棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因的分離及敲除載體的構(gòu)建

李小萍，汪 敏，趙 楊，丁勝利，李洪連，馬宗斌(.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 45000； .河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 45000)

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棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因的分離及敲除載體的構(gòu)建

李小萍1，汪 敏1，趙 楊1，丁勝利1，李洪連1，馬宗斌2
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

利用分生孢子蘸根法篩選棉花黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體庫，獲得了1個(gè)致病力減弱的突變體V546，該突變體在PDA平板上不產(chǎn)生微菌核。利用hiTAIL-PCR技術(shù)，獲得了突變體V546 T-DNA插入的側(cè)端序列。序列比對(duì)分析表明，該突變體T-DNA插入位點(diǎn)在大麗輪枝菌基因VDAG_07282.1的編碼區(qū)。

棉花黃萎?。淮篼愝喼?；致病相關(guān)基因；側(cè)端序列；敲除載體

棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)上最重要的病害之一，幾乎遍及全球各主要棉區(qū)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)是引起棉花黃萎病的主要原因。棉花黃萎病菌作為典型的土傳性病原真菌，該病原菌致病機(jī)理復(fù)雜。目前，對(duì)其致病機(jī)理的研究主要存在堵塞學(xué)說[3]和毒素學(xué)說[4,5]2種觀點(diǎn)。隨著大麗輪枝菌基因組序列的完成，黃萎病菌致病分子機(jī)理及微菌核形成機(jī)理的研究取得一定進(jìn)展[6]。研究表明，真菌里一些保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑如cAMP依賴的蛋白激酶A途徑、促分裂原蛋白激酶途徑(MAPK)、感受營養(yǎng)信號(hào)的SNF途徑和小GTPase Rac1等，與黃萎病菌的致病力或微菌核的形成有關(guān)[7-11]。TZIMA等[7,8]利用同源重組技術(shù)敲除了大麗輪枝菌cAMP依賴的蛋白激酶A基因VdPKAC1(VerticilliumPKA catalytic subunit)，發(fā)現(xiàn)其與致病性有關(guān)， 而蔗糖非發(fā)酵的蛋白激酶VdSNF1基因(Verticilliumsucrose nonfermenting 1 gene)敲除突變體表現(xiàn)為致病力顯著下降，且細(xì)胞壁降解酶活性顯著降低。RAUYAREE等[9]成功敲除了MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的VMK1(VerticilliumMAP Kinase 1)基因，VMK1突變體表現(xiàn)出明顯的致病性下降，且影響微菌核的形成。TIAN[10]研究表明，小GTPase VdRac1與P21活化激酶Cla4(p21 activated kinase Cla4)調(diào)節(jié)黃萎病菌菌絲的極性生長和致病力。敲除后發(fā)現(xiàn)突變體毒性降低，致病力明顯減弱。SANTHANAM[11]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子VdSeg1 是大麗輪枝菌致病性重要的調(diào)控因子，Seg1突變體完全喪失對(duì)番茄的致病力。利用正向遺傳學(xué)途徑，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建黃萎病菌T-DNA插入突變體庫，篩選致病力減弱或微菌核形成缺陷的突變體，進(jìn)而分離并鑒定致病相關(guān)基因或微菌核形成相關(guān)基因的功能，是黃萎病菌功能基因組學(xué)研究的一種有效途徑。利用該策略，ZHANG[12]篩選黃萎病菌T-DNA插入突變體庫，鑒定VdPR3基因參與菌落生長、微菌核形成、胞外酶活性和毒素的形成。TIAN[13]研究發(fā)現(xiàn)黃萎病菌VdMsb基因與微菌核的形成和毒性有關(guān)，該基因敲除體產(chǎn)孢能力明顯下降。近年來，盡管國內(nèi)外有關(guān)黃萎病菌致病機(jī)理研究取得一定進(jìn)展，但同其他植物病原真菌相比，其致病機(jī)理的研究相對(duì)滯后。本研究從T-DNA插入突變體庫中篩選出1個(gè)T-DNA插入微菌核形成能力喪失且致病力減弱的突變體，利用hiTAIL-PCR方法擴(kuò)增其側(cè)端序列，構(gòu)建了該基因的敲除載體，為研究該致病基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與質(zhì)粒 供試菌株為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期保存的強(qiáng)致病力落葉型棉花黃萎病菌FGH2菌株及構(gòu)建的黃萎病菌FGH2T-DNA插入轉(zhuǎn)化子菌株[14]；致病基因敲除載體構(gòu)建所用質(zhì)粒為pKOV21，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供；pMD19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室自備。

