中國特產(chǎn)2種瀕危水韭雄性發(fā)育的比較研究

李曉東，譚桂娟，李小溪，劉保東＊

（1哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150025；2北京吉鼎立達(dá)生物科技有限公司，北京101105）

中國特產(chǎn)2種瀕危水韭雄性發(fā)育的比較研究

李曉東1，譚桂娟2，李小溪1，劉保東1＊

（1哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150025；2北京吉鼎立達(dá)生物科技有限公司，北京101105）

采用透射電鏡和光鏡比較觀察了中華水韭和云貴水韭雄配子體及其精子的發(fā)育特征。結(jié)果顯示：（1）2種水韭的雄配子體的壽命只有15～30d，終生都在小孢子壁內(nèi)發(fā)育。（2）雄配子體只含有1個原葉體細(xì)胞、1個精子器壁細(xì)胞和4個精細(xì)胞，前2個細(xì)胞內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。（3）精子由精核、微管帶、鞭毛、細(xì)胞質(zhì)等4部分構(gòu)成。（4）中華水韭雄配子體發(fā)生率為4.5%，平均每個雄配子體產(chǎn)生0.46個精子，精子游動速度約53μm／s，壽命8min；云貴水韭雄配子體發(fā)生率和產(chǎn)精量略高于中華水韭，但精子游動速度和壽命略低于中華水韭。研究認(rèn)為，中國水韭瀕危的主要原因之一是雄配子體產(chǎn)精率低、受到生殖生態(tài)限制、水污染對精子的危害等；雄性特征表明水韭在石松類中占有較高的進(jìn)化地位；結(jié)合前人的研究成果繪出了水韭雄配子體的發(fā)育模式。

中華水韭；云貴水韭；雄配子體；精子

水韭科（Isoetaceae）植物都是水生或半水生的古老維管植物，全世界約有200多種，零散分布在北半球，多是珍稀瀕危物種，起源和分布中心尚不明確［1］。水韭配子體雌雄異株，都在孢子壁內(nèi)發(fā)育，個體極其微小，能受到孢子壁的良好保護［2］。成熟的雄配子體一般近球形，直徑只有30μm左右，只產(chǎn)生4個螺旋狀、具鞭毛、無任何保護結(jié)構(gòu)的游動精子，精子必須游進(jìn)雌配子體的頸卵器才可能完成受精［3］，棲息地的水體環(huán)境變化直接影響著水韭的生殖。中華水韭（Isoetes sinensis）和云貴水韭（I.yunguiensis）都有數(shù)億年演化歷史，是研究中國東西部地區(qū)古生態(tài)及其植物系統(tǒng)演化的活化石［4］，由于不適應(yīng)當(dāng)代生態(tài)環(huán)境的變化，種群數(shù)量逐年銳減，都被列為國家一級重點保護植物［5］。前者為四倍體，只分布在長江中下游海拔較低、經(jīng)濟發(fā)達(dá)的地區(qū)，生境破壞較為嚴(yán)重，居群幾近消失；后者為二倍體，只分布在云貴高原，生境穩(wěn)定，瀕危程度相對較低［6］，是研究中國水韭瀕危機制的典型材料。

