中華大蟾蜍視網(wǎng)膜Müller細胞形態(tài)觀察

楊鵬飛， 趙留濤， 趙新芳 ，閆峰賓 ，杜寶寶， 劉忠虎(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院， 河南 鄭州 450002)

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中華大蟾蜍視網(wǎng)膜Müller細胞形態(tài)觀察

楊鵬飛， 趙留濤， 趙新芳 ，閆峰賓 ，杜寶寶， 劉忠虎
(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院， 河南 鄭州 450002)

為了解兩棲動物中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)視網(wǎng)膜中神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)結構及分布，利用生物顯微技術、投射電鏡技術和免疫組化技術顯示了中華大蟾蜍視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞形態(tài)結構。觀察結果顯示，中華大蟾蜍視網(wǎng)膜中僅分布有Müller細胞。 光鏡下Müller細胞在視網(wǎng)膜中成單層分布，細胞長軸沿著眼球半徑成放射狀排列，胞體位于內(nèi)核層，胞體發(fā)出至少2個主干突起。電鏡下視網(wǎng)膜Müller細胞的胞質(zhì)及胞核著色較周圍細胞深，細胞內(nèi)有明顯的纖維成分，與其他神經(jīng)成分易于區(qū)別。Müller細胞近鞏膜側的主干突起延伸到視桿與視錐細胞的內(nèi)節(jié)與胞核交界處，并彼此相互連接形成外界膜，近玻璃體側的突起末端形成圓錐形的終足，錐形的底部緊鄰玻璃體，且在此處彼此相互連接形成內(nèi)界膜。

中華大蟾蜍；視網(wǎng)膜；Müller 細胞

脊椎動物視網(wǎng)膜含有多種膠質(zhì)細胞，如星形膠質(zhì)細胞(Astrocytes)、小膠質(zhì)細胞(Microglial cell)、少突膠質(zhì)細胞(Oligdendrocytes)和Müller細胞等。但不同種的脊椎動物視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞分布類型存在差異。FISCHER等[1]認為,小膠質(zhì)細胞和Müller細胞是視網(wǎng)膜中穩(wěn)定存在細胞，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞在不同物種視網(wǎng)膜中存在情況不同。如在雞、豚鼠和兔等有血管視網(wǎng)膜(Vascular retina)中分布有少突膠質(zhì)細胞，它們形成神經(jīng)纖維層(Nerve fiber layer ，NFL) 節(jié)細胞軸突的髓鞘[2-4]，同時有血管視網(wǎng)膜中也分布有大量星形膠質(zhì)細胞，這些細胞緊密貼附在視網(wǎng)膜內(nèi)血管的壁上[5-7], 而內(nèi)部無血管分布的視網(wǎng)膜幾乎沒有星形膠質(zhì)細胞[8]。研究認為星形膠質(zhì)細胞并非由視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細胞分化形成，而是在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中沿著視神經(jīng)由腦部遷移而來的[9,10]。少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞是有共同祖細胞分化形成的[11]。小膠質(zhì)細胞是在視網(wǎng)膜發(fā)育早期階段由視神經(jīng)處的中胚層細胞分化形成，且形成后潛伏入視網(wǎng)膜層中，或由伴隨血管延伸入視網(wǎng)膜的細胞而來[12]。Müller細胞是視網(wǎng)膜中主要膠質(zhì)細胞，也是僅存在于視網(wǎng)膜中的膠質(zhì)細胞，且該類細胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)元是由同一祖細胞分化形成的[13]。 Müller細胞對視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元不僅起著支持、營養(yǎng)、保護、絕緣等功能，而且具有其他多種重要功能[14-15]。如視網(wǎng)膜內(nèi)Müller細胞表達大量的電壓門控通道(Voltage-gated channels)和神經(jīng)遞質(zhì)受體(Neurotransmitter receptors)，可以識別多種神經(jīng)信號、觸發(fā)細胞去極化和引起細胞內(nèi)Ca2+流變化。此外，Müller細胞可以通過調(diào)節(jié)細胞外神經(jīng)活性物質(zhì)的濃度影響視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的活動，如Müller細胞可以通過其高親和性載體的吸收作用調(diào)節(jié)谷氨酸和GABA濃度,通過Na+-HCO3-共轉(zhuǎn)移作用和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)的酶促作用來調(diào)節(jié)H+濃度等。Müller細胞和神經(jīng)元之間的雙向信息交流說明了其在視網(wǎng)膜中起著非常重要的作用。另外，一些研究報道Müller細胞與視網(wǎng)膜損傷后神經(jīng)元再生有關，是神經(jīng)祖代細胞(Nerve progenitor)來源之一[16～18]。關于兩棲動物視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞國外已有部分資料報道[14,19-21]，KALININA[21]對湖蛙(RanaridibundaPall)研究認為該蛙視網(wǎng)膜中存在4種膠質(zhì)細胞： Müller 細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和spider 細胞。SKATCHKOV等[22]認為,在兩棲類視網(wǎng)膜中Müller細胞是唯一的膠質(zhì)細胞。國內(nèi)關于Müller細胞僅有少量對人視網(wǎng)膜Müller細胞報道[23-24]，對兩棲動物視網(wǎng)膜Müller細胞形態(tài)和分布還未見報道，兩棲動物視網(wǎng)膜Müller細胞數(shù)量較多，易于分離[14]，是用于研究Müller細胞的形態(tài)結構和生理功能理想的模型系統(tǒng)。本研究利用光鏡、電鏡技術和免疫組化染色法顯示膠質(zhì)細胞中特有的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)，系統(tǒng)觀察了中華大蟾蜍Müller細胞在視網(wǎng)膜中的形態(tài)和分布特征，為研究Müller細胞在兩棲類視網(wǎng)膜中的生理功能和視神經(jīng)損傷再生過程中的作用提供形態(tài)學基礎。