1.1.2 主要試劑與材料 Premix Taq，T4 DNA Ligase和限制性內(nèi)切酶均購自Taraka公司；DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；Ampicillin購自北京索萊寶公司；質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體的致病力測(cè)定 致病力測(cè)定采用分生孢子懸浮液蘸根法。致病力測(cè)定所用的棉花品種為感黃萎病品種銀山1號(hào)。將供試棉種催芽，在溫室中進(jìn)行育苗。將黃萎病菌單孢分離并活化后，將黃萎病菌分生孢子1.0×106個(gè)·mL-1涂布在PDA平板上。6 d后，收集待測(cè)的棉花黃萎病菌T-DNA 插入突變體和野生型菌株FGH2分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)其濃度至1.0×107個(gè)·mL-1。待棉苗長至2片真葉時(shí)，挑選根系生長良好的植株進(jìn)行浸根40 min接種后，移栽至裝有無菌土的紙杯中，25 ℃下培養(yǎng)。每個(gè)菌株接種10株棉苗，3次重復(fù)。接種30 d后，按照石磊巖等[15]棉花苗期分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情調(diào)查。

棉花苗期葉片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為： 0 級(jí)：健株，無癥狀； 1 級(jí)：1～2 片子葉發(fā)?。?2 級(jí)：1 片真葉發(fā)??； 3 級(jí)：2 片以上真葉發(fā)病或脫落僅剩心葉； 4 級(jí)：植株生長點(diǎn)或全株枯死。

1.2.2 黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體微菌核形成能力測(cè)定及菌落形態(tài)觀察 將篩選獲得的致病力減弱的黃萎病菌T-DNA 插入突變體和野生型菌株FGH2接種于PDA培養(yǎng)基平板上，暗培養(yǎng)1周后，用直徑0.7 cm的打孔器在菌落的邊緣處選取菌餅，置于PDA平板中心，暗培養(yǎng)15 d后對(duì)其進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察和分類。根據(jù)突變體的菌落形態(tài)[16]和黑色微菌核的有無將其分為菌核型、菌絲型和中間型3種類型。

1.2.3 黃萎病菌T-DNA插入突變體側(cè)翼序列的獲得 將待測(cè)突變體菌株和野生型菌株FGH2接種于Czapek液體培養(yǎng)基中，150 r·min-1培養(yǎng)6 d，收集菌絲，采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。采用hiTAIL-PCR法擴(kuò)增突變體T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)端序列，試驗(yàn)參照LIU等[17]的方法進(jìn)行。所用隨機(jī)引物序列和特異性引物序列如表1。

1.2.4 PCR產(chǎn)物連接、測(cè)序和序列分析 將第3輪PCR產(chǎn)物切膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，藍(lán)白斑挑取陽性克隆，以AC1和RB-2b為引物進(jìn)行測(cè)序。獲得的突變體T-DNA插入位點(diǎn)右側(cè)序列與美國BROAD研究所(http://www.broad.mit. edu/)公布的大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌(V.albo-atrum)VaMs.102的基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 hiTAIL-PCR擴(kuò)增引物列表Table 1 Primers list used for hiTAIL-PCR

注：LAD1-LAD4 是簡(jiǎn)并引物；RB-0b-RB-2b是特異性嵌套引物。M=A/C，R=A/G，W=A/T，S=G/C，Y=C/T，K=G/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T。

Note: LAD1-LAD4 are longer arbitrary degenerate; RB-0b-RB-2b are specific nested primers. M=A/C，R=A/G，W=A/T，S=G/C，Y=C/T，K=G/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T.

