聚凝胺增強Ror2重組腺病毒感染K562細胞效應的研究

高愛君，司維柯，趙宸，吳韋銣

聚凝胺增強Ror2重組腺病毒感染K562細胞效應的研究

高愛君，司維柯，趙宸，吳韋銣

目的探索應用聚凝胺(polybrene)試劑增強Ror2重組腺病毒對K562細胞轉染效率的技術。方法在K562細胞中分別加入0～12μl Ror2重組腺病毒，摸索最佳重組腺病毒用量；同時加入0～5μg/ml polybrene和最佳重組腺病毒用量，培養(yǎng)1～3d后，在熒光顯微鏡下計數，對比加入polybrene前后被感染的細胞數。臺盼藍染色觀察重組腺病毒引起K562細胞死亡的情況。采用RT-PCR和Western blotting檢測Ror2基因的表達情況。結果Polybrene濃度為3μg/ml和重組腺病毒8μl時，感染效果最佳，對細胞生長影響較小，實驗組感染效果是對照組的17倍；加入polybrene后，外源性Ror2 mRNA和蛋白表達水平均明顯增高。結論Polybrene能顯著增強重組腺病毒感染K562細胞的作用，并能高效表達外源性Ror2基因，該法簡便、價廉、有效，是血液疾病分子生物學研究的一個良好策略。

聚凝胺；腺病毒科；K562細胞；基因，ror2

我們的前期研究發(fā)現，在慢性粒細胞白血病細胞株K562中，Ror2可能是一種白血病抑制受體，但它在K562細胞中發(fā)揮的作用及具體機制尚不明確[1]，目前國內外也未見相應報道。要開展這方面的研究，首先需要將Ror2基因導入K562細胞。目前導入基因的方法主要有生物學方法、化學方法和物理方法。相比之下，生物學方法對細胞損傷小，導入效率高，被廣泛采用。生物學方法通常采用病毒作為基因載體，如反轉錄病毒、慢病毒和腺病毒載體。慢病毒和反轉錄病毒導入的基因可整合到細胞的基因組序列中，所以有潛在致病風險，且導入細胞的拷貝數不高，基因表達變化不明顯，且不易感染終末期或增殖慢的細胞，制備也相對煩瑣。腺病毒載體因相對穩(wěn)定，感染滴度較高，能轉染非增殖細胞，成為廣泛使用的轉基因工具。但在實際應用中，我們發(fā)現對一些懸浮細胞(如白血病細胞)，它的感染率較低。

多聚陽離子聚合物1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)可作為輔助試劑中和細胞和病毒顆粒表面的唾液酸，消除靜電排斥，促進兩者間的相互作用，從而提高重組腺病毒的感染效率。本文探討polybrene的最佳用量，與病毒的最佳配比劑量以及作用時間，使其能增強Ror2重組腺病毒感染K562細胞的效率，且不影響細胞生長狀態(tài)，而且導入Ror2的基因可高效表達具有生物活性的Ror2蛋白，旨在為Ror2與白血病發(fā)生關系及其機制的研究奠定基礎，為血液疾病的基因研究提供價廉物美、簡便快速的技術和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，Tripure試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)，PCR試劑盒(美國Roche公司)，Ror2抗體(美國Cell Signaling公司)，HRP標記羊抗兔lgG、HRP標記羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術公司)，增強化學發(fā)光顯色試劑盒(美國Invitrogen公司)，DMSO、polybrene(美國Sigma公司)。polybrene工作液(1mg/ml)配制：0.1g polybrene溶解于100ml PBS溶液中，充分混勻，置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 重組腺病毒和細胞來源 重組Ror2腺病毒由美國芝加哥大學醫(yī)學中心，分子腫瘤研究室何通川教授惠贈。K562細胞來自本實驗室保存，置于含5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 重組腺病毒最佳用量的細胞實驗 在24孔板中加入1ml DMEM高糖培養(yǎng)基和1×105個培養(yǎng)狀態(tài)良好的K562細胞懸液，分別加入0～12μl的重組Ror2腺病毒，培養(yǎng)2d后，熒光倒置顯微鏡下計數5個高倍視野(5HP)中被感染的細胞數；并加入0.4%臺盼藍100μl，使臺盼藍終濃度為0.04%，立即于牛鮑氏計數板中計數，3min內完成，顯微鏡下著藍色的細胞數即為死亡細胞數(個/ml)。每次實驗重復3次，每組設3個復孔，取平均值。分別以熒光細胞數(個/5HP) 為縱坐標，重組腺病毒用量(μl)作為橫坐標作圖；以死亡細胞數作為縱坐標，腺病毒用量(μl)作為橫坐標作圖。最佳重組腺病毒用量定義為：熒光細胞數最多、細胞死亡數最少所對應的病毒用量。