1 材料與方法

1．1 試驗動物

健康3年齡成體中華大蟾蜍(Bufogargarizans)10只(雄性6只，雌性4只)，平均體長(9±0.3)cm。由河南農(nóng)業(yè)大學動物房提供。

1．2 光鏡觀察

中華大蟾蜍用2% MS-222麻醉后迅速摘除眼球，清除球外眼組織角膜、晶狀體及玻璃體后，將組織立即投入預冷Bouin，s液固定2 d，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度6 μm，選取過眼球最大直徑的切面， H.E染色后顯微鏡下(BA310 DIGITAL C，MOTIC廈門)觀察并采集數(shù)碼照片(Motic Advanced3.2)和進行顯微測量統(tǒng)計。

1.3 免疫組織化學

眼睛常規(guī)石蠟包埋和切片(同1.2)，經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇復水，PBS(0.01 mol·L-1,pH7.4)沖洗3次,每次5 min，3%H2O2室溫15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗， 正常羊血清封閉室溫1 h，鼠抗GFAP抗體，4℃過夜。PBS沖洗，羊抗兔IgG室溫1 h，辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素室溫1 h，DAB顯色5 min，蘇木精復染，中性樹膠封片。陰性對照切片以正常羊血清替代一抗。顯微鏡下觀察并采集數(shù)碼照片和進行顯微測量統(tǒng)計。

1.4 透射電鏡

中華大蟾蜍用2% MS-222麻醉后迅速摘除眼球，清除球外眼組織角膜、晶狀體及玻璃體后，經(jīng)2.5%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定液中固定2 d，在視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)分別剪取大小2 mm×3 mm視網(wǎng)膜組織塊，經(jīng)1%鋨酸后固定1 h，乙醇-丙酮脫水，Epon812樹脂包埋，半薄切片定位，選取過眼球半徑的切面和過眼球切向的切面進行超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色。電鏡(JEM-100SX型)觀察和采集數(shù)碼圖像。

2 結果與分析

2．1 光鏡下中華大蟾蜍視網(wǎng)膜組織形態(tài)

中華大蟾蜍視網(wǎng)膜常規(guī)組織學觀察可見明顯的內(nèi)界膜(Inner limiting membrane， ILM)與外界膜(Outer limiting membrane， OLM)(圖1)，Müller細胞即分布于視網(wǎng)膜外界膜與內(nèi)界膜之間的區(qū)域。