生殖結(jié)構(gòu)決定著生殖功能，比較研究2種水韭雄配子體及其精子的發(fā)育規(guī)律和精細(xì)結(jié)構(gòu)，有助于掌握中國水韭科植物的生殖生物學(xué)規(guī)律，揭示生殖結(jié)構(gòu)所造成的瀕危原因。而且生殖器官特征既是分子系統(tǒng)需要的溯祖形態(tài)，也是經(jīng)典分類的重要依據(jù)［7］。目前對蕨類植物配子體發(fā)育及精子的研究已經(jīng)相當(dāng)深入［8］，至少有百余屬近千種配子體的顯微、亞顯微結(jié)構(gòu)特征都有資料可查，尤其近年來，卵細(xì)胞受精孔的研究愈加深入，又為蕨類生殖發(fā)育、系統(tǒng)分類等研究拓展了新的思路［9］，木賊屬（Equisetum）［10］、水蕨屬（Ceratopteris）［11］等各大類群的精子結(jié)構(gòu)也有大量報道，曹建國對傅氏鳳尾蕨（Pteris fauriei）［12］和粗莖鱗毛蕨（Dryopteris crassirhizoma）［13］精子的發(fā)育過程和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，為相關(guān)類群的生殖生物學(xué)和系統(tǒng)分類研究提供了有力支持或重要依據(jù)。相對而言，石松類（Lycophyte）生殖結(jié)構(gòu)的研究還很薄弱，僅在5個屬的少數(shù)種，有過一些關(guān)于雄配子體和精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的報道［3，14－18］，如石松屬（Lycopodium）［14］、卷柏屬（Selaginella）［15，18］的精子均為2條鞭毛，水韭屬約有20條鞭毛［3］。水韭屬材料珍稀、培養(yǎng)困難，尤其是雄配子體終生都在堅硬的小孢子壁內(nèi)發(fā)育，超微結(jié)構(gòu)研究成果尤顯匱乏，目前只報道過寬葉水韭（I.japonica）［19］和I.bolanderi［3］的精子形態(tài)特征，而且前者只是大致的形態(tài)掃描，未涉及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，后者缺少發(fā)育過程。

就中華水韭和云貴水韭的生殖結(jié)構(gòu)而言，目前只有路靖等用光鏡細(xì)致觀察了前者雌配子體的發(fā)育特征，發(fā)現(xiàn)了一些雌性生殖結(jié)構(gòu)的瀕危原因，為系統(tǒng)演化提供了保守而穩(wěn)定的新證據(jù)［20］，但2種水韭的雄配子體發(fā)育及其精子特征都無文獻(xiàn)可查。本研究成功地培養(yǎng)了2種水韭的小孢子，首次在獲得足量供試材料的基礎(chǔ)上，以透射電鏡為主，比較觀察了雄配子體及其精子的發(fā)育特征，為揭示中國水韭生殖生物學(xué)規(guī)律特別是雄性生殖的瀕危機制，積累了直觀詳實的資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

中華水韭由浙江大學(xué)丁炳揚教授于2000年5月采自浙江省天臺縣華頂山，云貴水韭由昆明植物研究所成曉教授于2011年10月日采自貴州省平壩，憑證標(biāo)本都保存在哈爾濱師范大學(xué)植物標(biāo)本室（HANU）。供試小孢子采自人工繁殖的第二代成熟植株，成熟植株栽培在哈爾濱師范大學(xué)溫室（45° 52′06″N，126°32′59″E）。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)方法 自健康植株摘下成熟小孢子囊，無菌水清洗后置陰涼干燥處晾干，及時培養(yǎng)或4℃保存重復(fù)培養(yǎng)。取適量小孢子置于5%NaClO水溶液中消毒4min后，經(jīng)多次3 000r／min離心水洗，播種于改良的1／2MS瓊脂培養(yǎng)基中。溫度22～25℃，濕度80%～90%，避光培養(yǎng)。

1.2.2 光鏡觀察法 用Olympus－BX53F顯微鏡及目鏡測微尺檢查統(tǒng)計精子在單位時間內(nèi)的游動距離。待游動精子數(shù)量不再增加后，用吸耳球吹氣加速晾干，Noland染色，統(tǒng)計精子數(shù)、未開裂小孢子數(shù)、開裂小孢子（雄配子體）數(shù)。文中數(shù)據(jù)均為隨機測得10個數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.3 透射電鏡觀察法 取不同發(fā)育時期的培養(yǎng)材料，于0.1mol／L、pH 7.4磷酸緩沖液配制的2.5%戊二醛中抽氣固定6h，1 500r／min離心1 min，棄上清液，用0.1mol／L、pH 7.4磷酸緩沖液沖洗3次，2%鋨酸后固定1h，30%～100%系列酒精、丙酮脫水各15min，梯度環(huán)氧樹脂滲透、包埋；切片厚度50nm；檸檬酸鉛和醋酸鈾染色，Tecnal g2型透射電鏡觀察并拍照。

