可注射骨修復(fù)材料的骨組織反應(yīng)評(píng)價(jià)＊

張智星， 馮祥禮， 毛 靖△， 肖建中， 邱進(jìn)俊， 劉承美

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，武漢 430030

2湖北省中醫(yī)院口腔科，武漢 430061

3華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430079

4華中科技大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢 430079

可注射骨修復(fù)材料的骨組織反應(yīng)評(píng)價(jià)＊

張智星1， 馮祥禮2， 毛 靖1△， 肖建中3， 邱進(jìn)俊4， 劉承美4

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，武漢 430030

2湖北省中醫(yī)院口腔科，武漢 430061

3華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430079

4華中科技大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢 430079

目的 研究自制的可注射骨修復(fù)材料植入兔股骨缺損區(qū)后的骨組織反應(yīng)特點(diǎn)。方法 選用25只新西蘭大白兔，在其雙側(cè)股骨內(nèi)髁制作標(biāo)準(zhǔn)骨缺損區(qū)模型，分別注射不飽和聚磷酸酯／β－磷酸三鈣復(fù)合物（UPPE／β－TCP）和添加1%四環(huán)素的UPPE／β－TCP復(fù)合物（UPPE／β－TCP／TTC），按2、4、8、12、24周的植入期分為5組，對(duì)骨組織樣本進(jìn)行組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察，并比較各期植入體的吸收率。結(jié)果 在各植入期內(nèi)，UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC兩種復(fù)合物的骨組織反應(yīng)基本一致。植入2周時(shí)，所有材料和周圍骨組織均未發(fā)生明顯的吸收或改建，植入體未引起周圍骨組織的炎性反應(yīng)和壞死；4周時(shí)植入體與骨缺損區(qū)結(jié)合良好，無(wú)纖維結(jié)締組織囊形成，在材料發(fā)生吸收而改建的區(qū)域，可見成骨細(xì)胞、新生血管和活躍的新骨形成；8周時(shí)大部分植入體仍存在于骨缺損區(qū)內(nèi)，部分植入體成為“獨(dú)島”被完全整合進(jìn)入新生的骨組織中；12周時(shí)骨組織有廣泛的重建；24周時(shí)植入體主體部分消失，骨組織內(nèi)的生長(zhǎng)和改建更加活躍，新生骨和骨髓樣組織中可見大量材料碎片，并可見成骨樣細(xì)胞。2種復(fù)合物植入骨缺損區(qū)后的吸收率均隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在8周以前其吸收率相似（P＞0.05），而12周時(shí)UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物組的吸收率高于UPPE／β－TCP復(fù)合物（P＜0.05），24周時(shí)2種復(fù)合物的吸收率均在60%以上。結(jié)論 可注射骨修復(fù)材料UPPE／β－TCP復(fù)合物在動(dòng)物體內(nèi)具有良好的骨組織生物相容性、生物可降解性和體內(nèi)骨引導(dǎo)性，可作為修復(fù)骨缺損的新型復(fù)合材料。

β－磷酸三鈣； 不飽和聚磷酸酯； 骨缺損； 骨修復(fù)； 吸收率

引導(dǎo)骨組織再生的經(jīng)典方法是使用骨移植物修復(fù)骨缺損。目前，自體骨的成骨性和再生能力仍被認(rèn)為是骨移植材料的金標(biāo)準(zhǔn)，但取骨時(shí)的創(chuàng)傷及自體骨移植后可能發(fā)生的吸收等缺陷限制了其在引導(dǎo)骨組織再生治療中的應(yīng)用。使用異體骨移植也是修復(fù)骨缺損的一種常用方法，但實(shí)際的骨再生效果在研究中存在較大的爭(zhēng)議［1］，因此，組織工程材料仍是目前引導(dǎo)骨組織再生的研究熱點(diǎn)，其基本原理是將可生物降解的聚合物支架充填入骨缺損區(qū)，作為細(xì)胞粘附和增生、分化的臨時(shí)居所，緩慢降解后即可為新生的骨組織所替代［2］。本課題組已自行研制成功用于骨修復(fù)的新型控釋性可生物降解聚合物材料——不飽和聚磷酸酯（unsaturated polyphosphoester，UPPE），且前期已對(duì)UPPE聚合物及不飽和聚磷酸酯／β－磷酸三鈣復(fù)合物（UPPE／β－TCP）的理化性能、體外可降解性和體外細(xì)胞毒性等方面進(jìn)行了檢測(cè)，證明其具有良好的生物安全性、生物相容性、藥物控釋性、可注射性和可降解性［36］，有望用作引導(dǎo)骨組織再生工程材料。本研究旨在評(píng)價(jià)這種新型可注射骨修復(fù)材料——UPPE／β－TCP復(fù)合物——植入兔體內(nèi)的骨組織反應(yīng)，以明確材料處于體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境時(shí)的生物學(xué)變化和行為，評(píng)價(jià)其在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)相容性、生物可降解性和生物學(xué)有效性，為進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 可注射骨組織修復(fù)材料的制備方法