1.4 Polybrene最佳濃度的確定 在6孔板中分別加入3ml DMEM高糖培養(yǎng)基和1×105個生長狀態(tài)良好的K562細胞懸液，加入前述實驗確定的最佳重組Ror2腺病毒用量，再分別加入1mg/ml polybrene工作液0～15μl，使終濃度為0～5μg/ml，每組需設3個復孔，培養(yǎng)2d后，分別計數5個高倍視野下被感染的細胞總數(個/5HP)，每個實驗需重復3次，取平均值。以熒光細胞數對polybrene最佳濃度(μg/ml)作坐標圖。以熒光細胞數最多所對應的polybrene終濃度為最佳濃度。

1.5 Polybrene最佳作用時間的確定 在6孔板中分別加入3ml DMEM高糖培養(yǎng)基和1×105個生長狀態(tài)良好的K562細胞懸液，加入以上實驗確定的最佳重組Ror2腺病毒用量和最佳polybrene用量作為實驗組，只加入最佳重組Ror2腺病毒用量作為對照組，培養(yǎng)1～3d后，分別計數5個高倍視野下被感染的細胞總數(個/5HP)，每個實驗需重復3次，取平均值。以熒光細胞數對polybrene最佳作用時間(d)做坐標圖。以熒光細胞數最多所對應時間為最佳作用時間。

1.6 外源性Ror2基因表達的鑒定

1.6.1 RT-PCR檢測K562細胞中Ror2 mRNA的表達聯用polybrene和重組腺病毒作為實驗組，單用Ror2重組腺病毒作為對照組，分別感染細胞2d后，RT-PCR檢測K562細胞中采用Tripure RNA 分離試劑提取細胞總RNA，測定RNA 的A260/A280值并計算濃度，參照RT-PCR試劑盒說明書加入1μg總RNA，建立20μl RT反應體系。PCR反應體系25μl，Ror2上游引物：5'-CTCATGATCGAGTGCTGGAA-3'，下物引物：5'-CGTTGCTCACATTGCTCACT-3'，擴增產物274bp；GAPDH上游引物：5'-CATCACCATCTTCC AGGAGCG-3'，下游引物：5'-TGACCTTGCCCACAG CCTTG-3'，擴增產物443bp。擴增條件：94℃ 預變性5min；94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共循環(huán)38次；72℃ 延伸7min，最后取20μl擴增產物于1.6%瓊脂凝膠電泳并照相和圖像處理。

1.6.2 Western blotting檢測Ror2蛋白的表達 將聯用polybrene和重組腺病毒處理作為實驗組，單用Ror2重組腺病毒作為對照組。感染細胞2d后，加入總蛋白裂解液(RIPA裂解液)，冰上裂解30min，4℃，12 000×g離心10min，收集上清，用BCA法測量蛋白濃度。將定量后的蛋白以每個上樣孔50μg上樣，于10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，半干法電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉，室溫封閉1h，TBST 洗膜后，加1:1000稀釋的Ror2一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST洗去一抗后，加入1:2000稀釋的HRP標記山羊抗兔二抗，室溫搖床孵育1～2h，TBST洗膜后，用增強型化學發(fā)光試劑顯色，凝膠成像儀暗室顯影。

1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，兩樣本間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 重組腺病毒最佳用量的確定 每孔加入2～8μl重組腺病毒時，隨著用量的增加， 熒光細胞數逐漸增多，當加入8μl時，與不加重組腺病毒的對照組相比明顯增多(P<0.05)；與8μl組相比，加入10μl組差異無統計學意義(P>0.05)；當大于10μl時，熒光細胞數明顯降低，因此8μl重組腺病毒感染細胞最多(圖1)。臺盼藍染色結果顯示：重組腺病毒用量為1～8μl時均未引起細胞死亡，但9μl以上的濃度可使細胞死亡數目明顯增加，達1×104(個/ml)，與不加重組腺病毒的對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，提示病毒用量不宜大于8μl(圖2)。最終結果表明：8μl為重組腺病毒的最佳用量，此時感染細胞最多，且無細胞死亡。

圖1 重組腺病毒最佳用量確定(熒光顯微鏡)Fig. 1 The optimal dosage of recombinant adenovirus infection (Fluorescence microscopy)(1)P<0.05 compared with control group without recombinant adenovirus

圖2 重組腺病毒對細胞死亡的影響(臺盼藍染色法)Fig. 2 Effect of recombinant adenovirus on cell death (Trypan blue staining)(1)P<0.05 compared with control group without recombinant adenovirus

