氯喹對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑凋亡的影響

李松巖，郭敏，王煙，于洋，劉師兵，徐冶

氯喹對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑凋亡的影響

李松巖，郭敏，王煙，于洋，劉師兵，徐冶

目的探討氯喹對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(SMC)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)主動(dòng)脈SMC細(xì)胞，分別加入100、400和800μmol/L H2O2培養(yǎng)12h后，MTT法檢測(cè)SMC細(xì)胞生存率。將細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、氯喹組、H2O2+氯喹組，培養(yǎng)12h后采用MTT法檢測(cè)氯喹阻斷自噬后SMC細(xì)胞的生存率，倒置相差顯微鏡觀察H2O2對(duì)SMC細(xì)胞形態(tài)變化的影響，間接免疫熒光法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，100、400、800μmol/L H2O2作用12h后，SMC細(xì)胞存活率明顯降低，IC50為447.4μmol/L；氯喹阻斷自噬后，SMC細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示，H2O2+氯喹組SMC收縮變圓，細(xì)胞密度明顯下降。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，H2O2與氯喹聯(lián)合作后，SMC細(xì)胞質(zhì)中LC3和p62蛋白表達(dá)均明顯增加，且有明顯共定位現(xiàn)象。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，H2O2與氯喹聯(lián)合作用后，SMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)，凋亡執(zhí)行分子Caspase-3的裂解形式蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。結(jié)論氯喹對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)SMC通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的凋亡具有促進(jìn)作用。

自噬；肌細(xì)胞，平滑??；細(xì)胞凋亡；氯喹；過(guò)氧化氫

目前心血管疾病的發(fā)病率及死亡率居世界首位，其中動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病每年致死人數(shù)超過(guò)1900萬(wàn)，而急性冠脈綜合征(acute coronary syndromes，ACS)是其中導(dǎo)致死亡率最高的疾病之一[1-2]。ACS是由于斑塊不穩(wěn)定及血栓形成導(dǎo)致心肌缺血的臨床綜合征[3]，因此穩(wěn)定斑塊可有效預(yù)防ACS的發(fā)生。研究證實(shí)，不穩(wěn)定斑塊的破裂及血栓形成可能與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的大量凋亡有密切關(guān)系[4]。馮健等[5]研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸可激活細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3激酶/Akt信號(hào)通路，抑制過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)SMC細(xì)胞凋亡。邵麗娟等[6]發(fā)現(xiàn)，普羅布考可以通過(guò)降低細(xì)胞中凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ASK-1)蛋白、增加硫氧還蛋白(Trx-1)的表達(dá)來(lái)抑制H2O2誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞(SMC)凋亡。郭峰等[7]發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸可以升高細(xì)胞中Bcl-2/Bax蛋白比值，減少Fas、FasL蛋白表達(dá)，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的SMC凋亡。由此可見(jiàn)，SMC可能是心血管疾病藥物治療的靶細(xì)胞之一。因此，加深對(duì)H2O2誘導(dǎo)SMC細(xì)胞凋亡的了解，才能有效避免不穩(wěn)定斑塊的破裂及血栓形成。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中新生蛋白質(zhì)折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)以及儲(chǔ)存細(xì)胞內(nèi)鈣離子的場(chǎng)所，新生的蛋白質(zhì)在分子伴侶的協(xié)助下進(jìn)行折疊，只有正確折疊的蛋白質(zhì)才可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)仍留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解機(jī)制逆移至細(xì)胞質(zhì)，并被蛋白酶體降解[8]。葡萄糖和能量的缺乏、病毒感染、鈣離子缺乏及膽固醇聚集等都可能干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，早期或輕微的ERS可通過(guò)一系列的反應(yīng)使機(jī)體恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，避免細(xì)胞凋亡，而過(guò)于嚴(yán)重或時(shí)間較長(zhǎng)的ERS則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。近年來(lái)，心血管疾病中ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡成為研究的重點(diǎn)[10]。本研究觀察了自噬阻斷劑氯喹(CQ)對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)SMC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響，旨在為治療ACS找到新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 β-actin抗體、Beclin-1抗體、CHOP抗體、GRP78抗體、Caspase-3抗體和Activated-Caspase-3抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；新生胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自長(zhǎng)春德?tīng)査?；LC3兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epotomics公司；PVDF膜購(gòu)自Milipore公司；甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、Hoechst33342熒光染料等購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；氯喹、四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethy-2-thiazoly)-2,5-diphenyl-2-tetrazoliumbromide，MTT]購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)，超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hermle公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(日本Leica公司)，水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，脫色搖床(北京六一醫(yī)學(xué)儀器廠)，超聲細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)，高溫高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，Model-680型酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 主動(dòng)脈SMC細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，凍存保存。細(xì)胞加入含20%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，青霉素和鏈霉素濃度均為100U/ml，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。隔2d傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)SMC的細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMC，以5×104/ml密度接種于96孔板，培養(yǎng)12h。實(shí)驗(yàn)組按H2O2濃度分為100、400、800μmol/L組，同時(shí)設(shè)單加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組和不加藥物作用的陰性對(duì)照組，每組設(shè)3～5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12h后，每孔加入MTT 20μl，作用4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10min，用Model-680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(A)值，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。細(xì)胞存活率= (A實(shí)驗(yàn)組－A空白組)/(A對(duì)照組－A空白組)×100%。

