一株磷脂酶D高產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

王 婧, 張春枝

一株磷脂酶D高產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

王 婧, 張春枝

(大連工業(yè)大學生物工程學院,遼寧大連 116034)

磷脂酶D可以催化合成磷脂酰絲氨酸,為了得到高活力的磷脂酶D,采用蛋黃平板法從油脂廠區(qū)的土壤中篩選出產(chǎn)磷脂酶D的菌株X1。通過搖瓶培養(yǎng),用TLC薄層層析法測定酶活力,達到2 023 U/L。對發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化,結(jié)果表明,葡萄糖為碳源10 g/L,蛋白胨為氮源15 g/L,發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵液初始p H為7,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min的發(fā)酵條件,酶活力達到最大,為7 330 U/L。

磷脂酶D產(chǎn)生菌;篩選;發(fā)酵優(yōu)化;酶活力

0 引 言

磷脂酶D(phospholipase D,簡稱PLD)能催化水解卵磷脂釋放出磷脂酸和膽堿,一些PLD亦能催化磷脂?；D(zhuǎn)移反應,將具有羥基的底物與膽堿的極性頭部進行交換反應,生成新的磷脂[1]。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,簡稱PS)是唯一能調(diào)控細胞膜關(guān)鍵蛋白功能的磷脂[2]。天然存在的PS量很低,且不容易提取,成本極高,因此廉價高效地合成PS成為當今科研研究的重要議題。目前國內(nèi)較多采用酶轉(zhuǎn)化法,以天然卵磷脂為基質(zhì),加入絲氨酸,在磷脂酶D的作用下,生成磷脂酰絲氨酸[3]。近年來,利用磷脂酶D的堿基交換反應特性進行磷脂改性以及制備單一磷脂和稀有磷脂取得重大進展[4]。

劉媛媛等[5]通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化,磷脂酶D活力達到3 230 U/L。郭浩等[6]通過對鏈霉菌進行誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化,磷脂酶D活力達到5 210 U/L。本實驗通過特異培養(yǎng)基篩選出一株磷脂酶D的高效產(chǎn)生菌,之后確定培養(yǎng)基組分及條件優(yōu)化,提高磷脂酶D的活力,為通過磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

源于油脂廠區(qū)的土樣,雞蛋。

1.2培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基(%):蛋黃5,NaCl 0.3,p H自然。平板分離培養(yǎng)基(%):NaCl 0.3,MgSO4·7H2O 0.05,CaCl20.1,蛋黃5,瓊脂2,p H 6～7。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%):蛋白胨1,NaCl 0.3, MgSO4·7H2O 0.05,CaCl20.1,蛋黃5。

1.2.2 試 劑

葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、大豆卵磷脂、乙醚、Triton X-100、tris鹽、甲苯、氯仿、甲醇、冰醋酸等。

1.3方法

1.3.1 磷脂酶D產(chǎn)生菌的分離

取土樣1 g,接入50 mL的富集培養(yǎng)基中,32℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)液經(jīng)10倍梯度稀釋后,選擇合適濃度涂布于平板分離培養(yǎng)基上。32℃培養(yǎng)30 h,挑取具有透明圈的菌落分離、純化,直至得到單一菌株的純培養(yǎng)物[7]。

1.3.2 酶液的制備

將所得的單一菌株接入裝有50 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,32℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。4 000 r/min離心10 min,上清液為酶液。1.3.3 酶活力的測定

采用薄板層析法(TLC法)測定酶活力。磷脂酶D的活力單位定義為:最適條件下(30℃、p H=7),單位時間(1 min)內(nèi),底物被水解1μmol所對應的酶量。

1.3.4 標準曲線的繪制

取濃度梯度分別為4.5,3.5,3.0,2.5,2.0, 1.5,0.5 mg/m L的卵磷脂的乙醚溶液做標樣,取GF254硅膠板放入100℃烘箱烘干后點板,碘蒸汽染色后根據(jù)濃度和斑點面積繪制標準曲線。