2 觀察結(jié)果

2.1 中華水韭雄配子體及其精子發(fā)育

成熟小孢子的周壁和外壁之間可觀察到較大縫隙，外壁、內(nèi)壁和原生質(zhì)團之間貼合緊密，并凝集成芽孢狀偏向小孢子的一側(cè)，體積占小孢子的1／2強，原生質(zhì)成分主要是油滴和蛋白質(zhì)，無淀粉粒（圖版Ⅰ，1）。培養(yǎng)3d后，孢子壁首先吸漲，裂縫隆起，外壁濕潤膨脹（圖版Ⅰ，2），其后，原生質(zhì)團逐漸充滿周壁內(nèi)全部空間，油滴和蛋白質(zhì)增多（圖版Ⅰ，3）。

培養(yǎng)5～15d，小孢子首先進(jìn)行第一次細(xì)胞分裂進(jìn)入雄配子體階段，初期的雄配子體只包括1個原葉體細(xì)胞和1個精子器原始細(xì)胞，其后，原葉體細(xì)胞不再分裂，而且體積相對較小，與Cochran對Isoetes bolanderi的研究結(jié)果［3］基本相似。精子器原始細(xì)胞再分裂一次，形成1個精子器壁細(xì)胞和1個初生精細(xì)胞，初生精細(xì)胞分裂兩次，形成4個精細(xì)胞（圖版Ⅰ，4），每個精細(xì)胞都含有大量的絲狀物質(zhì)，并發(fā)育出1個精子（圖版Ⅰ，5），精細(xì)胞被不規(guī)則的精子器壁細(xì)胞包圍（圖版Ⅰ，6）。精細(xì)胞4個，整齊發(fā)育，都包括細(xì)胞質(zhì)、精核、鞭毛和微管帶等4部分。細(xì)胞質(zhì)富含線粒體；精核螺旋狀，由精核的6個橫切面可知最初的精核螺旋3圈以上，隨精子發(fā)育成熟（圖版Ⅰ，5、6），螺旋圈數(shù)逐漸減少到2圈（圖版Ⅰ，6，精核只有4個橫切面）甚至1圈（圖版Ⅰ，5，精核只有2個橫切面），通過透射電鏡（圖版Ⅰ，4～6）以及光鏡觀察，測得精核長約24μm，橫切面圓形，直徑為0.3～0.6μm；鞭毛12條，長約22μm，為典型的“9＋2結(jié)構(gòu)”（圖版Ⅰ，7）；微管帶發(fā)育較弱。壁細(xì)胞內(nèi)除明顯的細(xì)胞核外，還含有一定量的淀粉（圖版Ⅰ，8）和大量質(zhì)地均勻的網(wǎng)狀物質(zhì)（圖版Ⅰ，9）。

培養(yǎng)15～20d，雄配子體的發(fā)生率達(dá)到最高值，約為4.5%，光鏡下可見從雄配子體釋放出來的游動精子，游動速度53μm／s，平均壽命8min。17d精子釋放率最高，平均每個雄配子體產(chǎn)0.46個精子；22d后不再有精子釋放，未見游動精子自溶現(xiàn)象。