1.1.1 UPPE／β－TCP復(fù)合物的制備 UPPE和β－TCP顆粒（100目）均由華中科技大學(xué)合成。將1.0 g UPPE完全溶解在0.48 g交聯(lián)劑N－乙烯基吡咯烷酮（N－vinyl pyrrolidone，NVP）中，然后混入0.018 g促進(jìn)劑N，N－二甲基苯胺，接著加入2.5 g氯化鈉和1.0 gβ－TCP攪拌均勻形成糊劑；另取0.22 g NVP加入0.006 g過(guò)氧化苯甲酰引發(fā)劑形成溶解液。上述各制劑組分均經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒，使用前將2份試樣放入無(wú)菌容器中混合，攪拌均勻后，迅速用無(wú)菌注射器注入已制備好的標(biāo)準(zhǔn)骨質(zhì)缺損模型中，待其在常溫下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)10 min后，即形成交聯(lián)的UPPE／β－TCP復(fù)合物骨植入體。

1.1.2 含1%四環(huán)素（tetracycline，TTC）的UPPE／β－TCP復(fù)合物的制備 TTC為分析純，購(gòu)自Sigma公司（St.Louis，MO，USA）。同法制備UPPE／β－TCP糊劑，使用時(shí)按重量比在糊劑中添加1%的TTC，迅速用無(wú)菌注射器注入已制備好的標(biāo)準(zhǔn)骨質(zhì)缺損模型中，待其在常溫下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)10 min后，即可形成含1%TTC的UPPE／β－TCP交聯(lián)復(fù)合物（UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物）植入體。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循“中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例”中的規(guī)定對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)、管理和使用。

選擇25只骨骼發(fā)育成熟的4～5月齡雄性新西蘭大白兔，體重約為3.5 kg，將其分別單獨(dú)飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，自由進(jìn)食和飲水，要求每只動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前在本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心有至少7 d的飼養(yǎng)期，以適應(yīng)新環(huán)境。將所有大白兔按2、4、8、12、24周的植入期分為5組，每組5只，選擇股骨內(nèi)側(cè)髁，左右隨機(jī)選擇注射UPPE／β－TCP復(fù)合物和UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物，共在骨組織中注射50個(gè)復(fù)合物樣本，為預(yù)防術(shù)后感染，每只均在術(shù)前和術(shù)后24 h內(nèi)肌肉注射20萬(wàn)單位的青霉素。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)方法按體重0.1 m L／kg的劑量用0.5%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定，取股骨下端的內(nèi)側(cè)作為術(shù)區(qū)。備皮后碘伏消毒，在股骨遠(yuǎn)中內(nèi)側(cè)作2～3 cm長(zhǎng)的切口，縱向切開膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)的皮膚、皮下組織，分離骨膜，暴露股骨內(nèi)側(cè)髁，在生理鹽水持續(xù)冷卻的條件下用牙科種植機(jī)以不超過(guò)450 r／min的轉(zhuǎn)速由內(nèi)向外在內(nèi)側(cè)髁制備約2 mm的洞型，再用直徑逐漸增大（2～4 mm）的骨鉆逐級(jí)將洞型擴(kuò)大，最后形成直徑為4 mm、深為6 mm的圓柱形骨質(zhì)缺損區(qū)，挖匙去盡骨質(zhì)碎屑，生理鹽水沖洗，充分止血后在左右側(cè)缺損區(qū)隨機(jī)注射UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC兩種復(fù)合物糊劑，注射時(shí)應(yīng)采取從底部向表面逐級(jí)后退的方式。等待約10 min，材料完全固化后去除多余的材料，無(wú)菌生理鹽水沖洗，分層嚴(yán)密縫合骨膜及軟組織（圖1）。