1.5 CQ阻斷后SMC細(xì)胞的存活率 采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMC，以5×104/ml密度接種于96孔板，培養(yǎng)12h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、20μmol/L CQ組、400μmol/L H2O2組、400μmol/L H2O2+20μmol/L CQ組，同時(shí)設(shè)單加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組和不加藥物作用的陰性對(duì)照組，每組設(shè)3～5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12h后，每孔加入MTT 20μl，作用4h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10min，用Model-680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司) 在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組－A空白組)/(A對(duì)照組－A空白組)× 100%。

1.6 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×108/L密度接種于24孔板中，每孔500μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，分為20μmol/L CQ組、400μmol/L H2O2組、20μmol/L CQ+400μmol/L H2O2組，同時(shí)設(shè)置未加CQ和H2O2的陰性對(duì)照組。將各組細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮、細(xì)胞密度情況。

1.7 間接免疫熒光法檢測(cè)蛋白表達(dá) 取高壓消毒后無(wú)菌蓋玻片(10mm×10mm)置于24孔板中，將SMC細(xì)胞以1×105/ml密度接種(每孔500μl)過(guò)夜，次日細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)將其分為對(duì)照組、20μmol/L CQ組、400μmol/L H2O2組、20μmol/L CQ+400μmol/L H2O2組，培養(yǎng)8h后棄培養(yǎng)基，加入200μl 4%多聚甲醛固定液作用10min，吸去固定液，經(jīng)0.1% Triton PBS作用5min，0.01mol/L PBS洗滌，非免疫山羊血清封閉30min，加入預(yù)混的LC3抗體(1:250)、p62抗體(1:200)4℃過(guò)夜，0.01mol/L PBS洗滌，加入1:1000稀釋的熒光二抗作用30min，0.01mol/L PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封固。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SMC，分為對(duì)照組、CQ組、H2O2組、CQ+H2O2組，加入藥物作用相應(yīng)時(shí)間后，棄培養(yǎng)液，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，每瓶加入150μl蛋白裂解液RIPA，混勻，采用超聲細(xì)胞粉碎儀破碎細(xì)胞2次，每次3～5s，4℃放置30min，蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞后，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心收集上清液。Bradford法行蛋白定量。SDSPAGE電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5h，PBST洗3次，加入1% BSA稀釋的Beclin-1抗體(1:1000)、LC3抗體(1:500)、GRP78抗體(1:500)、CHOP抗體(1:1000)、Caspase-3抗體(1:500)、Activated-Caspase-3抗體(1:1000)、β-actin抗體(1:1000)，4℃過(guò)夜。次日PBST洗3次，加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，室溫?fù)u床孵育1.5h；PBST洗5次，ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行分析處理。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)SMC細(xì)胞存活率 采用不同濃度H2O2作用主動(dòng)脈SMC細(xì)胞12h后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2對(duì)SMC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性(圖1)，其IC50為447.4μmol/L。

2.2 CQ對(duì)SMC細(xì)胞存活率的影響 主動(dòng)脈SMC細(xì)胞經(jīng)400μmol/L H2O2作用8h后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，采用20μmol/L CQ阻斷自噬后，SMC細(xì)胞存活率明顯降低(圖2)。

圖1 MTT法檢測(cè)SMC細(xì)胞生存率Fig.1 Survival rate of SMCs (MTT)(1)P<0.05,(2)P<0.01 compared with 0μmol/L H2O2; (3)P<0.01 compared with 100μmol/L H2O2; (4)P<0.01 compared with 400μmol/L H2O2