2.2 云貴水韭雄配子體及其精子發(fā)育

成熟小孢子的周壁和外壁之間有巨大的縫隙，外壁、內(nèi)壁和原生質(zhì)團之間貼合緊密并凝集在小孢子的中央，體積占小孢子的1／2強，原生質(zhì)成分除油滴、蛋白質(zhì)和淀粉粒外，近裂縫處有大量均質(zhì)的染色較淺的細(xì)胞質(zhì)（圖版Ⅰ，10）。培養(yǎng)4d后，原生質(zhì)充滿周壁內(nèi)的空間，細(xì)胞核直徑約4.7μm，細(xì)胞質(zhì)的主要成分為蛋白質(zhì)，沒有油滴和淀粉，質(zhì)地較均勻，外壁吸水后厚度可達(dá)1～1.5μm（圖版Ⅰ，11），雄配子體的發(fā)育過程與中華水韭基本相同，即只含有1個原葉體細(xì)胞、1個精子器壁細(xì)胞和4個精細(xì)胞，每個精細(xì)胞中發(fā)育出1個精子。

云貴水韭與中華水韭不同的是小孢子內(nèi)容物凝聚在孢子中央，萌發(fā)初期的營養(yǎng)物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，壁細(xì)胞內(nèi)除明顯的細(xì)胞核外，既有淀粉又有很多油滴（圖版Ⅰ，12）；精子鞭毛排列較緊密，微管帶發(fā)達(dá)，有少量附屬線粒體（圖版Ⅰ，13）；精細(xì)胞內(nèi)的絲狀物質(zhì)含量較大，分布范圍較廣，壁細(xì)胞中的網(wǎng)狀物質(zhì)含量較高（圖版Ⅰ，14），在精細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了一定量的不定形物質(zhì)（圖版Ⅰ，15），通過透射電鏡下檢查精核橫切面的數(shù)量（圖版Ⅰ，12～15）以及用光鏡觀察精子封片，測得精核長度為26μm，螺旋1～2圈；鞭毛12條，長度為22μm。

此外，培養(yǎng)20～23d，雄配子體的發(fā)生率達(dá)到最高值，約為2.8%，培養(yǎng)20d發(fā)育成熟，精子的游動速度為79μm／s。平均壽命11min；25d精子釋放率最高，平均每個雄配子體產(chǎn)生0.38個精子；26d后不再有精子釋放，未見游動精子自溶現(xiàn)象。

3 討 論

3.1 水韭雄配子體及精子發(fā)育的基本特征

水韭的雄配子體雖然只有6個細(xì)胞組成，但一直沒有發(fā)育過程的報道。依據(jù)本研究觀察，結(jié)合前人的有關(guān)成果［2－3，19］，可以將水韭雄配子體發(fā)育過程歸納如圖1。

3.2 雄配子體及精子發(fā)育的系統(tǒng)學(xué)意義

水韭科和卷柏科（Selaginellaceae）雖是近緣類群，但水韭科的雄配子體只由6個細(xì)胞組成，只產(chǎn)生4個精子，而卷柏科雄配子體由百余個細(xì)胞組成，精子數(shù)量多達(dá)128個或256個［15］。從簡化程度看，包括蕨類在內(nèi)，只有水韭科的雄配子體更接近于被子植物的花粉粒［21］，蕨類植物精子器的產(chǎn)精量都是數(shù)十個，精子器壁由3到多個細(xì)胞組成［8］。水韭科的進(jìn)化位置應(yīng)該高于蕨類并接近被子植物，在石松類中應(yīng)該占據(jù)最高的進(jìn)化地位。

高等植物祖先綠藻門（Chlorophyta）的精子多為長卵形、只有2條或4條鞭毛［22］。石松科（Lycopodaceae）［16，23－24］和卷柏科［15，18］的精子為長卵形，只有2條鞭毛，更類似于綠藻；而水韭科精子為螺旋形，鞭毛12～20條［3］，因此，水韭屬在石松類中應(yīng)該是比較孤立的類群。