1.2.5 黃萎病菌致病相關(guān)基因敲除載體的構(gòu)建

1.2.5.1 黃萎病菌致病相關(guān)基因VDAG_07282.1及上、下游序列的獲得 擴(kuò)增目標(biāo)基因上、下游特異引物的設(shè)計(jì)：從大麗輪枝菌VDLs.17基因組數(shù)據(jù)庫中，選取基因VDAG_07282.1編碼區(qū)的上、下游1 200 bp的序列，利用 DNAman 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因VDAG_07282.1上、下游序列的引物，并在上、下游引物上加上合適的酶切位點(diǎn)(表2)。

目標(biāo)基因上、下游序列的獲得：以黃萎病菌FGH2基因組DNA為模板，分別以引物546UP/F和546UP/R擴(kuò)增基因VDAG_07282.1的上游片段，以引物546DOWN/F和546DOWN/R擴(kuò)增基因VDAG_07282.1下游片段。擴(kuò)增體系為：基因組DNA 1 μL，546UP/F(546DOWN/F)1 μL，546UP/R(546DOWN/R)1 μL，Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5.2 中間載體的構(gòu)建 將擴(kuò)增的上下游PCR產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化。純化后的上游片段及質(zhì)粒pKOV21用限制性內(nèi)切酶BamHI 30 ℃下酶切12 h后，再加入限制性內(nèi)切酶EcoRI 37 ℃酶切9 h，酶切后回收酶切產(chǎn)物，并通過T4連接酶將上游片段連接到pKOV21上，連接產(chǎn)物命名為p546UPKOV21。

表2 構(gòu)建敲除載體所用引物及引入的酶切位點(diǎn)Table 2 The primers used for a knockout vector and the enzymes introduced from primers

注：下劃線處為酶切位點(diǎn)，波浪線處為保護(hù)堿基。

Note:The underline line is for enzyme loci, while the wavy lines are protecting base.

利用潮霉素基因設(shè)計(jì)特異引物，用于構(gòu)建載體的檢測(cè)(表2)。將p546UPKOV21連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行藍(lán)白斑挑選，挑取白色菌落在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖培5～6 h，以546UP/F和HYG/R為引物進(jìn)行陽性菌液PCR篩選。用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，對(duì)構(gòu)建的中間載體p546UPKOV21用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.2.5.3 敲除載體的構(gòu)建 將下游片段與p546UPKOV21同時(shí)用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI 在37 ℃下雙酶切，將酶切產(chǎn)物純化后，利用T4連接酶連接，得到p546KOV21，即為敲除載體。將p546KOV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行藍(lán)白斑挑選。挑取白色菌落在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖培5～6 h，以546UP/F和546DOWN/R為引物進(jìn)行陽性菌液PCR篩選，并將獲得的陽性克隆加甘油保存到-80 ℃。用試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，使用HindIII和KpnI在37 ℃進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃萎病菌T-DNA 插入轉(zhuǎn)化體的致病力測(cè)定

對(duì)100個(gè)黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體和野生型菌株利用分生孢子懸浮液浸根接種，測(cè)定轉(zhuǎn)化體與野生型的致病性差異。結(jié)果表明,野生型黃萎病菌FGH2在接種12 d后葉片出現(xiàn)典型癥狀，21 d后病情嚴(yán)重，30 d大多數(shù)植株葉片脫落成光桿，表現(xiàn)為典型的落葉型癥狀(表3)。大多數(shù)轉(zhuǎn)化體致病力未發(fā)生顯著變化，7%的轉(zhuǎn)化體致病力降低，而轉(zhuǎn)化體V546致病力顯著降低(表3)。同野生型菌株FGH2相比，V546 12 d開始出現(xiàn)典型的黃萎病癥狀，但病情擴(kuò)展較慢，30 d后僅表現(xiàn)為下部葉片黃化(圖1)。

表3 黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子接種銀山1號(hào)致病性測(cè)定結(jié)果 Table 3 Pathogenicity assays of V.dahliae FGH2 and T-DNA Transformants on cotton Yinshan 1 post inoculation 30 days