1.3.5 酶活力的計算

根據(jù)標準曲線,結(jié)合反應時間,由公式(1)可計算出酶對底物卵磷脂的水解活力(U/L)。

式中:Δρ為反應后與反應前底物量的變化, mg/m L;Δt為反應前后時間的變化,min;M為卵磷脂相對分子質(zhì)量;V,VE為有機相反應總體積及反應中所用酶液體積,m L;D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.4發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1 碳 源

改變“1.2.1”中發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類,分別以用葡萄糖、蔗糖、淀粉作為碳源,添加量為10 g/L,其他成分不變,搖床振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.2 氮 源

以10 g/L的葡萄糖為碳源,用蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸鈉作為氮源,添加量為15 g/L,搖床振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.3 發(fā)酵溫度

以10 g/L的葡萄糖為碳源,以15 g/L的蛋白胨為氮源,發(fā)酵溫度分別設定為20,25,30,35,40℃,搖床振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.4 酵液p H

以10 g/L的葡萄糖為碳源,以15 g/L的蛋白胨為氮源,發(fā)酵液起始p H分別設定為4.0, 5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

1.4.5 搖床轉(zhuǎn)速

以10 g/L的葡萄糖為碳源,以15 g/L的蛋白胨為氮源,發(fā)酵液起始p H為8,搖床轉(zhuǎn)速分別設定為140,160,180,200,220 r/min,30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,離心取上清液,測定酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1磷脂酶D產(chǎn)生菌的分離篩選

雞蛋中含有大量不溶于水的卵磷脂,因此,以5 g/L蛋黃為唯一碳源的分離平板是不透明的,如果該平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)透明圈,初步說明該菌有降解磷脂的能力,透明圈越大,說明降解能力越強。圖1中,X1菌株呈乳白色,表面光滑,中央隆起,邊緣整齊,透明圈清晰透明。

圖1 蛋黃培養(yǎng)基上X1菌株Fig.1 X1 strains on the yolk medium

2.2標準曲線的繪制

圖2中,3～9號斑點均為卵磷脂,質(zhì)量濃度依次為4.5,3.5,3.0,2.5,2.0,1.5,1.0, 0.5 mg/m L。根據(jù)圖2繪制標準曲線,得出公式

式中:x為PC斑點面積,y為PC質(zhì)量濃度。

圖2 PC濃度-斑點面積圖Fig.2 The picture of PC concentration-spot area

2.3X1菌株產(chǎn)酶活力的測定

將篩選出的X1菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,離心取上清液即為酶液。用TLC法測定酶活力,達到2 023 U/L。

2.4碳源及其質(zhì)量濃度

碳源是微生物生長的必需營養(yǎng)元素,微生物對不同的碳源利用程度不同[8]。選擇葡萄糖、蔗糖、淀粉取代原發(fā)酵培養(yǎng)基碳源,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,當以葡萄糖為碳源時,酶活力達到3 210 U/L。原因可能是單糖可直接進入代謝途徑被降解,降解速度快于雙糖和多糖。

圖3 碳源對酶活力的影響Fig.3 Effect of carbon sources on the enzyme activity

進一步考察適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度,結(jié)果由圖4可知,當葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L時,酶活力為4 183 U/L。質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,菌體進入穩(wěn)定期,酶活力也維持在原來水平,不再增大。故選擇葡萄糖質(zhì)量濃度10 g/L為最佳。

圖4 葡萄糖質(zhì)量濃度對酶活力的影響Fig.4 Effect of glucose concentration on the enzyme activity

2.5氮源及其質(zhì)量濃度

選擇蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸銨作為氮源,結(jié)果由圖5可知,當以蛋白胨為氮源時,酶活力最大,可達3 905 U/L。有機氮有利于菌體的生長和酶活力的提高,而無機氮對酶活力的提升作用有限[9]。其原因可能是,有機氮在提供氮源的同時,還可以提供一些微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等。

圖5 氮源對酶活力的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on the enzyme activity