中華大蟾蜍視網(wǎng)膜組織形態(tài)，H.E染色示視網(wǎng)膜各層結構。RPE,視網(wǎng)膜色素上皮；OLM,外界膜；ONL,外核層；OPL,外網(wǎng)層；INL,內(nèi)核層；IPL,內(nèi)網(wǎng)層；GCL,節(jié)細胞層；NFL,神經(jīng)纖維層；ILM,內(nèi)界膜。

The histological section of retina showing the structure of retina ofBufogargarizansstaining with H.E. RPE,retina pigmented epthelium; OLM,outer limiting menbrane; ONL,outer nuclear layer; OPL,outer plexiform layer; INL,inner nuclear layer; IPL,inner plexiform layer; GCL,ganglion cell layer; NFL,nerve fiber layer; ILM,inner limiting membrane.

圖1 中華大蟾蜍視網(wǎng)膜組織形態(tài)
Fig.1 Structure ofBufogargarizansCantor’s retina

視網(wǎng)膜切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在沿視網(wǎng)膜輻向切面和切向切面上均可見到免疫組化染色呈棕色的陽性結構，在輻向切面上可以觀察到Müller細胞成單層排列，細胞長軸沿著眼球半徑方向成放射狀排列(圖2-A)。在視網(wǎng)膜輻向切面上Müller細胞長度為(62.1±0.54)μm；每100 μm 長度視網(wǎng)膜切面中Müller細胞的密度為(6.2±0.1)個。

Müller細胞胞體位于內(nèi)核層(Inner nuclear layer，INL)中部(圖2-B)，自胞體分別發(fā)出伸向視網(wǎng)膜近玻璃體側和近鞏膜側的至少2個主干突起(Stem processe,sp)。伸向視網(wǎng)膜近玻璃體側的主干突起(Vitread stem processe,vsp)終止于節(jié)細胞層(Ganglion cell layer, GCL)或神經(jīng)纖維層(Nerve fiber layer, NFL)，且其主干終末膨大為圓錐型終足(endfood，ef)(圖2-A)。伸向視網(wǎng)膜近鞏膜側的主干突起(Sclera stem process,ssp)終止于外核層(Uuter nuclear layer,ONL)外側，突起之間相互聯(lián)接包繞在每個光感受器細胞的周圍形成外界膜(圖2-A, 圖2-B)。對內(nèi)網(wǎng)層中的vsp和內(nèi)核層ssp的橫切面的面積和個數(shù)進行了統(tǒng)計。其中內(nèi)網(wǎng)層每100 μm 長度視網(wǎng)膜切面中含vsp個數(shù)為(43.4±0.42)個，每個面積為(3.61±0.32)μm2；內(nèi)核層100 μm 長度視網(wǎng)膜切面中含ssp個數(shù)為(27.8±0.72)個，每個面積為(9.56±0.65)μm2(圖2-C)。

Müller細胞在視網(wǎng)膜中的分布及密度。ef，終足；GCL，節(jié)細胞層；INL，內(nèi)核層；IPL內(nèi)網(wǎng)層；M,Müller細胞胞體；OLM,外界膜；ssp,近鞏膜側主干突；vsp,近玻璃體側主干突起。A、B為沿眼球半徑方向切面，示Müller細胞縱切面突起結構。C為沿眼球切向切面，示Müller細胞突起結構橫切面。

The distribution and density of Müller cell in the retina ofBufogargarizans. ef，endfood；GCL，ganglion cell layer；INL，inner nuclear layer；IPL，inner plexiform layer； M, Müller cell body; OLM, out limiting membrane; ssp, the scleral stem processes; vsp, the vitread stem processes. A,B: Sections cross the radius of eyeball，showing the lognitudinal processes of Müller cell. C:Sections cross the tangent of eyeball，showing tranverse section of Müller cell processes.