圖2 MTT法檢測(cè)CQ對(duì)SMC細(xì)胞生存率的影響Fig.2 Survival rate of SMCs (MTT)(1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.01 compared with CQ group,(3)P<0.05 compared with H2O2group

2.3 倒置顯微鏡觀察SMC細(xì)胞的生長(zhǎng) 采用400μmol/L H2O2作用SMC細(xì)胞8h后，倒置顯微鏡觀察顯示，與單獨(dú)H2O2組相比，CQ+H2O2組細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞密度明顯下降(圖3)。

2.4 間接免疫熒光法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白P62和LC3的共定位 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，20μmol/L CQ作用SMC 8h后可見(jiàn)LC3(FITC標(biāo)記)與P62(Rodamini標(biāo)記)蛋白散在分布；400μmol/L H2O2作用SMC 8h后可見(jiàn)LC3(FITC標(biāo)記)與P62(Rodamini標(biāo)記)蛋白均呈散在分布，且熒光強(qiáng)度增加的同時(shí)呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集；CQ+H2O2組可見(jiàn)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)且有明顯共定位(圖4)。

2.5 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，400μmol/L H2O2作用SMC細(xì)胞8h后，Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05或P<0.01)，CQ與H2O2聯(lián)合應(yīng)用組Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，且Caspase-3活化剪切片段表達(dá)明顯增高(P<0.05或P<0.01，圖5)。

圖3 光鏡觀察CQ阻斷自噬后H2O2對(duì)SMC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響Fig.3 H2O2-induced growth inhibition of SMCs after interrupting autophagy by CQ (×250) A. Control; B. 20μmol/L CQ for 8h; C. 400μmol/L H2O2for 8h; D. 20μmol/L CQ and 400μmol/L H2O2for 8h

圖4 共聚焦顯微鏡觀察CQ對(duì)H2O2誘導(dǎo)SMC細(xì)胞LC3和p62蛋白共定位的影響(LSC顯微鏡×1800)Fig.4 Effect of CQ on H2O2-induced p62 and LC3 protein co-localization in SMCs (LSC microscopy ×1800)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，H2O2作用后SMC細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞密度下降，CQ 與H2O2聯(lián)合作用后，SMC細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低。

細(xì)胞凋亡也稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡，誘導(dǎo)凋亡的途徑包括死亡受體途徑和線(xiàn)粒體途徑，目前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)引起的細(xì)胞凋亡逐漸被認(rèn)識(shí)。研究證實(shí)，ERS在許多系統(tǒng)疾病如神經(jīng)變性疾病、糖尿病、腎臟疾病及腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色[11-13]。近年來(lái)，ERS在心血管疾病中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為了研究的重點(diǎn)。Kim等[14]報(bào)道，在心力衰竭、心肌缺血、心肌肥厚及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中都有ERS的參與。Lim 等[15]報(bào)道，ERS與A型清道夫受體共同作用促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。Werstuck等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及SMC，同型半胱氨酸誘導(dǎo)的ERS中，與膽固醇和甘油三酯生物合成和攝取的相關(guān)基因表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集。

圖5 Western blotting法檢測(cè)CQ與H2O2作用后SMC中相關(guān)蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Fig.5 Effects of CQ and H2O2on the protein expressions in SMCs (Western blotting,±s,n=3)A. Western blotting; B. The relative value; (1)P<0.05,(2)P<0.01 compared with control group; (3)P<0.05,(4)P<0.01 compared with CQ group; (5)P<0.05 compared with CQ+H2O2group

血管平滑肌自噬可抑制血管平滑肌的增殖，在延緩動(dòng)脈硬化病情的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，H2O2可以誘導(dǎo)SMC自噬，并可誘導(dǎo)SMC通過(guò)ESR途徑發(fā)生凋亡。H2O2可以引起SMC氧化應(yīng)激的發(fā)生，而氧化應(yīng)激可通過(guò)不同的信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡和自噬的發(fā)生[16]。自噬是哺乳動(dòng)物中高度保守的清除、降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)生物大分子及受損細(xì)胞器的重要代謝通路，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要作用[17]。本研究通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到，與對(duì)照組相比，CQ組、H2O2組、CQ+H2O2組LC3和P62蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，并且CQ+H2O2組LC3和P62蛋白有明顯共定位現(xiàn)象。而Western blotting結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H2O2組SMC細(xì)胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)增強(qiáng)，表明SMC中自噬被活化。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)水平反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的強(qiáng)弱[18]。與對(duì)照組相比，GRP78蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明SMC中存在ESR。當(dāng)ESR變得更加嚴(yán)重時(shí)，將促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一轉(zhuǎn)化的決定性因子是CHOP[19]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生ESR時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上的procaspase-12發(fā)生剪切，使之活化為caspase-12并釋放入細(xì)胞質(zhì)，caspase-12激活caspase-9，活化的caspase-9裂解caspase-3致使細(xì)胞凋亡。Western blotting結(jié)果顯示，CQ+H2O2組CHOP蛋白與cleaved caspase-3蛋白表達(dá)最強(qiáng)，表明CQ可能通過(guò)阻斷自噬，導(dǎo)致細(xì)胞ESR增強(qiáng)，從而使SMC凋亡。