1.3 觀察分析指標(biāo)

手術(shù)后需密切觀察動(dòng)物的飲食、活動(dòng)和傷口愈合狀況等。分別在植入術(shù)后2、4、8、12、24周將動(dòng)物麻醉處死，完整切取復(fù)合物植入體與周圍的組織，大體觀察復(fù)合物與周圍組織的融合情況及骨組織形成情況后，再將樣本置于10%的緩沖型甲醛溶液中固定24 h，置于25%的EDTA溶液中脫鈣，50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級(jí)梯度脫水，二甲苯浸泡脫脂，石蠟包埋，垂直于植入體長(zhǎng)軸切取5μm左右的切片，每個(gè)樣本至少取3個(gè)切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察骨缺損區(qū)材料及其周圍與宿主骨結(jié)合部的組織學(xué)反應(yīng)和成骨情況，并使用圖像分析軟件（Image－Pro Plus Version 4.5，MediaCybernetics Inc.，MD，USA）對(duì)各時(shí)期植入骨缺損區(qū)材料的吸收率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量方法如下:植入體吸收率＝（原植入體的橫截面積－剩余植入體的橫截面積）／原植入體的橫截面積×100%。

圖1 動(dòng)物模型的建立Fig.1 Establishment of the animal model

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間的均數(shù)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在術(shù)后約1 h蘇醒，飲水及進(jìn)食情況正常，行動(dòng)正常，在股骨缺損植入?yún)^(qū)周圍未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，如材料暴露、皮膚潰瘍、術(shù)區(qū)感染化膿等，傷口愈合良好，無(wú)骨折發(fā)生及意外死亡情況。

在移植術(shù)后2、4、8、12、24周時(shí)分別取材，并用低速金剛砂鋸垂直于植入體長(zhǎng)軸切開股骨缺損區(qū)，肉眼觀察骨質(zhì)缺損區(qū)的愈合情況，結(jié)果顯示: UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC兩種復(fù)合體修復(fù)骨缺損的大體外觀表現(xiàn)基本一致，在各個(gè)植入期均未引起周圍組織的炎癥反應(yīng)和壞死，圖2為UPPE／β－TCP復(fù)合物植入體樣本各期的大體外觀，可見植入2周后，植入體基本維持其原來(lái)的形狀，且與骨缺損區(qū)結(jié)合致密，在植入體與骨組織間無(wú)纖維囊形成；植入4周后，植入體表面均有骨組織生長(zhǎng)，與材料結(jié)合較好，但植入體開始降解，外形變得不規(guī)則；植入8周后，骨質(zhì)缺損區(qū)有塊狀骨組織形成；12周后，植入體與骨組織的界限已不甚明顯，新形成的骨組織切面呈黃白色，質(zhì)地較硬；24周后，植入體主體已基本消失，新生骨質(zhì)與周圍骨組織緊密結(jié)合，界限無(wú)法分辨。

圖2 股骨缺損區(qū)植入U(xiǎn)PPE／β－TCP復(fù)合物后各期的大體外觀Fig.2 Cross－sectional photographs showing medial condyle of femur after implantation of UPPE／β－TCP composite at different time points