圖2 中華大蟾蜍視網(wǎng)膜GFAP免疫組化染色
Fig.2 The retinal section staining by immunohistology with antibody to GFAP

由Müller細胞發(fā)出的2個方向上的主干突起在幾乎橫跨整個視網(wǎng)膜同時,又發(fā)出許多細小的側向分支突起,尤其是在內(nèi)網(wǎng)層(Inner plexiform layer,IPL)與外網(wǎng)層(Outer plexiform layer, OPL)這些側支充滿了神經(jīng)元樹突和軸突之間(圖2-C)。

2．2 電鏡下觀察中華大蟾蜍視網(wǎng)膜Müller細胞

在透射電鏡下，視網(wǎng)膜內(nèi)、外核及節(jié)細胞層對其進行了細致的觀察。外核層及視錐、視桿細胞層中(圖3-A、3-B)，Müller細胞胞突向外伸至視錐、視桿細胞外側與內(nèi)節(jié)之間，形成Müller細胞的近鞏膜側突起ssp，突起內(nèi)有細絲，應為細胞內(nèi)的GFAP纖維(圖3-B)。Müller細胞外側突起頂端之間、Müller細胞外側突起與視細胞內(nèi)節(jié)之間及視細胞內(nèi)節(jié)與內(nèi)節(jié)之間有連接復合體，共同構成外界膜如圖中箭頭所示(圖3-A)。外界膜并不是一層膜，而是由細胞與細胞之間的連接結構粘連小帶所構成。在內(nèi)核層中可見Müller細胞(圖3-B中M示Müller細胞)較其他內(nèi)核層中細胞深染，突起內(nèi)也可見明顯的纖維成分。

A. 箭頭所示為外界膜，E為光感受器橢球體，Pn為光感受器細胞核。B. M為內(nèi)核層中的Müller細胞，INL為內(nèi)核層，Pn為光感受器細胞核，ssp為包繞在光感受器細胞外的Müller細胞近鞏膜側突起。C. ef為終足，GC為節(jié)細胞核，IPL為內(nèi)網(wǎng)層，vsp為內(nèi)核層中的Müller細胞近玻璃體側突起。

A.Arrows showing the outer limiting membrane；E，ellipsoid body of photoreceptor cell；Pn，the nuclear of photoreceptor cell ；B. M，Müller cells ；INL，inner nuclear layer；ssp，the scleral stem processes. C. ef，endfood；GC，ganglion cell nuclear；IPL，inner plexiform layer； vsp, the vitread stem processes.

圖3 中華大蟾蜍視網(wǎng)膜電鏡觀察
Fig.3 The structures of Müller cells ofBufogargarizanson electron microscopy

內(nèi)網(wǎng)層中Müller細胞的近玻璃體側突起vsp較該層中神經(jīng)細胞突起粗且染色深(圖3-C)，vsp及其分支在節(jié)細胞層中伸于節(jié)細胞核之間，形成神經(jīng)元周圍的微環(huán)境。vsp末端膨成錐形，形成終足。終足的底部彼此相互連接共同組成視網(wǎng)膜內(nèi)界膜。內(nèi)界膜直接與玻璃體相鄰，將視網(wǎng)膜細胞與玻璃體隔開。

3 結論與討論

對Müller細胞形態(tài)和分布的研究過去多采用硝酸銀浸染法，但這種方法過程復雜，且結果不穩(wěn)定。以后又出現(xiàn)了特殊的染色法，以及活性染料視網(wǎng)膜整染法[25]。在對人視網(wǎng)膜研究中曾有利用烯醇化酶NNE(Non-neuronal enolase)抗體來顯示膠質(zhì)細胞的[23]，但人視網(wǎng)膜中還有其他類型的膠質(zhì)細胞，且烯醇化酶(Enolase)是糖酵解過程中重要的酶，與細胞的代謝過程密切相關，膠質(zhì)細胞染色結果受細胞生理狀態(tài)影響。

本研究利用免疫組化法顯示視網(wǎng)膜中的GFAP陽性細胞即Müller細胞，在脊椎動物視網(wǎng)膜中存在的膠質(zhì)細胞類型不完全與腦組織中的相對應，且因動物進化地位不同而不同，少突膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞是在腦組織中存在的2種大膠質(zhì)細胞(macroglia)，少突膠質(zhì)細胞在大多數(shù)動物視網(wǎng)膜中完全沒有分布，星型膠質(zhì)細胞僅存在于哺乳動物視網(wǎng)膜中，而且星型膠質(zhì)細胞僅分布于哺乳動物視網(wǎng)膜的NFL；對兩棲動物豹蛙(Rana pipiens)研究發(fā)現(xiàn)Müller細胞是視網(wǎng)膜中唯一觀察到的膠質(zhì)細胞[22]。另外，本研究觀察到的GFAP細胞個體大，其突起橫跨整個視網(wǎng)膜層，胞體位于內(nèi)核層，完全符合 Müller細胞的特征[14-25]。因此，利用抗GFAP抗體顯示兩棲類的Müller細胞是一種較好的方法。

