生菜硝酸還原酶基因的克隆及高氮水平下外源γ－氨基丁酸對(duì)其表達(dá)和葉片硝酸鹽含量的影響

田 真，李敬蕊，王 祥，吳曉蕾，宮彬彬，高洪波

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071001）

生菜硝酸還原酶基因的克隆及高氮水平下外源γ－氨基丁酸對(duì)其表達(dá)和葉片硝酸鹽含量的影響

田 真，李敬蕊，王 祥，吳曉蕾，宮彬彬，高洪波＊

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071001）

硝酸還原酶（NR）是硝酸鹽代謝的關(guān)鍵酶。該研究在成功克隆生菜NR基因的同時(shí)，進(jìn)行了高氮水平下外源γ－氨基丁酸（GABA）對(duì)生菜葉片NR基因表達(dá)和NO3－－N含量的研究。結(jié)果表明：（1）生菜NR基因（GenBank登錄號(hào)為KP122207）序列長(zhǎng)1 791bp，編碼585個(gè)氨基酸殘基，蛋白保守結(jié)構(gòu)域含鉬輔蛋白超家族、細(xì)胞色素b5超家族和FNR超家族；生菜NR基因與菊苣NR基因親緣關(guān)系最近，序列一致性為93%，與煙草、甜菜、黃瓜、大豆等NR序列的一致性均在80%以上。（2）高氮水平下外源2.5mmol／L GABA處理生菜可誘導(dǎo)NR基因上調(diào)表達(dá)，并顯著提高了生菜葉片NR、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酸脫羧酶（GAD）活性和NH4＋－N含量，降低了NO3－－N、NO2－－N含量；雖然NO3－－N含量與NR、GAD、NiR活性、NO2－－N、NH4＋－N含量均呈顯著相關(guān)關(guān)系，但與NR活性的相關(guān)系數(shù)最高且達(dá)極顯著水平。研究認(rèn)為，高氮水平下外源GABA可通過誘導(dǎo)NR基因上調(diào)表達(dá)、增強(qiáng)相關(guān)酶活性來影響無機(jī)氮代謝，從而降低了生菜葉片硝酸鹽含量，其中NR在該過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，為生產(chǎn)中GABA的施用及降低葉菜類蔬菜硝酸鹽含量提供了理論依據(jù)。

γ－氨基丁酸（GABA）；高氮水平；生菜；基因克?。幌跛猁}含量

近年來，設(shè)施蔬菜發(fā)展迅速，但在蔬菜生產(chǎn)中一部分菜農(nóng)為追求經(jīng)濟(jì)效益常濫施化肥，特別是單一大量施用氮肥，導(dǎo)致蔬菜體內(nèi)硝酸鹽含量超標(biāo)的現(xiàn)象較嚴(yán)重。許多學(xué)者提出了降低蔬菜硝酸鹽含量的方法，如合理施用氮肥、改善蔬菜生長(zhǎng)環(huán)境、選擇合適的采收期、采用適宜貯藏加工及食用處理方法等，但是這些方法的實(shí)施受外界環(huán)境因素的影響較大，從而效果不穩(wěn)定［1］。硝酸還原酶（ritrate reductase，NR）作為催化硝酸鹽同化反應(yīng)的限速酶，是影響蔬菜硝酸鹽累積的主要內(nèi)源因子，在氮素代謝中占有重要地位［2］。研究證明通過提高NR活性有利于蔬菜硝酸鹽的降解［3］，但不同蔬菜體內(nèi)NR活性存在很大差異，通過外源物質(zhì)調(diào)控的方法穩(wěn)定提高NR活性對(duì)降低蔬菜體內(nèi)硝酸鹽積累具有重要作用［4］。

γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，有緩解高血壓、提高免疫力、改善睡眠等的作用。外源GABA可被植物根系和葉片吸收，作為氨基酸態(tài)氮參與植物一系列生理代謝反應(yīng)，在促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育、提高抗逆性等方面具有重要作用［5－6］。近年來，關(guān)于GABA對(duì)植物硝酸鹽含量的影響受到關(guān)注，研究證明外源γ－氨基丁酸可調(diào)節(jié)擬南芥幼苗硝酸鹽的吸收和利用［7］，可作為甘藍(lán)型油菜硝酸鹽吸收上調(diào)的長(zhǎng)途信號(hào)［8］，但在高氮水平下GABA降低蔬菜硝酸鹽含量的作用和機(jī)理研究較少。生菜作為一種重要的葉菜類蔬菜，極易富集硝酸鹽，而實(shí)際生產(chǎn)中設(shè)施土壤氮素水平超標(biāo)現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，為此從克隆生菜NR基因入手，探求高氮水平下外源GABA降低生菜葉片硝酸鹽含量的作用機(jī)理，旨在尋求降低生菜硝酸鹽含量、提高產(chǎn)品品質(zhì)的有效措施。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)生菜品種為‘大速生’，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。種子經(jīng)55℃溫水浸種后，播于裝有石英砂的塑料盆中育苗，溫室晝溫27～30℃，夜溫16～18℃。子葉展開后，用1／2倍的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆苗。幼苗長(zhǎng)有4片真葉時(shí)，選整齊一致的健壯幼苗定植到裝有1倍Hoagland營(yíng)養(yǎng)液［pH（6.3±0.1），EC（2.0～1.2）］的盆中水培，氣泵正常通氣。待幼苗長(zhǎng)出第6片葉子時(shí)，將幼苗分成2組并分別進(jìn)行下列處理。（1）NaNO3處理（CK）：在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（含有14mmol／L NO3－）中添加18mmol／L NaNO3，使得營(yíng)養(yǎng)液中NO3－濃度達(dá)到32mmol／L（此濃度接近設(shè)施土壤硝態(tài)氮濃度）；（2）NaNO3＋2.5mmol／L GABA處理（2.5GABA）：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中同時(shí)添加18 mmol／L NaNO3和2.5mmol／L GABA。NaNO3和GABA的濃度均為前期試驗(yàn)篩選出的最佳濃度［9］。在處理0、3、6d取生菜葉片，用液氮速凍后存放到－80℃超低溫冰箱內(nèi)，用于硝酸還原酶基因的克隆和表達(dá)分析；并在處理0、3、6、9、12d后取生菜葉片，測(cè)定硝酸鹽代謝中主要產(chǎn)物含量和相關(guān)酶活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 方 法

1.2.1 生菜總RNA提取及cDNA合成 分別稱取不同處理冷凍的生菜葉片0.1g，液氮研磨。采用塞勒生物EASYEX植物RNA快速提取試劑盒提取總RNA，通過Thermo Scientific NanoDrop 2000／2000C和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。按照TAKARA PrimerScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2 生菜NR基因的克隆和表達(dá) 生菜NR基因序列尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)以同為菊科的菊苣NR基因組DNA序列（GenBank登錄號(hào)為X84103.1）為依據(jù)，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物NR－s（5′－CAAATACGGGACCAGCATAA－3′）和NR－a（5′－TTGGCAACAACATACCATACCT－3′）。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1.25μL、dNTP（2.5 mmol·L－1）4.0μL、上下游引物（10μmol·L－1）各0.5μL、Buffer（10×）2.5μL、Taq酶0.25μL和ddH2O 16μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫?？寺～@得的產(chǎn)物切膠回收，與pMD19－T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，在氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中37℃搖菌3h，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