2.2 組織病理學(xué)觀察

在各個(gè)植入期內(nèi)，2種復(fù)合物植入體的組織學(xué)反應(yīng)基本相同，均可見骨組織與材料界面處無(wú)纖維組織囊插入，材料逐漸降解，骨缺損區(qū)內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞存在。圖3為UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物植入體術(shù)后不同時(shí)間的組織病理學(xué)檢查:在2周時(shí)，材料和周圍的骨組織均未發(fā)生明顯的吸收或改建，植入體周圍的骨組織無(wú)炎性反應(yīng)及壞死，骨組織與植入體之間未發(fā)生明顯的反應(yīng)，材料與骨組織交界處的骨小梁與植入體結(jié)合緊密（圖3A）；植入4周后，由于降解而出現(xiàn)的植入體材料孔隙中及其與骨缺損區(qū)交界處開始有新骨形成，新生骨組織鈣化狀況良好，與材料結(jié)合良好，無(wú)纖維結(jié)締組織囊形成，在材料發(fā)生吸收而改建的區(qū)域，可見成骨細(xì)胞和活躍的新骨形成、新生血管（圖3B）；8周之后，大部分植入體仍存在于骨缺損區(qū)，而部分植入體成為“獨(dú)島”被完全整合進(jìn)入新生的骨組織中，兩者交錯(cuò)纏結(jié)在一起，“獨(dú)島”中可見成骨樣細(xì)胞（圖3C）；12周時(shí)骨組織有廣泛的重建，網(wǎng)狀新生骨開始充填骨缺損區(qū)，可見板層骨結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)大量的新生血管為新骨供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)（圖3D）；24周后，植入體主體部分消失，為新生骨或骨髓樣組織替代，新生骨組織結(jié)構(gòu)變得致密（圖3E）。

圖3 UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物植入術(shù)后各期的組織病理切片圖（蘇木精－伊紅染色，×100）Fig.3 Histopathological images of UPPE／β－TCP／TTC composite after implantation at different time points（HE staining，×100）

2.3 復(fù)合物植入體的吸收率

圖4為UPPE／β－TCP復(fù)合物和UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物植入股骨缺損區(qū)后各時(shí)期的吸收率，可見兩組復(fù)合物的吸收率均隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在8周以前其吸收率相近，組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而12周、24周時(shí)UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物組的吸收率高于UPPE／β－TCP復(fù)合物，其間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且24周時(shí)兩種復(fù)合物植入體的吸收率均在60%以上。

圖4 UPPE／β－TCP復(fù)合物和UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物植入骨缺損區(qū)后各時(shí)期的吸收率Fig.4 Resorption rate of UPPE／β－TCP composite and UPPE／β－TCP／TTC composite after implantation at different time points

3 討論

一種生物材料是否可用作骨替代物，在對(duì)骨替代物進(jìn)行體外檢測(cè)合格后，一般還要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以便從組織病理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，獲得骨替代物的成骨性和骨整合性等各項(xiàng)特征，對(duì)材料的生物相容性進(jìn)行完整、真實(shí)的評(píng)價(jià)［78］。骨移植物的作用是給骨缺損區(qū)提供支持、充填缺損區(qū)并促進(jìn)骨的生物學(xué)修復(fù)。目前，許多材料均可引導(dǎo)骨組織的再生，雖然都能夠取得一定的效果，但仍有許多問(wèn)題亟待解決，如材料植入體內(nèi)后的機(jī)械穩(wěn)定性和生物相容性、材料在體內(nèi)降解期間所造成的局部或全身炎癥反應(yīng)、材料是否具有骨傳導(dǎo)或骨誘導(dǎo)等生物學(xué)活性、以及釋放抗生素以改善抗感染效果的能力等［2］。

TTC除具有眾所周知的抑菌活性外，還具有抗炎、抗膠原酶活性及阻止骨吸收等生物學(xué)特性［910］，添加TTC后的骨替代物可以在局部控釋TTC藥物以控制炎癥、防止微生物感染和改善骨修復(fù)效果。本課題組前期已對(duì)UPPE／β－TCP復(fù)合物的體外細(xì)胞毒性和成骨細(xì)胞的活性等進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示UPPE／β－TCP復(fù)合物的宏觀結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能符合作為骨替代物的要求，本研究則旨在評(píng)價(jià)這種新型控釋性可注射骨修復(fù)材料UPPE／β－TCP復(fù)合物植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨組織后的體內(nèi)生物學(xué)相容性，以及添加TTC后對(duì)股骨缺損區(qū)修復(fù)的影響。動(dòng)物模型的建立采用在兔股骨中形成直徑4 mm、深6 mm的缺損然后植入骨替代材料的方法，此方式被廣泛用于評(píng)價(jià)骨組織工程研究的骨組織形成情況［1112］。兩種復(fù)合物材料（UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC）均使用注射器從底部直接注射入骨缺損區(qū)內(nèi)，這樣不但可防止產(chǎn)生氣泡，而且同時(shí)可使植入體與周圍骨組織緊密結(jié)合，防止植入體／骨組織界面處纖維結(jié)締組織的插入，促進(jìn)骨組織的愈合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了此注射方法充填骨缺損區(qū)的優(yōu)勢(shì)，即肉眼可見兩種復(fù)合物均成功地與動(dòng)物模型中的骨缺損區(qū)發(fā)生直接接觸，并在一定的時(shí)期內(nèi)維持其原來(lái)的形狀，作為充填物與骨缺損區(qū)形成骨整合，未發(fā)生組織排斥和明顯的移位現(xiàn)象，符合其他學(xué)者關(guān)于優(yōu)異復(fù)合材料骨組織反應(yīng)的研究結(jié)果［13］。