綜上所述，H2O2能誘導(dǎo)SMC自噬和ESR的產(chǎn)生，CQ阻斷自噬后，使ESR增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。血管平滑肌的凋亡可導(dǎo)致AS斑塊帽的破裂，促進(jìn)AS進(jìn)程，而自噬可以抑制AS斑塊的發(fā)展[20]。但是，是否可以通過(guò)控制自噬的發(fā)生和發(fā)展來(lái)控制AS斑塊的發(fā)展，最終達(dá)到治療動(dòng)脈硬化的目的，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effect of chloroquine on hydrogen peroxide-induced apoptosis of smooth muscle cellsviaendoplasmic reticulum stress pathway

LI Song-yan1,GUO Min2,WANG Yan1,YU Yang1,LIU Shi-bing1,XU Ye1*1Medical Research Laboratory,Jilin Medical College,Jilin,Jilin Province 132013,China
2Department of Vasculocardiology,Affiliated Hospital of Jilin Medical College,Jilin,Jilin Province 132013,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: xuye_9707@163.com

,E-mail: xuye_9707@163.com
This work was supported by the Youth Scientific Research Project of Health Department of Jilin Province (2013Q015),and the "Twelfth Five-Year Plan" Science and Technology Research Projects of Education Department of Jilin Province (2013316)

ObjectiveTo investigate the effect of chloroquine (CQ) on hydrogen peroxide-induced apoptosis of smooth muscle cells (SMCs)viaendoplasmic reticulum (ER) stress pathway.MethodsThe SMCs were culturedin vitro. They were incubated respectively with 100,400 and 800μmol/L of H2O2for 12h. Cell survival rate was determined with MTT assay. To observe the time course of autophagy induced by cisplatin treatment,four experimental groups were set up,namely control group,H2O2group,CQ group and H2O2+CQ group. Cell survival rate after autophagy interruption was determined by MTT assay. Inverted phase contrast microscopy was used to observe the effects of H2O2on morphological changes in SMCs'. The expressions of autophagy related protein p62 and LC3 were detected by indirect immunofluorescence. The expressions of beclin-1,LC3,GRP78,CHOP,caspase-3 and cleaved caspase-3 were assayed by Western blotting.ResultsAfter treatment with 100-800μmol/L of H2O2for 12h,the proliferation of SMCs was markedly inhibited,the IC50value was 447.4μmol/L. The survival rate of SMCs was lowered obviously after autophagy interruption by CQ (P<0.05). It was found by inverted microscopy that the SMCs in H2O2+CQ group shrank and became rounded,and the cell density decreased significantly. It was found by laser scanning confocal microscopy that the expressions increased obviously of LC3 and p62 proteins in SMCs of H2O2+CQ group,and an obvious phenomenon of co-localization was observed. Western blotting demonstrated that the expressions of both ERs related proteins GRP78,CHOP and autophagy related proteins Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3 I increased obviously (P<0.05,P<0.01) in H2O2+CQ group,and the expression of lytic form apoptotic molecule of caspase-3 protein was significantly increased (P<0.01).ConclusionChloroquine could induce apoptosis of smoothcellsviaER stress pathway induced by hydrogen peroxide.

autophagy; myocytes,smooth muscle; apoptosis; chloroquine; hydrogen peroxide

R361.3；R285.5

A

0577-7402(2015)12-0960-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.05

2015-05-19；

2015-08-12)

(責(zé)任編輯：張小利)

吉林省衛(wèi)生青年科研課題(2013Q015)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究課題(2013361)

李松巖，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生。主要從事獸醫(yī)學(xué)的預(yù)防工作

132013 吉林省吉林市 吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室(李松巖、王煙、于洋、劉師兵、徐冶)；132013 吉林省吉林市吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(郭敏)

徐冶，E-mail：xuye_9707@163.com