另外，就不同處理生菜葉片cDNA（通過Thermo Scientific NanoDrop 2000／2000C儀器檢測(cè)并調(diào)節(jié)為一致的濃度），分別用上述所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以此來分析生菜葉片NR基因的表達(dá)量。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 序列比對(duì)采用NCBI Blast；利用ExPASy ProtParam對(duì)NR基因編碼蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／pfa／iprscan／）預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域；多序列比對(duì)用DNAMAN軟件，并用MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 硝酸鹽代謝過程中主要產(chǎn)物含量和相關(guān)酶活性的測(cè)定及其相關(guān)性分析 硝態(tài)氮（NO3－－N）、銨態(tài)氮（NH4＋－N）含量的測(cè)定參照呂偉仙［10］的方法；亞硝態(tài)氮（NO2－－N）含量采用鹽酸萘乙二胺比色法測(cè)定；硝酸還原酶（ritrate reductase，NR）和亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）活性的測(cè)定分別參照Foyer等［11］和Takahashi等［12］的方法；谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活性采用GABA比色定量法［13］測(cè)定。采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，SAS 8.1軟件Duncan多重比較法進(jìn)行方差分析。同時(shí)，利用SPSS 17.0軟件的Pearson相關(guān)系數(shù)法對(duì)硝酸鹽代謝過程中的NO3－－N、NO2－－N、NH4＋－N含量與相關(guān)酶NR、NiR、GAD活性進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生菜NR基因的克隆和表達(dá)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 000～2 000bp之間出現(xiàn)預(yù)期條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果良好，均為單峰。經(jīng)NCBI Blast比對(duì)，與菊苣（Cichorium intybus，GenBank登錄號(hào)為P43101.1）NR基因序列一致性為93%，初步證明獲得的序列為生菜NR基因（GenBank登錄號(hào)為KP122207），可用于后續(xù)序列分析。

將不同處理生菜葉片的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條帶的亮度表示基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在處理3、6d時(shí)，2.5 mmol／L GABA處理的生菜葉片NR基因的表達(dá)量均高于對(duì)照處理（圖2），表明2.5mmol／L GABA處理提高了生菜葉片NR基因的表達(dá)量。

2.2 生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果分析表明，生菜葉片NR基因序列長(zhǎng)1 791bp（圖1），該基因編碼的氨基酸殘基長(zhǎng)度為585。ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該序列編碼的蛋白由20種氨基酸組成，分子量為66kD，理論等電點(diǎn)為6.15，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為72，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為63。

圖1 生菜葉片NR基因的擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000；1.生菜葉片NR基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 NRgene amplification products in lettuce leaves M.DL2000；1.NR gene amplification products in lettuce leaves

圖2 GABA處理后高氮水平下生菜葉片N R基因的表達(dá)結(jié)果M.DL200；1～5分別表示0 d的C K處理、3 d的C K和2.5 G A B A處理、6 d的C K和2.5 G A B A處理的生菜葉片N R基因表達(dá)量Fig.2 Expression result of NRgene after the treatmen to fGAB Aunder highnit ro gen leve lin lettuce leaves M.DL 2000；1－5stand for thee xpress ion ofNR genein lettuce leaves at0d（CK），3d（CKand 2.5 GABA），6d（CKand 2.5 GABA）

同時(shí)，NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生菜NR基因結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖3），生菜NR基因含有鉬輔蛋白超家族（1～213），其在硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的過程中發(fā)揮著重要作用。另外還包含細(xì)胞色素b5超家族（271～351）和FNR超家族（396～585），且含有FAD和NADH結(jié)構(gòu)域的FNR超家族，是眾多還原酶類所共有的保守結(jié)構(gòu)。

另外，氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，生菜NR基因編碼的氨基酸序列與菊苣（Cichorium intybus）、可可（Theobroma cacao）、煙草（Nicotiana tabacum）、蓖麻（Ricinus communis）、甜菜（Beta vulgaris）、黃瓜（Cucumis sativus）、苜蓿（Medicago truncatula）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）9個(gè)物種中的同源基因編碼的氨基酸序列具有很高的相似性，均含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖4，A～C為3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域）。系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步分析表明，生菜NR基因編碼的氨基酸序列與菊苣親緣關(guān)系最近，序列一致性高達(dá)93%；而且其與煙草、可可、蓖麻、甜菜、黃瓜、苜蓿、擬南芥、大豆的序列一致性也在80%以上（圖5）。

