3%苦參堿水劑致突變作用研究

謝貴元，關(guān) 嵐，劉新民，王 安

（1.中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長沙 410078；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤科，長沙 410007）

苦參堿（matrine）是由中草藥植物苦參的根、植株、果實(shí)經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成的天然植物性農(nóng)藥，其主要成分有多種生物堿，以苦參堿、氧化苦參堿含量最高［1］?？鄥A原藥大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮 LD50均>5000mg/kg.bw，對(duì)動(dòng)物和魚類安全，為低毒廣譜殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，對(duì)各種作物上的黏蟲、菜青蟲、蚜蟲、紅蜘蛛等有明顯的防治效果［2-3］?？鄥A急性毒性的研究已有部分報(bào)道，但有關(guān)苦參堿的致突變作用研究少有報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3%苦參堿水劑的致突變作用進(jìn)行了較為全面的研究，為苦參堿農(nóng)藥的生產(chǎn)和安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 3%苦參堿水劑，由國內(nèi)某農(nóng)藥生產(chǎn)廠家生產(chǎn)。樣品為褐色粘稠液體，不溶于水，實(shí)驗(yàn)時(shí)用食用調(diào)和油配制。

1.1.2 受試動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠，體重25.0g ～30.0g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.3 受試菌株、細(xì)胞株、細(xì)胞 鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變菌株（TA97、TA98、TA100和TA102），由中國藥物研究所提供；L5178Y3.7.2c-tk+/-細(xì)胞（小鼠淋巴瘤細(xì)胞株），購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；人外周血淋巴細(xì)胞取自健康成人。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》（GB15670-1995）［4］進(jìn)行。Ames試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法；微核試驗(yàn)采用30 h兩次給藥法；體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因（TK位點(diǎn)）突變試驗(yàn)采用96孔平板法；體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)采用微量外周血培養(yǎng)法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行資料統(tǒng)計(jì)分析，微核率用泊松分布，u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，小鼠淋巴瘤細(xì)胞株（L5178Y）TK基因突變試驗(yàn)和染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間均數(shù)比較，P≤0.05，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗(yàn) 如表1、2所示，受試物各劑量組對(duì)試驗(yàn)菌株在加與不加S-9代謝活化系統(tǒng)條件下，回復(fù)突變數(shù)均未超過自發(fā)回變數(shù)的2倍，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表1 3%苦參堿水劑鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果

表2 3%苦參堿水劑鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 微核試驗(yàn) 各組骨髓多染紅細(xì)胞（PCE）微核率見表3，陰性對(duì)照組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為1.4‰和2.0‰。3%苦參堿水劑各劑量組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分別為0.8‰～1.6‰和1.0‰～2.0‰，與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異（P>0.05）。陽性對(duì)照組雌、雄小鼠骨髓PCE微核率均為25.6‰，與陰性對(duì)照組比較有極顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明，3%苦參堿水劑不引起小鼠骨髓多染紅細(xì)胞染色體斷裂或整條染色體丟失。

2.1.3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因（TK位點(diǎn)）突變試驗(yàn)各劑量組PE0、PE2及MF集落孔數(shù)見表4，各組PE0、PE2、RS%及MF計(jì)算值見表5。由表4可知，在加與不加S9mix條件下，各劑量組MF與其溶劑對(duì)照組比較，差別無顯著性（P>0.05）。陽性對(duì)照組（CP和MMS）MF與其溶劑對(duì)照組比較，差別有極顯著性（P<0.01）。結(jié)果表明，3%苦參堿水劑未引起細(xì)胞突變頻率增高。

2.1.4 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn) 由表6可見，在加S9mix與不加S9mix的條件下，溶劑對(duì)照組人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率分別為1.5%和2.0%。3%苦參堿水劑各劑量組人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率分別為2.0%~3.0%和1.0%~2.5%，與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較，差別均無顯著性（P>0.05）。陽性對(duì)照組（CP和MMS）人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率分別為13.0%和11.5%，明顯高于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)果表明，3%苦參堿水劑不會(huì)引起人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率增高。

表3 3%苦參堿水劑對(duì)小鼠骨髓微核發(fā)生率和PCE/NCE比值的影響

表4 3%苦參堿水劑各劑量組培養(yǎng)板集落孔數(shù)

