

1672-5425（2015）03-0040-05

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.03.010

2014-11-06

劉力銘（1988－），男，遼寧丹東人，碩士研究生，研究方向：藥物新劑型，E-mail：403005919＠qq.com；通訊作者：王洪光，教授，E-mail：whongg1＠yeah.net。