2.3 外源GABA對(duì)生菜葉片硝酸鹽代謝過程中主要產(chǎn)物含量和相關(guān)酶活性的影響

圖6，A顯示，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2.5mmol／L GABA處理的生菜葉片的NR活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，而對(duì)照葉片的NR活性基本保持穩(wěn)定，且在處理3、6、9d時(shí)2.5mmol／L GABA處理分別比同期對(duì)照顯著提高21.8%、22.2%、20.1%（P＜0.05）；同期兩種處理的生菜葉片NO3－－N含量呈相似的變化趨勢(shì)，但是2.5mmol／L GABA處理的生菜葉片NO3－－N含量在整個(gè)培養(yǎng)過程中均顯著低于對(duì)照處理，如在處理9d時(shí)比對(duì)照降低26.1%（圖6，B）。

同時(shí)，2.5mmol／L GABA處理和對(duì)照的生菜葉片NiR活性也呈先升高后降低的趨勢(shì)，且2.5 mmol／L GABA處理在整個(gè)培養(yǎng)過程中均顯著高于同期對(duì)照處理，并在處理6d時(shí)達(dá)最大，此時(shí)比對(duì)照顯著提高21.1%（圖6，C）；2.5mmol／L GABA處理下的生菜葉片NO2－－N含量在處理時(shí)間為3、12 d時(shí)卻顯著低于對(duì)照處理（圖6，D）。

另外，兩種處理的生菜葉片NH4＋－N含量和GAD活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，均在處理6d時(shí)達(dá)最大值，并在整個(gè)處理過程中2.5mmol／L GABA處理均高于對(duì)照處理。且除處理12d時(shí)的GAD活性外，兩處理間的差異均達(dá)顯著水平。其中，2.5mmol／L GABA處理的生菜葉片NH4＋－N含量在處理6d時(shí)約為對(duì)照的1.5倍，而其相應(yīng)的GAD活性約為對(duì)照的1.2倍（圖6，E、F）。

圖3 NR蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 NR conservative protein domains

圖5 不同植物NR氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析分支上數(shù)值為1 000次重復(fù)Bootstrap值Fig.5 Phylogenetic tree of NR amino acid sequences from different plants The number on the branches mean Bootstrap value for 1 000replicates

圖4 不同植物NR基因編碼氨基酸序列比對(duì)圖A、B、C表示NR基因蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Alignment of amino acid sequences of encode by NRgene from different plant species NRgene conserved protein domains（A－C）are shown by line

此外，硝酸鹽代謝過程中主要產(chǎn)物含量及相關(guān)酶活性相關(guān)分析結(jié)果（表1）顯示，高氮水平下生菜葉片NR活性、NiR活性、GAD活性、NO3－－N含量、NO2－－N含量、NH4＋－N含量?jī)蓛芍g均呈顯著相關(guān)關(guān)系。其中，NO3－－N含量與NR活性、GAD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與NiR活性、NH4＋－N含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與NO2－－N含量的正相關(guān)性也達(dá)極顯著水平。表明生菜葉片中NR、GAD、NiR活性與其NO3－－N含量關(guān)系密切。

圖6 外源GABA對(duì)高氮水平下生菜葉片NO3－－N、NO2－－N、NH4＋－N含量及NR、NiR、GAD活性的影響不同小寫字母表示同一時(shí)間對(duì)照與處理間差異達(dá)0.05水平Fig.6 The effects of exogenous GABA on contents of nitrate，nitrite，ammonium as well as activities of nitrate reductase，nitrite reductase，glutamate decarboxylase in leaves of lettuce under high nitrogen level in nutrient solution The letters mean significant difference at 0.05level between CK and treatment with the same time

表1 硝酸鹽代謝過程中主要產(chǎn)物含量和酶活性的相關(guān)系數(shù)Table 1 The correlation coefficient of the metabolite contents and enzyme activities in the process of nitrate metabolism