同時(shí)，本研究的組織病理學(xué)和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果證明:兩組復(fù)合體植入后均未引起骨缺損區(qū)的炎性反應(yīng)，表明其具有良好的體內(nèi)骨組織相容性。植入2周后，復(fù)合體均基本維持其原來(lái)的形狀，與骨缺損區(qū)結(jié)合致密，在植入體與骨組織間無(wú)纖維囊形成，說(shuō)明復(fù)合物的固化未受骨髓腔中血管出血的影響；植入4周后復(fù)合體發(fā)生明顯的降解，新生骨組織在材料與骨缺損區(qū)交界處沉積，并向材料內(nèi)部生長(zhǎng)，證明材料具有較好的骨引導(dǎo)性，且隨著植入期的延長(zhǎng)，材料的吸收率逐漸增加；12周后UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物組的吸收率高于UPPE／β－TCP復(fù)合物，表明UPPE／β－TCP／TTC復(fù)合物所釋放的藥物加速了骨組織的重建和材料的降解，但在長(zhǎng)達(dá)24周的體內(nèi)生物降解過(guò)程中，復(fù)合物植入體周圍的骨組織中均未發(fā)生明顯的炎性反應(yīng)，表明其降解產(chǎn)物也具有較好的生物相容性。因此，可注射骨修復(fù)材料UPPE／β－TCP復(fù)合物在動(dòng)物體內(nèi)具有良好的骨組織生物相容性、生物可降解性和體內(nèi)骨引導(dǎo)性，有望作為修復(fù)骨缺損的新型復(fù)合材料。

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（2015－01－26 收稿）

In Vivo Bone Tissue Response to an Injectable Bone Substitute

Zhang Zhixing1，F(xiàn)eng Xiangli2，Mao Jing1△et al
1Department of Stomatology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2Department of Stomatology，Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China

Objective To assess in vivo bone tissue response to an injectable bone substitute after implantation using a rabbit model.Methods Twenty－five male New Zealand white rabbits were used as experimental animals.The unsaturated polyphosphoester／β－tricalcium phosphate composite（UPPE／β－TCP）and UPPE／β－TCP composite containing 1%tetracycline（UPPE／β－TCP／TTC）were injected in circular defects as created in the femoral condyles of rabbits and were left in place for 2，4，8，12 and 24 weeks.The specimens were evaluated morphologically（histology and histomorphometry）and absorption rate of implant at different time points was compared.Single factor analysis of variance and Tukey’s multiple comparison tests were used to determine statistical significance of results.Results At different implantation stages，gross examination of retrieved implant／bone composite samples indicated that the UPPE／β－TCP composite and UPPE／β－TCP／TTC composite did not evoke inflammatory response，necrosis or fibrous encapsulation in surrounding bony tissues.Histological examination revealed excellent composite／host bone bonding.At 4 weeks，resorption induced voids between terminals of bone defects and implants were largely filled with new bone.Composite resorption，new blood vessels，osteocytes，osteons and osteoblast－like cells lining up with active new bone were observed at remodeling sites.At 12 weeks，a new bone network was developed within femoral defect，while composite became islands incorporated in the new bone.At 24 weeks，bone ingrowth and remodeling activities became so extensive that the interface between residual cement and new bone became less identifiable.In general，the resorption ratio values increased with implantation time.Conclusion These results showed that UPPE／β－TCP composite holds promise for use as a synthetic biodegradable scaffolds for tissue engineering.

β－tricalcium phosphate； unsaturated polyphosphoester； bone defects； bone repair； resorption ratio

R336

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.010

＊國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（No.2006AA03Z0443）

張智星，男，1972年生，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，E－mail:262856134＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:maojing＠hust.edu.cn