滲透性冷凍保護(hù)劑對山羊精子的冷凍保護(hù)效果

席利萌，羅 軍，楊地坤，王 維，孫 爽，史懷平，馬雪瑤

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

滲透性冷凍保護(hù)劑對山羊精子的冷凍保護(hù)效果

席利萌，羅 軍，楊地坤，王 維，孫 爽，史懷平，馬雪瑤

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 探索滲透性冷凍保護(hù)劑甘油、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMA)對山羊精子的冷凍保護(hù)效果?！痉椒ā?采用假陰道法采集繁殖性能正常、健康、年齡2～4歲的6只西農(nóng)薩能奶山羊種公羊精液，以Tris-卵黃為基礎(chǔ)稀釋液，分別添加體積分?jǐn)?shù)為6%的甘油、3%和6%的乙二醇、3%和6%的DMSO、3%和6%的DMA，測定冷凍-解凍后精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整率、線粒體完整性、谷胱甘肽還原酶活性和丙二醛(MDA)濃度，對比不同冷凍保護(hù)劑對山羊精子的冷凍保護(hù)效果?！窘Y(jié)果】 甘油(6%)和乙二醇(3%，6%)組解凍后精子活率均極顯著(P<0.01)高于DMSO(3%，6%)和DMA(3%，6%)處理組；甘油(6%)、DMA(6%)和乙二醇(3%)組的線粒體完整性極顯著(P<0.01)高于其他組；甘油(6%)和乙二醇(3%，6%)組的質(zhì)膜完整率極顯著(P<0.01)高于其他組；從頂體完整性、谷胱甘肽還原酶活性和MDA濃度等指標(biāo)看，甘油(6%)和乙二醇(3%，6%)組極顯著(P<0.01)優(yōu)于其他組?！窘Y(jié)論】 稀釋液中添加乙二醇(3%，6%)和甘油(6%)都能明顯提高山羊冷凍精子品質(zhì)，其中3%乙二醇可以替代甘油作為山羊精液冷凍保護(hù)劑從而發(fā)揮更好的抗冷凍保護(hù)作用。

山羊；冷凍保護(hù)劑；精液；冷凍保存

精液冷凍保存技術(shù)有利于種質(zhì)資源保存及遺傳基因改良。凍精稀釋液在一定程度上能夠保護(hù)精子，但精子極易在低溫或超低溫環(huán)境下受到冷凍損傷[1-2]，這種損傷不僅影響精子結(jié)構(gòu)完整性和存活能力，也影響精子的受精能力[3]。為了提高精子的冷凍保存效果，在冷凍稀釋液中添加冷凍保護(hù)劑顯得很有必要。甘油(相對分子質(zhì)量92.10)作為一種小分子滲透性冷凍保護(hù)劑，常用于山羊精液冷凍保存[4],但高濃度甘油對精子是有毒性的，不利于精子功能更好的發(fā)揮[5]。乙二醇(EG，相對分子質(zhì)量 62.7)與甘油有著類似的結(jié)構(gòu)[6]，在冷凍胚胎中已經(jīng)得到成功應(yīng)用[7]，也有報道指出乙二醇可明顯提高綿羊凍精品質(zhì)[8]。小分子物質(zhì)二甲基乙酰胺(DMA，相對分子質(zhì)量59.07)，在家兔精液冷凍保存中發(fā)揮了較好的效果[9-10]。二甲基亞砜(DMSO)常用于細(xì)胞冷凍，也可用于精液冷凍保存[11-12]。DMA 和DMSO作為滲透性冷凍保護(hù)劑在山羊精液冷凍保存中鮮見報道。

本研究在冷凍稀釋液中分別添加不同體積分?jǐn)?shù)的甘油、乙二醇、DMSO、DMA等4種滲透性冷凍保護(hù)劑對山羊精液進(jìn)行冷凍保存，以冷凍-解凍后精子的運(yùn)動參數(shù)、質(zhì)膜完整性以及相關(guān)抗氧化等指標(biāo)為考察指標(biāo)，探討不同冷凍保護(hù)劑對山羊精子的冷凍-解凍效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑及儀器 主要試劑：果糖(F0127-100G)、甘油(G5516)、DMSO(D8418)、乙二醇(03750)、DMA(271012)、羅丹明123(R-8004)、碘化丙啶(P4170-10MG)、噻唑藍(lán)(M2128-250MG)、硫代巴比妥酸(T5500-25G)和三氯乙酸(T6399-100G)，均購自美國Sigma公司；HOST低滲膨脹試劑盒(GMS14017)、GPX測定試劑盒(GMS14015.1.1)、FITC-花生凝集素(PNA)試劑盒(GMS14014.1.1)，購自Genmed公司。