2.2 增強重組腺病毒感染K 5 6 2細胞的最佳polybrene作用濃度 未加polybrene的重組腺病毒感染效率較低，加入polybrene，被感染細胞明顯增多(圖3)。隨著polybrene濃度增加，感染細胞數逐漸增加。當polybrene終濃度增加到3μg/ml后，感染細胞數達260個/5HP，是polybrene對照組(15個/5HP)的17倍(P<0.01)，是polybrene處理組(2μg/ml)的1.2倍(P<0.05)。而polybrene濃度增加到4μg/ml時，感染細胞數略有下降，但差異無統計學意義(P>0.05，圖4)。

圖3 Polybrene 增強重組腺病毒感染K562細胞(×200)Fig. 3 The infection efficiency of recombinant adenovirus was enhanced by polybrene (×200)The morphology of K562 cells treated without polybrene under fluorescence microscope(A,B) and those with polybrene (C,D)

圖4 Polybrene增強重組腺病毒感染的最適濃度Fig. 4 The optimal concentration of polybrene that enhances the infection efficiency of recombinant adenovirus(1)P<0.01 compared with the control group without polybrene; (2)P<0.05 compared with 2μg/ml polybrene treated group

2.3 Polybrene增強重組腺病毒感染K562細胞最佳作用時間的確定 polybrene作用第1天，感染細胞數為260個/5HP，第2天為325個/5HP，第2天感染細胞數是第1天的1.25倍(P<0.05)。第3天感染細胞數下降為62個/5HP，第2天感染細胞數目是第3天的5.24倍(P<0.05，圖5)。所以選擇polybrene感染2d作為最佳作用時間。

2.4 Polybrene增強重組腺病毒導入Ror2基因mRNA及蛋白表達檢測 最佳polybrene終濃度為3μg/ml和最佳的腺病毒8μl感染K562細胞2d后，分別提取Ror2的mRNA和蛋白行RT-PCR和Western blotting檢測，結果顯示，與對照組相比，實驗組Ror2 的mRNA和蛋白表達水平均明顯增加(圖6)。

3 討 論

Ror2是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2，屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶(RTK)家族成員，是一類膜受體，它在多種腫瘤中的作用已有報道，如在骨肉瘤[2]、腎細胞癌[3]、黑色素瘤[3-4]中高表達，其作用類似癌基因。而在部分腫瘤中，Ror2卻具有抑癌作用，如在鼻咽癌、胃癌[4]、肝癌[5]中表達下調。Ror2在白血病中的研究尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現，Wnt5a是一種白血病抑制因子[6-7]，它可上調Ror2，且可優(yōu)勢性結合Ror2受體而不是LRP6受體，進而轉導Wnt5a/Ror2非經典信號通路，抑制Wnt/β-catenin通路(即Wnt經典通路)，從而發(fā)揮抑癌作用[8]。近來報道認為，Wnt5a發(fā)揮何種生物學功能，如抑癌或促癌，與其結合何種受體有關，即所謂的受體途徑，與細胞類型有關。本課題組的預實驗還發(fā)現過表達外源性Ror2比過表達Wnt5a有更強的抑制K562細胞增殖作用，如前者誘導細胞凋亡，而后者沒有凋亡發(fā)生。這個問題引發(fā)了研究“Ror2與白血病關系”的興趣，而將Ror2基因導入白血病細胞，制作過表達Ror2白血病細胞模型是研究的關鍵。導入基因常用的方法有脂質體法、電轉法和病毒載體感染法，其中病毒感染法對細胞損傷小、導入基因效率高[9]，故病毒載體是目前應用最廣泛的轉基因載體，如反轉錄病毒，慢病毒和重組腺病毒載體，選用何種病毒載體常取決于細胞種類和病毒特性。重組腺病毒載體與反轉錄和慢病毒相比具有以下優(yōu)勢：①宿主范圍廣，對人致病性低；②在增殖與非增殖細胞中均可感染和表達基因；③能有效地增殖并且滴度高，且能在懸浮培養(yǎng)液中擴增；④與人類基因同源性高；⑤不整合到染色體中，無插入致突變風險，安全性較好?；谝陨蟽?yōu)點，我們選擇了重組腺病毒轉基因技術。實驗為解決病毒感染血液細胞效率不高這一血液腫瘤研究領域共同面臨的技術難題[10-11]，我們曾用反轉錄病毒制作穩(wěn)定表達Ror2的K562細胞株，但細胞株增殖減慢甚至難以存活。