3 討 論

硝酸鹽污染是影響設(shè)施蔬菜品質(zhì)的重要因素之一，對(duì)人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。NR在植物氮素代謝中起著關(guān)鍵作用，研究表明NR重組基因nia的表達(dá)降低了生菜中硝酸鹽的含量［14］，將煙草NR基因與CaMV35S啟動(dòng)子的融合基因?qū)氲今R鈴薯中并在其中表達(dá)，馬鈴薯塊莖中的硝酸鹽含量顯著下降［15］。利用基因工程的手段提高葉菜類蔬菜NR基因的含量，以此來降低葉菜類蔬菜的硝酸鹽含量越來越受到人們的關(guān)注，研究NR基因的克隆和表達(dá)具有重要的意義。目前已有針對(duì)不結(jié)球白菜、黃瓜、菜豆等蔬菜的NR基因的克隆和表達(dá)展開研究［16－18］，然而高氮水平下外源GABA對(duì)生菜NR基因表達(dá)情況的研究較少。本試驗(yàn)成功克隆到一段長(zhǎng)為1 791bp的生菜NR基因序列，其編碼蛋白由585個(gè)氨基酸殘基組成；蛋白保守結(jié)構(gòu)域包括3個(gè)NR家族基因的保守結(jié)構(gòu)：鉬輔蛋白超家族、細(xì)胞色素b5超家族及FNR超家族［16］，與不同物種NR基因氨基酸序列比對(duì)具有很高的相似性，表明NR基因在進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性。同時(shí)，高氮水平下外源添加GABA使生菜葉片NR基因的表達(dá)量升高，說明外源GABA有誘導(dǎo)NR基因表達(dá)的作用，對(duì)降低生菜硝酸鹽含量有重要作用。

氨基酸作為硝態(tài)氮的還原產(chǎn)物，對(duì)氮代謝具有反饋調(diào)節(jié)作用，當(dāng)植株生長(zhǎng)環(huán)境中有氨基酸態(tài)氮存在時(shí)，就不會(huì)吸收硝態(tài)氮，以此來降低硝態(tài)氮吸收、還原和氨基酸合成過程中能量的消耗，達(dá)到降低硝酸鹽含量的目的［19］。研究表明，氨基酸態(tài)氮源和硝態(tài)氮同時(shí)存在的情況下，不結(jié)球白菜和生菜先吸收氨基酸態(tài)氮，從而降低其體內(nèi)硝酸鹽含量［20，4］。GABA是一種潛在的植物體中調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)因子［21］或硝酸鹽吸收上調(diào)的長(zhǎng)途信號(hào)［8］，并通過調(diào)節(jié)與氮、碳代謝相關(guān)的酶活性，如硝酸還原酶、谷氨酸合成酶等影響擬南芥幼苗硝酸鹽的吸收和利用，當(dāng)硝酸鹽的濃度升高時(shí)會(huì)抑制硝酸鹽的吸收［7］；外源添加GABA可通過促進(jìn)NR活性的提高，達(dá)到降低生菜硝酸鹽含量的目的［3］。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，高氮水平下外源添加2.5mmol／L GABA顯著提高了生菜葉片NR、NiR、GAD活性和NH4＋－N含量，同時(shí)降低了NO3－－N、NO2－－N含量。這可能是因?yàn)?，外源GABA作為氨基酸態(tài)氮源可以被植物根系直接吸收，當(dāng)環(huán)境中同時(shí)存在硝態(tài)氮和氨基酸態(tài)氮時(shí)，GABA被優(yōu)先吸收，通過誘導(dǎo)NR、NiR、GAD活性的提高，從而達(dá)到降低葉片硝酸鹽含量的目的。