主要儀器設(shè)備：冷凍精液封裝儀，購自法國卡蘇(IMV)公司；精液品質(zhì)自動分析軟件(CASA)；倒置熒光顯微鏡，購自德國ZEISS公司；紫外分光光度計，為上海尤尼柯(UNIC)公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，購自瑞士TECAN公司。

1.1.2 冷凍稀釋液的配制 冷凍保存Ⅰ液：Tirs 375 mmol/L，檸檬酸124 mmol/L，葡萄糖41 mmol/L，0.275 g/L慶大霉素，嚴(yán)格無菌環(huán)境下添加終體積分?jǐn)?shù)20%的卵黃。

冷凍保存Ⅱ液：在冷凍保存Ⅰ液基礎(chǔ)上分別添加一定體積分?jǐn)?shù)甘油(6%)、乙二醇(3%，6%)、DMSO(3%，6%)、DMA(3%，6%)的冷凍保護(hù)劑即為Ⅱ液。以上百分含量均為體積分?jǐn)?shù)，下同。

1.1.3 其他溶液的配制 羅丹明123溶液(0.53 mmol/L)：0.000 4 g 羅丹明123溶于2 mL DMSO中，0.45 μm 濾膜過濾后避光保存。硫代巴比妥酸溶液(6.7 g/L)：準(zhǔn)確稱取0.67 g 硫代巴比妥酸用超純水溶解，并定容于100 mL容量瓶中備用。

1.2 山羊冷凍精液的制備

1.2.1 精液樣品的采集 試驗(yàn)用山羊精液樣品采自西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能羊原種場，選取6只2～4周歲、健康、繁殖性能正常的西農(nóng)薩能奶山羊種公羊，假陰道法采集精液，原精液做好標(biāo)簽后，400×倒置顯微鏡下鏡檢合格后備用。

1.2.2 精液的第1次稀釋 將采集的精液迅速用等溫冷凍保存Ⅰ液按1∶1體積比稀釋后，置于30 ℃水浴保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室，將精液樣品置5 ℃冰箱中降溫2 h，使精液樣品從30 ℃降到5 ℃，降溫過程中每隔1 h輕輕晃動樣品1次。

1.2.3 精液的第2次稀釋與平衡 取第1次稀釋降溫精液樣品，于5 ℃冰箱中按1 ∶1體積比添加等溫冷凍保存Ⅱ液稀釋，之后于5 ℃冰箱中平衡1 h，精液樣品鏡檢合格后均分為7份。

1.2.4 精液的冷凍 將1.2.3中精液樣品用冷凍精液封裝儀于5 ℃冰箱內(nèi)灌裝于細(xì)管(0.25 mL)，并用封口粉封口。將分裝好的細(xì)管先置于液氮面上方5 cm處4 min，使溫度從5 ℃迅速降到-60 ℃，之后置于液氮表面3 cm處，使溫度從-60 ℃降到-120 ℃，最后投于液氮中，溫度由-120 ℃降到-196 ℃，裝袋編號后貯存于液氮罐中。

1.3 精子品質(zhì)的評定

取凍精細(xì)管投入37 ℃水浴中攪晃15 s解凍，測定以下指標(biāo)。

1.3.1 運(yùn)動參數(shù)評定 將帶有加熱板的顯微鏡預(yù)熱到37 ℃，取10 μL精液樣品于精子品質(zhì)分析儀專用計數(shù)載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，1 min后選取至少3個不同的視野，先通過自動分析軟件(CASA)自動分析精子活率(CM)；再選取至少5個視野計數(shù)，通過肉眼觀測，統(tǒng)計精子表觀活率(Subjective motility,SM)。

1.3.2 頂體完整性檢測 參考文獻(xiàn)[13]的方法，采用Genmed公司提供的HOST低滲膨脹試劑盒進(jìn)行檢測。每個樣品計數(shù)200個精子細(xì)胞。在倒置熒光顯微鏡530 nm熒光激發(fā)下可觀察到以下4種類型的精子：(1)整個頂體均勻分布著明亮綠色熒光，為完整頂體；(2)頂體赤道面均勻分布著明亮綠色熒光，而20%頂體帽端無熒光顯示，為頂體部分破壞精子；(3)只有頂體赤道面呈現(xiàn)綠色熒光，為頂體前帽缺失精子；(4)精子頭部無熒光，為頂體缺失精子。