圖5 Polybrene增強重組腺病毒感染的最佳時間Fig. 5 The optimal time of recombinant adenovirus infection enhanced by polybrene(1)P<0.05 compared with the first day; (2)P<0.05 compared with the third day

圖6 polybrene增強Ror2 mRNA和蛋白水平的表達Fig. 6 mRNA and protein expression of Ror2 was enhanced by polybreneA. RT-PCR; B. Western blotting; 1. Polybrene(+); 2. Polybrene(-)

Polybrene是一種多聚陽離子聚合物，最早應用在交叉配血中，因為其可中和紅細胞表面唾液酸所帶的負電荷，使紅細胞表面Zeta電位降低，細胞易發(fā)生凝集，減少了交叉配血假陽性，有助于避免輸血反應的發(fā)生[12]。有報道認為病毒顆粒和被感染細胞表面帶有相同的負電荷，排斥作用使病毒難導入基因[13]。采用polybrene中和細胞表面和病毒顆粒上唾液酸的電荷，消除排斥作用，即可增強病毒的轉染效率[14-18]。本課題組曾采用polybrene輔助重組腺病毒感染間充質干細胞，大大提高了轉入外源性基因的效率，簡便而高效地開展了骨再生分子生物學方面的研究[15]。本研究將該技術應用于難轉染的血液細胞，在血液疾病分子生物學研究領域具有更重要的應用價值。

本課題探討了polybrene作為輔助試劑，增強Ror2重組腺病毒感染K562細胞的作用，并摸索了它與重組腺病毒的最佳搭配濃度，最佳作用時間以及對細胞死亡的影響，并檢測導入目的基因Ror2在mRNA和蛋白表達水平的變化。研究結果表明，8μl重組腺病毒和 3μg/ml polybrene濃度，對于1×105個K562細胞是最佳的用量和最佳的組合，最佳作用時間是2d。應用polybrene后，感染細胞數是對照的17倍，表明polybrene明顯促進了重組腺病毒感染細胞的效率，且在一定的濃度范圍內有劑量依賴性。3μg/ml polybrene是輔助重組腺病毒感染細胞的最佳、最安全的劑量。采用RT-PCR和Western blotting分別檢測了在最佳重組腺病毒用量、最佳polybrene濃度和最佳感染時間下，Ror2在mRNA和蛋白水平表達均增高，表明polybrene增強了Ror2基因的導入。

綜上，polybrene能安全有效地增強重組腺病毒的感染效果，并高效導入目的基因Ror2。polybrene價廉、安全，是一種良好的導入外源性基因的輔助試劑，研究結果較好地解決了白血病細胞等難感染細胞的基因導入難題，為血液腫瘤基因的研究打下了良好的基礎。

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Polybrene enhances infection effect of Ror2 recombinant adenovirus on K562 cells

GAO Ai-jun,SI Wei-ke*,ZHAO Chen,WU Wei-ru
Department of Clinical Hematology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: weikesi2004@hotmail.com

,E-mail: weikesi2004@hotmail.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81370624)

ObjectiveTo explore a new technique to enhance the efficiency of Ror2 recombinant adenovirus infecting K562 cell line with polybrene.MethodsRecombinant adenovirus Ror2 (AdRor2,0-12μl) was added to K562 cells to look for the optimal dose of recombinant adenovirus. At the same time,polybrene (0-5μg/ml) and optimal dose of recombinant adenovirus were added to K562 cells. The infected cells were counted under fluorescence microscope after they were cultured 1-3 days,and the comparative study was performed between cells treated and not treated by polybrene. The influence of AdRor2 on the death of cells was investigated by trypan blue staining,and the expression of Ror2 gene was assessed with Western blotting and RTPCR.ResultsIt was found that the infection effect was optimal when the concentration of polybrene was 3μg/ml and the recombinant adenovirus was 8μl,and there was little effect on the cell growth. mRNA and protein expression of exogenous Ror2 were significantly elevated.ConclusionsPolybrene can significantly enhance the infection capability of recombinant adenovirus on K562 cells,and it can also effectively express the exogenous Ror2 gene. This technique is simple,inexpensive and effective,thus providing a good strategy for molecular biology research in the field of blood diseases.

polybrene; adenoviridae; K562 cells; genes,ror2

R331.1；R34；R-331

A

0577-7402(2015)12-0976-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.08

2015-07-20；

2015-10-27)

(責任編輯：沈寧)

國家自然科學基金面上項目(81370624)

高愛君，碩士研究生。主要從事白血病抑癌基因方面的研究

400038 重慶 第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院臨床血液學教研室(高愛君、司維柯、趙宸、吳韋銣)

司維柯，E-mail：weikesi2004@hotmail.com