本研究觀察到伸向視網(wǎng)膜近玻璃體側的主干突起終末膨大為圓錐型終足，終足圓錐型結構的底部緊貼與玻璃體，此結構特點被認為與兩棲類動物穩(wěn)定細胞外K+濃度有關，光激活視網(wǎng)膜神經(jīng)元,在2個突觸層(IPL和OPL) 誘發(fā) K+濃度增高。這種增高的K+必須被迅速清除,否則神經(jīng)元的興奮性程度會發(fā)生激烈的變動[26]。在兩棲類中Müller 細胞首先將神經(jīng)元釋放的多余的K+攝入細胞內(nèi)，然后通過終足區(qū)將大部分K+轉(zhuǎn)移至玻璃體，這種空間緩沖機制清除多余K+的效率比單純經(jīng)由胞外空間擴散要高1倍以上[26]。

在內(nèi)核層的內(nèi)中間區(qū)，從Müller細胞的胞體發(fā)出放射狀突起，這些堅韌的突起縱貫視網(wǎng)膜全層，幾乎占據(jù)了神經(jīng)細胞所沒有占據(jù)的空間。從形態(tài)學上支持Müller細胞是整個視網(wǎng)膜的支架。在神經(jīng)纖維層，放射狀突起的終末端呈圓錐形膨大，參與內(nèi)界膜的結構。在外核層、內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細胞層，從Müller細胞放射狀突起的側壁發(fā)出帶狀分支，這些分支突起形成網(wǎng)狀，包繞著神經(jīng)細胞的胞體，有利于視網(wǎng)膜微環(huán)境的穩(wěn)定。在外網(wǎng)狀層、內(nèi)網(wǎng)狀層及神經(jīng)纖維層，從Müller細胞放射狀突起的側壁向水平方向發(fā)出細微的分支，這些水平分支包繞著神經(jīng)細胞的樹突、軸突及其突觸。跟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞類似，Müller細胞對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞神經(jīng)沖動的傳遞可能會起到絕緣作用。

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(責任編輯：蔣國良)

Research on morphology of retinal Müller cells inBufogargarizans

YANG Pengfei, ZHAO Liutao, ZHAO Xinfang, YAN Fengbin, DU Baobao, LIU Zhonghu
(Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

The morphology and distribution of neuroglial cells in retina of Amphibian,Bufogargarizanswas shown by light microscopy，transmission electron microscope and immunohistochemical staining method in the retinas of the toads. The results show that there is only one kind of the neuroglial cell the Müller cells within retina.The Müller cells arrayed in regular monolayer, the long axes of cells stretched radially along the radiuses of eyeball. The somata of the Müller cells lay in the inner nuclear layer and gave rise to at least two opposite stem processes，the scleral stem processes (ssp) and the vitread stem processes (vsp).At the ultrastructural level, retinal Müller cells were deeper in color than the surrounding cytoplasm and nuclei of cells and other neural components.There were lots of visible fibers in the Müller cells processes, so the Müller cells were remarkably different from the other neural cells component of retina. The ssp of Müller cells radially oriented to the base of the inner segments of the photoreceptor cells，here ssp enclosed the photoreceptor cells and formed the outer limiting membrane，the vsp of Müller cells lay the inner plexiform layer and ganglion cell layer，the terminal of vsp were adjacent to the surface of the vitreous，and expanded as conical endfeet，the endfeet junctioned each other and form the inner limiting membrane.

Bufogargarizans；retina；Müller cell

2015-05-21

河南省教育廳自然科學基礎與前沿項目(13A240482)

楊鵬飛(1990-)，男，河南汝州人，碩士研究生，從事動物細胞生物學方面的研究。

劉忠虎(1964-)，男，河南博愛人，副教授，博士。

1000-2340(2015)06-0822-05

Q954.6

A