1.3.3 精子質(zhì)膜完整率檢測 采用Genmed公司提供的HOST低滲膨脹試劑盒檢測，凈凍精細(xì)管在37 ℃水浴條件下攪晃15 s解凍，隨后用等溫的HOST低滲溶液調(diào)整精子密度至1×106mL-1，37 ℃避光孵育30 min后，取10 μL精液樣品于載玻片上，在400×倒置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計精子彎尾率，每個樣品計數(shù)時至少檢測200個精子細(xì)胞。

1.3.4 線粒體完整性檢測 于37 ℃下用冷凍保存Ⅰ液稀釋精液樣品，使精子密度為1×107mL-1，取50 μL稀釋后的精液樣品，分別加入1 μL碘化丙啶和1 μL羅丹明123，避光孵育1 min后置于37 ℃水浴鍋孵育30 min，取10 μL精子于載玻片上，在400×倒置顯微鏡下觀察，死精子在488 nm紫外光激發(fā)下頭部核區(qū)顯紅色，活精子和有線粒體活性的精子頭部不發(fā)光，但線粒體部分呈綠色，每次至少檢測200個精子。

1.3.5 脂質(zhì)氧化程度檢測 取精液樣品1 mL (精子密度為1×108mL-1)與等體積冰冷的三氯乙酸(200 g/L)均勻混合，離心(2 000g10 min)，取上清液1 mL與硫代巴比妥酸溶液等體積混合，水浴(100 ℃ 10 min)，冷卻后用分光光度計在波長534 nm處檢測丙二醛(MDA)濃度，確定脂質(zhì)氧化水平。

1.3.6 谷胱甘肽還原酶活性測定 采用Genmed公司提供的GPX測定試劑盒，參考Wang等[14]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 19.0軟件中的Duncan’s法進(jìn)行方差分析多重比較，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SEM)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊精子冷凍-解凍后形態(tài)觀察及染色結(jié)果

山羊精子冷凍-解凍后形態(tài)觀察及染色結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 HOST低滲溶液中山羊精子質(zhì)膜完整性觀察(400×) A.質(zhì)膜完整精子；B.質(zhì)膜損傷精子 Fig.1 Sperm in hypisotonic solution (400×)A.Sperm with intact plasma membrane；B.Sperm with damaged plasma membrane

精子質(zhì)膜完整程度檢測結(jié)果顯示，正常精子在HOST低滲溶液中尾部彎曲，而質(zhì)膜受損精子在HOST低滲溶液中尾部不彎曲(圖1)。采用FITC-PNA試劑盒對精子頂體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，頂體完整精子頂體分布著均勻明亮綠色熒光，頂體受損精子頂體熒光分布不均勻或無熒光(圖2)。

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)滲透性冷凍保護(hù)劑對山羊精子的冷凍保護(hù)效果

表1表明，甘油(6%)和乙二醇(3%，6%)組冷凍-解凍后的精子表觀活率和活率均極顯著高于其他組(P<0.01)， DMSO(3%，6%)組解凍后精子表觀活率和活率極顯著高于DMA(3%，6%)組(P<0.01)。

表1還表明，在精子線粒體完整性檢測中，乙二醇(3%)、甘油(6%)及DMA(6%)組間差異不顯著(P>0.05)，但均極顯著高于其他組(P<0.01)；DMA(3%)組極顯著高于DMSO(3%，6%)組(P<0.01)，顯著高于乙二醇(6%)組(P<0.05)。

由表1還可知，從精子頂體完整性看，乙二醇(3%)組極顯著高于其他組(P<0.01)；甘油(6%)和乙二醇(6%)組均極顯著高于DMSO(3%，6%)和DMA(3%，6%)組(P<0.01)，而DMSO(6%)組和DMA(3%)組顯著高于DMSO(3%)和DMA(6%)組(P<0.05)。

表1 冷凍保存Ⅱ液中添加不同體積分?jǐn)?shù)滲透性冷凍保護(hù)劑對山羊精子的冷凍保護(hù)效果(n=6)Table 1 Effects of different concentrations of penetrating cryoprotectants on freezing of goat semen (n=6)

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05) while different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

從質(zhì)膜完整率(表1)看，甘油(6%)組極顯著高于其他組(P<0.01)；乙二醇(3%)組顯著高于乙二醇(6%)組(P<0.05)，且兩組極顯著高于DMSO(3%，6%)和DMA(3%，6%)組(P<0.01)；DMSO(3%，6%)組極顯著高于DMA(3%，6%)組(P<0.05)。