圖1 黃萎病菌突變體V546接種30 d癥狀Fig.1 Disease symptoms of cotton plants Yinshan 1 post inoculation 30 days with V.dahliae FGH2 and mutant V546

2.2 棉花黃萎病菌突變體生物學(xué)篩選

將致病力顯著減弱的黃萎病菌突變體V546菌餅置于PDA上培養(yǎng)15 d后，突變體V546菌落平鋪，氣生菌絲較少、白色，沒有黑色微菌核產(chǎn)生(圖2)。

2.3 T-DNA插入突變體V546側(cè)端序列擴(kuò)增

采用hiTAIL-PCR方法擴(kuò)增突變體V546 T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)端序列。將第2輪和第3輪的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳圖譜分析，對(duì)第2,3輪的條帶大小做比較，理論上第3輪的條帶比第2輪小約70 bp，為本研究所需要的特異性條帶(圖3)。

圖2 野生型FGH2和突變體V546在PDA平板上培養(yǎng)15 d后菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology of FGH2 and mutant V546 grown on PDA plate for 15 days

注： 1.第2輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物；2.第3輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物。

Note:1.The secondary hiTAIL-PCR products; 2.The tertiary hiTAIL-PCR products.

圖3 大麗輪枝菌突變體T-DNA側(cè)翼序列 hiTAIL-PCR第2步和第3步產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳
Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns ofV.dahliaemutants T-DNA flanking sequence secondary and tertiary hiTAIL-PCR products.

2.4 黃萎病菌突變體V546T-DNA插入側(cè)翼序列的分析

將擴(kuò)增的目標(biāo)片段連接到pMD19-T載體上，經(jīng)PCR篩選后，選擇陽性克隆，送華大基因生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖4。圖4中下劃線序列為T-DNA右側(cè)臂序列。

注：波浪線處為載體序列，下劃線處為比對(duì)序列。 Note: The wavy lines indicated vector’s sequence,underline line as gene’s sequence.

將獲得的T-DNA側(cè)翼序列與大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌VaMs.102基因組序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到突變體V546 T-DNA插入位點(diǎn)右側(cè)翼序列大小為112 bp，T-DNA插入位點(diǎn)位于V.dahliaeVdLs.17 菌株的5號(hào)染色體16重疊群的289 278 bp處，位于基因VDAG_07282.1的外顯子上(圖5)，該基因編碼一個(gè)未知功能蛋白。

圖5 VDAG_07282.1基因的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Gene structure of VDAG_07282.1

2.5 目標(biāo)基因上下游序列的獲得

以黃萎病菌野生型菌株FGH2基因組DNA為模板，以引物546UP/F和546UP/R擴(kuò)增出基因VDAG_07282.1的上游片段，大小為1 003 bp。以引物546DOWN/F和546DOWN/R擴(kuò)增出其下游片段，大小為1 006 bp(圖6)。

2.6 中間載體p546UPKOV21 的構(gòu)建及菌液PCR篩選和酶切驗(yàn)證

將目標(biāo)基因的上游片段和質(zhì)粒pKOV21用BamHI和EcoRI雙酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物p546UPKOV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落搖菌，以546UP/F和HYG/R為引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到的條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖7)。同時(shí)用BamHI和EcoRI進(jìn)行酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同(圖8)，表明目標(biāo)基因上游片段已成功連接到pKOV21上。

注：M.DL2000；1.基因上游片段；2.基因下游片段。Note: M.DL2000;1.Gene segments of upstream;2.Gene fragment of the downstream.

注： M.DL10000；1.陰性對(duì)照；2～11.p546UPKOV21。 Note: M.DL10000;1.Negative control; 2～11.p546KOV21.

注： M.DL5000；1.BamH I酶切；2.EcoR I酶切；3.雙酶切。Note: M.DL5000;1.BamH I Enzyme digestion results; 2.EcoR I Enzyme digestion results; 3.Double enzyme digestion results.