表5 3%苦參堿水劑體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)結(jié)果

表6 3%苦參堿水劑對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率的影響

3 討論

苦參堿廣泛存在于豆科槐屬植物苦參、苦豆子及廣豆根中，具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗心律失常和免疫調(diào)節(jié)等功能［9-10］，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中苦參堿對(duì)菜青蟲、粘蟲、白菜蚜等多種農(nóng)業(yè)害蟲具有毒殺活性［2-3］。張宏利等［11］應(yīng)用從苦參中分離到苦參堿單體，以小白鼠進(jìn)行毒性測定表明：苦參堿單體對(duì)小鼠的LD50為64.01mg/kg·wb。王曉燕等［12］研究發(fā)現(xiàn) ：經(jīng)腹腔注射純度≥99%的苦參堿，其LD50為157.13mg/kg·wb。體外實(shí)驗(yàn)表明苦參堿有較強(qiáng)的殺精子作用［13-14］，在一定程度上有遺傳毒性作用［15］。

致突變試驗(yàn)通常采用反映基因突變、體細(xì)胞突變和反映遺傳危害（生殖細(xì)胞突變）的配套試驗(yàn)來檢測外來化合物的誘變性。本實(shí)驗(yàn)采用微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因（TK位點(diǎn)）突變試驗(yàn)及體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)檢測3%苦參堿水劑的誘變性。研究結(jié)果顯示：在加與不加S-9代謝活化系統(tǒng)條件下，給予鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變菌株1250～5000μg/皿劑量受試物，其回復(fù)突變數(shù)均未超過自發(fā)回變數(shù)的2倍，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系。雌、雄鼠以97.5～1580mg/kg劑量受試物染毒，各劑量組的微核率與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異，不引起小鼠骨髓多染紅細(xì)胞染色體斷裂或整條染色體丟失。L5178Y TK+/--3.7.2C細(xì)胞給予25～200mg/kg劑量受試物，各劑量組MF與其溶劑對(duì)照組比較，差別無顯著性（P>0.05），未引起細(xì)胞突變頻率增高。給予77.81μg /mL、156.2μg/mL、312.5μg /mL劑量的受試物，各劑量組人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變率與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較，差別均無顯著性。

結(jié)果表明：在本實(shí)驗(yàn)條件下，3%苦參堿水劑未見致突變作用。

［1］劉梅, 劉雪英, 程建峰. 苦參堿的藥理研究［J］. 中國中藥雜志, 2003,28 (9): 801-804.

［2］鄭永權(quán), 姚建仁, 邵向東. 苦參化學(xué)成分及農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究概況［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2000, 21 (1): 24-26.

［3］袁靜, 呂良忠, 叢斌, 等. 苦參生物堿殺蟲生物活性測定［J］. 農(nóng)藥,2004, 43(6): 284-287

［4］《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》 GB15670-1995.

［5］OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Test No. 476: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test. 1997.

［6］《化學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)方法》 GB/T 21794-2008.

［7］OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Test No. 473: In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test. 1997.

［8］Swam T1 Secondary compounds as protective agents. Ann Rev Plant Physiol, 1977, (28): 597-501.

［9］殷忠東, 孫學(xué)剛, 金君梅. 苦參藥理研究進(jìn)展［J］. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 1999, 6(9): 17-18.

［10］張宏利, 張躍進(jìn), 韓崇選, 等. 苦參生物活性研究進(jìn)展［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 31(5): 31-37.

［11］張宏利, 楊清娥, 楊學(xué)軍, 等. 苦參堿的提取分離及對(duì)小鼠的毒性研究［J］. 西北植物學(xué)報(bào), 2005, 25(8): 1649-1652.

［12］王曉燕, 梁磊, 常建蘭, 等. 苦參堿對(duì)小鼠的毒性研究［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 30(9): 2154-2155.

［13］杜俊杰, 郭仁輿, 劉勝家, 等. 苦參堿的體外殺精子作用［J］. 西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 17(3): 388-389.

［14］蘇景利, 盧瑩, 榮向路, 等. 苦參堿口服給藥對(duì)小鼠精子活性的影響［J］. 海峽藥學(xué), 2007, 19(9): 16-19.

［15］姚玉娜, 劉萍, 王淑娥, 等. 苦參素對(duì)小鼠的急性毒性和外周血紅細(xì)胞微核和精子畸變試驗(yàn)［J］. 癌變·畸變·突變, 2004, 16(2):110-113.