曹建國等發(fā)現(xiàn)傅氏鳳尾蕨［12］、分株紫萁（Osmunda cinnamomea）［25］等精子都有附屬線粒體，石松類也有大量附屬線粒體［23］，而本研究發(fā)現(xiàn)水韭精子中的附屬線粒體相對較少。蕨類精核橫切面呈卵圓形［9，11］，而水韭精核橫切面則呈圓形。真蕨類普遍具有頂脊、背冠、片層帶等結(jié)構(gòu)［11－12］。而在水韭中不但沒有觀察到背冠和頂脊，而且片層帶在發(fā)育后期也逐漸退化消失［3］。這些似乎都驗證了水韭是維管植物中最孤立的類群［1－2，21］。微管帶是維持蕨類植物精子形態(tài)的關(guān)鍵因素［12］，但2種水韭精子發(fā)育早期，盡管沒有微管帶，精子也成螺旋狀，所以微管帶不一定是水韭精子形態(tài)的決定者，其功能可能是強化鞭毛毛基，或是鞭毛運動的能量傳遞結(jié)構(gòu)。

3.3 雄性生殖瀕危機制的初步探討

全球范圍的水韭種群數(shù)量都在縮減，中國境內(nèi)的水韭屬植物全部瀕臨滅絕［5－6］。通過以孢子體為對象的生態(tài)調(diào)查，一般認(rèn)為其瀕危原因是耕作、放牧、工業(yè)生產(chǎn)等造成的水體pH和電導(dǎo)率變化、污染物含量增加等［26－28］，對低溫脅迫［29］、除草劑［30］等都有較強的抗性。但配子體世代與瀕危間的關(guān)系尚無報道，而精卵結(jié)合的有性生殖過程，應(yīng)該是生活史中敏感而脆弱的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［31］，因為：①2種水韭雄配子體發(fā)生率極低，都小于5%；②對壽命只有幾分鐘或十幾分鐘、個體極其微小的精子來說，在濕地水體中游到另一個獨立生活的雌配子體，其相對距離應(yīng)該是“極其漫長”的；③游動精子是沒有細(xì)胞壁的裸露單細(xì)胞［2］，具有敏感的趨化性才能有效地游向頸卵器；④水體一旦受到污染，輕則干擾精子的趨化性，重則殺死精子［31］。事實如此：華東地區(qū)的污染遠(yuǎn)比云貴高原嚴(yán)重，中華水韭也比云貴水韭更瀕危［6］；理論也如此：卷柏科的雄配子體也是在小孢子壁內(nèi)發(fā)育，但每個雄配子體的產(chǎn)精數(shù)［15］是水韭的32～64倍，而且孢子體的旱生拳卷現(xiàn)象［2］，完全規(guī)避了水韭的生殖生態(tài)問題。所以本研究認(rèn)為雄配子體發(fā)生率低、產(chǎn)精量少，受精與生殖生態(tài)的矛盾等，可能是造成中國水韭瀕危的主要原因之一。

圖1 水韭配子體發(fā)育模式SP.小孢子；P.原葉體細(xì)胞；AR.精子器原始細(xì)胞；PS.初生精細(xì)胞；W.精子器壁細(xì)胞；SC.精細(xì)胞Fig.1 Pattern of Isoetes male gametophyte development SP.Microspore；P.Prothallial cell；AR.Primary antheridium cell；PS.Primary sperm cell；W.Antheridium wall cell；SC.Sperm cell

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［31］ 許 冰，劉保東.球子蕨精子抗逆微生態(tài)的初步研究［C］／／紀(jì)念秦仁昌論文集.北京：中國林業(yè)出版社，1999：347－351.

圖版說明：

AMP.不定形物質(zhì)；CR.孢子周壁裂縫；CY.細(xì)胞質(zhì)；DR1.絲狀物質(zhì)；DR2.網(wǎng)狀物質(zhì)；F.鞭毛；M.附屬線粒體；MR.微管帶；SCW.精細(xì)胞壁；N.精核；NU.精子器壁細(xì)胞核；O.油滴；P.蛋白質(zhì)；S.淀粉粒；SPE.精細(xì)胞；EX.孢子外壁