2.7 敲除載體p546KOV21的構(gòu)建及菌液PCR篩選和酶切驗(yàn)證

將構(gòu)建的中間載體和目標(biāo)基因的下游片段同時(shí)用HindIII和KpnI進(jìn)行酶切，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物p546KOV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑取白色菌落搖菌以546UP/F和546DOWN/R為引物進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到的條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖9)。進(jìn)一步提取陽性菌落重組質(zhì)粒DNA，利用HindIII和KpnI 進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同(圖10)。以上結(jié)果表明基因下游片段已成功連接到p546UPKOV21(圖11)上，線性化后可用于后續(xù)的目標(biāo)基因敲除轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

注： M.DL10000；1～11.p546KOV21；12.陰性對(duì)照。Note: M.DL10000;1～11.p546KOV21;12.Negative control.

注： M.DL10000；1.Hind III酶切；2.Kpn I酶切；3.雙酶切。Note: M.DL10000; 1.Hind III Enzyme digestion results; 2.Kpn I Enzyme digestion results; 3.Double enzyme digestion results.

圖11 基因敲除載體p546KOV21Fig.11 Gene replacement vector p546KOV21

3 結(jié)論與討論

目前，種植抗病品種是防治植物病害的一種有效措施，但是生產(chǎn)上尚缺乏高抗棉花黃萎病品種[18]。由于田間棉花黃萎病菌是一個(gè)致病力高度分化的群體，且致病力容易變異，出現(xiàn)強(qiáng)致病力的類型，以及棉花品種抗病性的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致中國主要產(chǎn)棉區(qū)棉花黃萎病普遍發(fā)生[19]。深入研究黃萎病菌致病及微菌核形成的分子機(jī)理，鑒定出控制致病性的關(guān)鍵基因，有助于揭示其致病機(jī)制，為防治棉花黃萎病菌新型殺菌劑的設(shè)計(jì)和篩選提供候選靶標(biāo)。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的T-DNA插入轉(zhuǎn)化體庫進(jìn)行篩選，獲得了1個(gè)黃萎病菌突變體V546，該突變體致病力明顯減弱且微菌核形成能力喪失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體T-DNA插入在大麗輪枝菌基因組基因VDAG_07282.1編碼區(qū)，該基因編碼一個(gè)未知功能的蛋白。本研究構(gòu)建了該基因的敲除載體，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。在構(gòu)建目標(biāo)基因敲除載體時(shí)，質(zhì)粒pKOV21同時(shí)帶有新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，這樣后續(xù)進(jìn)行黃萎病菌轉(zhuǎn)化時(shí)，可以以潮霉素作為陽性篩選標(biāo)記，篩選出潮霉素陽性的轉(zhuǎn)化子。對(duì)篩選的陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步在新霉素抗性平板上篩選，排除假陽性的異位插入轉(zhuǎn)化子，這樣可以極大提高對(duì)目標(biāo)基因敲除突變體篩選的效率[20]。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

Isolation of the pathogenicity-related gene fromVerticilliumdahliaeand construction of knockout vector in cotton

LI Xiaoping1, WANG Min1, ZHAO Yang1, DING Shengli1, LI Honglian1, MA Zongbin2
(1.College of Plant Protection, Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China;2.Agronomy College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002，China)

The pathogenicity ofV.dahliaeT-DNA transformants on the cotton variety Yinshan 1 seeding was tested by dipping roots withV.dahliaespore suspension,and a pathogenicity defective mutant V546 was obtained,indicating microsclerotia development defectively on PDA.The T-DNA insertional flanking sequence of mutant V546 was isolated by hiTAIL-PCR，which was integrated in theV.dahliaegeneVDAG_07282.1 coding sequence by genome sequence alignment.

verticillium wilt of cotton;Verticilliumdahliae; pathogenicity-related gene; flanking sequence; knockout vector

2015-05-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30700520)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科技專項(xiàng)(201503109)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A210025)；河南省棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助(S2013-07-G04)

李小萍(1988-)，女，河南鶴壁人，碩士研究生，從事植物病原真菌生物學(xué)方面的研究。

汪 敏(1974-)，男，河南新縣人，副教授，博士。

1000-2340(2015)06-0787-07

S435.6

A