谷胱甘肽還原酶活性代表精子細(xì)胞抗氧化能力，其值越高代表抗氧化能力越強(qiáng)。表1表明，從谷胱甘肽還原酶活性看，各組間大多差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，其中乙二醇(3%)組谷胱甘肽還原酶活性最高，表明該處理組精子抗氧化能力最強(qiáng)。

MDA濃度代表精子質(zhì)膜氧化程度，其值越低表明精子氧化程度越低。由表1可見，從MDA濃度看，乙二醇(3%)組極顯著低于其他各組(P<0.01)；乙二醇(6%)組顯著低于甘油(6%)組(P>0.05)，二者均極顯著低于DMSO(3%，6%)組和DMA(3%，6%)組(P<0.01)；其中DMA(6%)組的MDA濃度最高，表明該組精子質(zhì)膜受氧化損傷程度最高。

以上結(jié)果表明，在冷凍保存Ⅱ液中添加甘油和乙二醇，能有效保護(hù)山羊精子免受低溫冷凍損傷，其中乙二醇(3%)組解凍后精子頂體完整性、谷胱甘肽還原酶活性、MDA濃度等指標(biāo)極顯著優(yōu)于其他組(P<0.01)。說明乙二醇(3%)替代甘油作為山羊精液冷凍保護(hù)劑的效果好。DMSO(3%，6%)和DMA(3%，6%)組的各項(xiàng)指標(biāo)均較低，表明DMSO(3%，6%)和DMA(3%，6%)不適宜用作奶山羊冷凍精液冷凍保護(hù)劑。

3 討 論

本研究中，乙二醇能夠提高凍后精子活率、頂體完整性和抗氧化能力，這與劉玉峰等[8]的研究報道一致，而武浩等[15]研究綿羊凍精發(fā)現(xiàn)，甘油具有較好的冷凍保護(hù)效果，這可能是試驗(yàn)所用動物品種以及稀釋液配方不同所致。乙二醇保護(hù)冷凍精子的機(jī)制仍不清楚，但主要原因可能包括以下兩個方面：一方面與甘油的作用機(jī)理相同，乙二醇容易滲透進(jìn)入精子細(xì)胞，降低胞內(nèi)鹽溶質(zhì)濃度從而保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷，也可能是因?yàn)橐叶荚诰蛹?xì)胞內(nèi)外形成了玻璃態(tài)結(jié)晶，有利于精子保存[16]，本研究中乙二醇添加組解凍后精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性等指標(biāo)與甘油處理組相當(dāng)或優(yōu)于甘油組也說明了這一點(diǎn)；另一方面，Silva等[13]研究指出，乙二醇能提高凍精抗氧化應(yīng)激能力，乙二醇進(jìn)入精子細(xì)胞，能夠有效保護(hù)精液具有抗氧化能力的酶和非酶分子，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、維生素C和維生素E、?；撬岷蛠喤；撬岬龋@些物質(zhì)能夠減少或消除山羊精液冷凍過程中產(chǎn)生的對精子不利的活性氧自由基(ROS)[17]，從而保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激損傷，本試驗(yàn)中乙二醇添加組解凍后精子谷胱甘肽還原酶活性較高，而MDA濃度較低等結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)。

本研究中，DMSO(3%，6%)和DMA(3%，6%)組解凍后精子受到了不可逆的損傷，導(dǎo)致精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整率等指標(biāo)均顯著下降，這與Li等[18]的報道一致。DMSO和DMA在山羊精子冷凍過程無法像甘油和乙二醇一樣起到較好的保護(hù)作用，容易使精子遭受低溫?fù)p傷，精子結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，導(dǎo)致精子活率下降[19]。而Kundu等[20]研究指出，DMSO作為滲透性冷凍保護(hù)劑，能防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成從而降低細(xì)胞損傷；此外，有研究發(fā)現(xiàn)，DMSO和DMA在禽類[21]和山羊[22]凍精中使用效果較好。本研究中，DMSO對山羊精子的保護(hù)效果相對優(yōu)于DMA，但仍然不能有效改善凍后精子品質(zhì)。這是因?yàn)?，一方面，冷凍保護(hù)劑會受到稀釋液以及冷凍程序的影響[14]；另一方面，不同物種的精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組成及質(zhì)膜流動性不同，山羊精子細(xì)胞膜富含不飽和脂肪酸[23]，這增加了細(xì)胞膜滲透性，而DMA分子量最小，從而更容易進(jìn)入精子細(xì)胞，而高濃度的DMA對精子有毒性[24]，易造成細(xì)胞滲透壓改變導(dǎo)致精子脫水而死亡[25-26]，這些都是對精子細(xì)胞維持正常生理功能的不利因素。