進一步考察最適的蛋白胨質(zhì)量濃度,結(jié)果由圖6可知,當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為15 g/L時,酶活力最高,為4 937 U/L。當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度繼續(xù)增大,酶活力維持在原來水平,不再增大。故選擇蛋白胨質(zhì)量濃度為15 g/L最佳。

圖6 蛋白胨質(zhì)量濃度對酶活力的影響Fig.6 Effect of peptone concentration on the enzyme activity

2.6發(fā)酵溫度

微生物群體生長、繁殖最快的溫度為其最適生長溫度,但并不等于其發(fā)酵的最適溫度,所以研究溫度對酶活力的影響是必要的[10]。由圖7可知,在20～30℃溫度范圍內(nèi),酶活力隨溫度增加而不斷增加,在30℃達到最大,為6 320 U/L。當溫度繼續(xù)升高,酶活力呈下降趨勢。原因可能是過高的溫度加快了酶的失活速度。

圖7 溫度對酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on the enzyme activity

2.7發(fā)酵液p H

培養(yǎng)基的p H對微生物的生命活動有較大影響,p H會使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶的電荷發(fā)生變化,從而影響其生物活性。第二是引起細胞膜電荷變化,導致微生物細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力改變[11]。由圖8可知,當p H為7.0～8.0時,酶活力最大,為7 330 U/L。當p H小于5時,菌體很難生長。

圖8 p H對酶活力的影響Fig.8 Effect of p H on the enzyme activity

2.8搖床轉(zhuǎn)速

在搖瓶裝液量一定的條件下,搖床的轉(zhuǎn)速可通過影響培養(yǎng)基中溶解氧的濃度來影響發(fā)酵結(jié)果[12]。由表1可知,在較低的轉(zhuǎn)速下,發(fā)酵液的酶活力較低。搖床轉(zhuǎn)速在180～220 r/min對發(fā)酵液產(chǎn)酶影響并不明顯。基于節(jié)約能源方面的考慮,選擇180 r/min為發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速。

表1 搖床轉(zhuǎn)速對酶活力的影響Tab.1 Effect of shaking speed on enzyme activity

3 結(jié) 論

通過蛋黃平板法,從油脂廠區(qū)的土壤中篩選出產(chǎn)磷脂酶D的菌株X1,經(jīng)過搖瓶培養(yǎng),用TLC薄層層析法測定酶活力,達到2 023 U/L。對發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件優(yōu)化,磷脂酶D活力達到7 330 U/L。得出最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分:碳源為葡萄糖,最適質(zhì)量濃度10 g/L;氮源為蛋白胨,最適質(zhì)量濃度15 g/L。

PAOLA等[13]對4株鏈霉菌所產(chǎn)的磷脂酶D進行了比較,發(fā)現(xiàn)具有相同的最適反應溫度,在35℃時堿基轉(zhuǎn)移活性最高。HAGLSHITA等[14]分離出的磷脂酶D最適p H為7.5,可在p H 7～13的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。趙紫薇等[15]分離的磷脂酶D與本實驗所得磷脂酶D的最適溫度和p H相近,分別為28℃和6.5,但p H適應范圍差異大。其分離所得磷脂酶D在p H=9時活性仍有上升趨勢,而本實驗的磷脂酶D在p H大于8時活性開始下降。原因可能是酶的來源不同,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的差異所造成的。

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Isolation and properties of a phospholipase D-producing strain

WANG Jing, ZHANG Chunzhi
(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Strains X1 producing phospholipase D was isolated from the soil collected from oil factory using the yolk medium plate.The activity of phospholipase D could reach to 2023 U/L in flask fermentation by TLC.Medium composition and culture condition were optimized for phospholipase D production,which was 10 g/L glucose,15 g/L peptone,temperature 30℃,p H 7.0 and shaking speed of 180 r/min.The maximum phospholipase D activity was increased to 7 330 U/L from 2 023 U/L.

phospholipase D-producing strain;screening;fermentation optimizing;enzyme activity

TS261

:A

1674-1404(2015)05-0326-04

2014-09-22.

王婧(1989-),女,碩士研究生;通信作者:張春枝(1963-),女,教授.