Explanation of plate：

AMP.Amorphous material；CR.Crevice of perispore；CY.Cytoplast；DR1.Filiform mass；DR2.Reticular mass；F.Flagellum；M.Accessory mitochondria；MR.Microtubular ribbon；SCW.Sperm cell wall；N.Sperm nucleus；NU.Nucleus of antheridium wall cell；O.Oil drop；P.Protein；S.Starch；SPE.Sperm cell；EX.Exospore

圖版Ⅰ 中華水韭（1～9）和云貴水韭（10～15）雄性發(fā)育的亞顯微特征1.干燥的小孢子；2.培養(yǎng)3d的雄配子體裂縫；3.培養(yǎng)3d的雄配子體；4.精細(xì)胞發(fā)育初期；5.培養(yǎng)12d的精細(xì)胞；6.培養(yǎng)12d的雄配子體；7.精細(xì)胞結(jié)構(gòu)；8.精子器壁細(xì)胞的細(xì)胞核；9.絲狀和網(wǎng)狀物質(zhì)；10.干燥的小孢子；11.培養(yǎng)4d的雄配子體；12.成熟雄配子體；13.精細(xì)胞結(jié)構(gòu)；14.精細(xì)胞；15.成熟精子。PlateⅠ Ultrastructure characteristic of male individual development in I.sinensis（1－9）and I.yunguiensis（10－15）Fig.1.Dry microspore；Fig.2.Crevice of male gametophyte after 3dof culture；Fig.3.Male gametophyte after 3dof culture；Fig.4.Earlystage of sperm development；Fig.5.Sperm after 12dof culture；Fig.6.Male gametophyte after 12dof culture；Fig.7.Ultrastracture of sperm cell；Fig.8.Nucleus of antheridium wall cell；Fig.9.Filiform mass and reticular mass；Fig.10.Dry microspore；Fig.11.Male gametophyte after 4dof culture；Fig.12.Adult male gametophyte；Fig.13.Ultrastracture of sperm cell；Fig.14.Sperm cell；Fig.15.Adult sperm.

（編輯：潘新社）

Comparative Study about Development of Microgametopyte of Two Endangered Endemic Quillwort Species in China

LI Xiaodong1，TAN Guijuan2，LI Xiaoxi1，LIU Baodong1＊
（1College of Life Sciences and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150025，China；2Beijing Jidinglida Biological Technology Co.，LTD，Beijing 101105，China）

Transmission electron microscopy and light microscopy are used to view the development of microga－metophyte and sperm in Isoetes sinensis and I.yunguiensis.The results show that：（1）lifetime of microgametophyte in the two quillwort species are only 15－30d，live in sporoderm all life；（2）male gametophyte are consistes of 1prothallial cell，1antheridium wall cell and 4sperm cells.There are plentiful inclusion in prothallial cell and antheridium wall cell；（3）sperm consists of nucleus，flagellum，microtubular ribbon and cytoplasm；（4）the gemination rate of microspore in I.sinensis is 4.5%，producting average 0.46 sperm per microgametophyte，swimming speed of sperm is 53μm／s and lifetime of sperm is 8min.The gemination rate of microspore and production of sperm in I.yunguiensis are higher than that in I.sinensis，but swimming speed and lifetime are lower than that of I.sinensis.The primary reason of endangerment of quillwort in China attributes to the low production rate of spermatozoid limit of reproduction and ecology and water pollution.According to the characteristics of male individual，Isoetes are higher than other Lycophytes.The development pattern of Isoetes male gametophytes was summarized.

Isoetes sinensis；I.yunguiensis；male gametophyte；sperm

Q944.58

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1142

1000－4025（2015）06－1142－06

2014－12－24；修改稿收到日期：2015－04－07

國家自然科學(xué)基金（31170294）

李曉東（1989－），男，碩士，主要從事植物生殖生物學(xué)研究。E－mail：lixiaodong.0000＠163.com

＊通信作者：劉保東，教授，主要從事植物系統(tǒng)及生殖的科研工作。E－mail：99bd＠163.com