甘油廣泛用于山羊精子冷凍保護(hù)，添加量一般為4%～7%，高濃度甘油對精子是有毒性的[20]。在常溫下，甘油會損傷精子頂體和頸部，造成尾部彎曲，破壞某些酶類，從而影響受精率[21]。本研究結(jié)果表明，3%乙二醇組的精子頂體完整性、抗氧化能力極顯著優(yōu)于6% 甘油組，精子活率、線粒體完整性無顯著差異，但后者質(zhì)膜完整率卻優(yōu)于前者，這可能是由于精子特殊的生理結(jié)構(gòu)、質(zhì)膜組成不同，造成甘油和乙二醇與精子質(zhì)膜的作用方式不同。研究證明，當(dāng)乙二醇體積分?jǐn)?shù)超過3.9%時會對精子產(chǎn)生毒副作用[14]，而本試驗(yàn)中3% 乙二醇組精子的各項(xiàng)指標(biāo)總體上均優(yōu)于6%乙二醇組，這一方面可能與高濃度乙二醇對精子產(chǎn)生毒副作用有關(guān)，另一方面也可能是高濃度的乙二醇會造成精子細(xì)胞滲透壓改變從而損傷細(xì)胞。

基于冷凍-解凍后精子的各項(xiàng)指標(biāo)，本研究結(jié)果表明甘油(6%)、乙二醇(3%，6%)均對山羊精子具有冷凍保護(hù)作用，其中3% 乙二醇能極大提高解凍后精子頂體完整性和抗氧化能力，能更好地發(fā)揮對山羊精子的抗冷凍保護(hù)作用，因此乙二醇在動物精子乃至生物細(xì)胞的保護(hù)上具有重大研究價值。但有關(guān)乙二醇抗冷凍保護(hù)的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

乙二醇對山羊精子具有較好的冷凍保護(hù)效果，能明顯提高山羊凍精解凍后頂體完整性及谷胱甘肽還原酶活性，降低MDA濃度，冷凍保存Ⅱ液中乙二醇適宜添加量為3%。

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Effects of penetrating cryoprotectants supplementation on semen quality and oxidative stress variables in frozen-thawed dairy goat semen

XI Li-meng,LUO Jun,YANG Di-kun,WANG Wei,SUN Shuang,SHI Huai-ping,MA Xue-yao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study explored the effects of penetrating cryoprotectants including glycerol,ethylene glycerol,dimethyl sulfoxide (DMSO) and dimethyl acetamide (DMA) supplementations on freezing goat spermatozoa.【Method】 Semen samples were collected from 6 healthy,2-4 years old Xinong Saanen dairy goats by artificial vagina method.Semen samples were diluted in Tris-egg yolk with glycerol (6%),ethylene glycerol (3%,6%),DMSO (3%,6%) and DMA (3%,6%) before being frozen at -196 ℃.Then,the effects on semen quality and oxidative stress variables in frozen-thawed dairy goat semen were evaluated through assessing motility,acrosome integrity,plasma membrane integrity,mitochondrial activity,and concentrations of GSH and MDA.【Result】 After thawing,sperm motilities with glycerol (6%) and ethylene glycerol (3%,6%) were greater (P<0.01) than those with DMSO (3%,6%) and DMA (3%,6%).Mitochondrial activities with glycerol (6%) and ethylene glycerol (3%) and DMA(6%) were greater (P<0.01) than others.Plasma membrane integrities with glycerol (6%) and ethylene glycerol (3%,6%) were greater (P<0.01) than others.Acrosome integrity,GSH concentration and MDA concentration with ethylene glycerol (3%) were greater (P<0.01) than others.【Conclusion】 Both glycerol (6%) and ethylene glycerol (3%,6%) could protect goat sperm against freezing.As cryoprotectant supplementation,ethylene glycerol 3% can provide greater protection for goat semen than glycerin.

goat;cryoprotectant;samen;cryopreservation

2014-02-20

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103038)；陜西省重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2009ZKC07-01-1)

席利萌(1989-)，男，陜西商洛人，在讀碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。 E-mail:xlm0223@163.com

羅 軍(1965-)，男，陜西寶雞人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物遺傳育種研究。

時間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.024

S827.3+4

A

1671-9387(2015)08-0027-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.024.html