環(huán)境因子、不合理的施肥方式、植物種類等都是影響植物體內(nèi)硝酸鹽積累的因素［22］。植物體對(duì)硝酸鹽的同化反應(yīng)需要經(jīng)過兩個(gè)步驟：首先，NO3－－N在NR的作用下還原成NO2－－N；NO2－－N由NiR還原為NH4＋－N后進(jìn)一步合成氨基酸和蛋白質(zhì)［16］。研究表明，NR的活性代表氮代謝的強(qiáng)弱，NR活性對(duì)整個(gè)氮素代謝的強(qiáng)弱起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［23］。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，生菜葉片內(nèi)NO3－－N含量與NR、NiR、GAD活性，以及與NO2－－N、NH4＋－N含量均呈顯著相關(guān)關(guān)系，表明NR、NiR、GAD活性對(duì)NO3－－N含量的積累有重要作用。

綜上所述，本試驗(yàn)克隆了生菜NR基因序列，該基因在進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性，而且高氮水平下外源GABA可以通過影響無機(jī)氮代謝來降低生菜葉片NO3－－N含量，在此過程中NR發(fā)揮重要作用。此結(jié)果為生產(chǎn)中GABA的合理施用及降低葉菜類蔬菜硝酸鹽含量提供了理論依據(jù)，但GABA對(duì)硝酸鹽代謝中其他關(guān)鍵酶基因的克隆和表達(dá)的影響尚需進(jìn)一步深入研究。

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（編輯：裴阿衛(wèi)）

Cloning of Nitrate Reductase Gene of Lettuce and Effect of Exogenous γ－Aminobutyric Acid on Gene Expression and Nitrate Content in Leaves under High Nitrogen Level

TIAN Zhen，LI Jingrui，WANG Xiang，WU Xiaolei，GONG Binbin，GAO Hongbo＊
（College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China）

Nitrate reductase（NR）is the key enzyme of nitrate metabolism.This paper successfully cloned the gene of NRin lettuce and investigated the effect of exogenousγ－aminobutyric acid（GABA）on the expression of NRgene and NO3－－N content under high nitrogen level in leaves of lettuce cultured with hydroponics culture at the same time.The result showed that：（1）the NRgene（the accession NO.of Genbank is KP122207）sequence of lettuce was 1 791bp that encoding 585amino acid residues，and contained the Moco superfamily，Cyt－b5superfamily and FNR superfamily protein domains.The NRgene sequence of lettuce had close genetic relationship with Cichorium intybus（93%consistency）and had relative close genetic relationship with tobacco，sugar beets，cucumber and soybeans（more than 80%consistency）.（2）The exogenous 2.5mmol／L GABA induced a marked increase in NRgene expression.Meanwhile，significantly in－creased the activities of NR，nitrite reductase（NiR），glutamate decarboxylase（GAD）and the content of NH4＋－N in lettuce leaves under high nitrogen level of nutrient solution，but reduced the contents of NO3－－N and NO2－－N.The content of NO3－－N had significant correlation with the activities of NR，NiR，GAD and the contents of NO2－－N，NH4＋－N，but the correlation coefficient was the highest between NO3－－N and NR which reaching extremely significant negative correlation.The study suggested that，exogenous GABA could affect inorganic nitrogen metabolism and reduce the nitrate content in lettuce leaves by inducing NR gene up－regulated expression and enhancing enzyme activities under high nitrogen level.Especially the NR played a key role in the process，which provided a theoretical basis for the application of GABA and reducing the nitrate content in leafy vegetables.

γ－aminobutyric acid（GABA）；high nitrogen level；lettuce；gene clone；nitrate content

Q789；Q945.79

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1098

1000－4025（2015）06－1098－08

2014－12－26；修改稿收到日期：2015－05－10

河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（ZH2012048）；河北省自然科學(xué)基金（C2014204074）

田 真（1988－），女，在讀碩士研究生，主要從事設(shè)施園藝與無土栽培的研究。E－mail：pingdixienvhai＠163.com

＊通信作者：高洪波，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事設(shè)施蔬菜和無土栽培的教學(xué)和研究工作。E－mail：hongbogao＠hebau.edu.cn