P2X2受體在匹羅卡品致慢性癲癇發(fā)作大鼠海馬組織中表達增高＊

劉 艷， 宋鵬輝， 李鋼琴， 黃昭昭， 關(guān)秀軍， 胡 敬， 鄧學軍△

1武漢市第八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430010

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

P2X2受體在匹羅卡品致慢性癲癇發(fā)作大鼠海馬組織中表達增高＊

劉 艷1， 宋鵬輝2， 李鋼琴1， 黃昭昭1， 關(guān)秀軍1， 胡 敬2， 鄧學軍2△

1武漢市第八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430010

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

目的 通過研究匹羅卡品致癲癇大鼠海馬組織中P2X2受體（嘌呤受體）的表達變化，探討其在顳葉癲癇發(fā)病中的作用機制。方法 應(yīng)用氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射建立大鼠顳葉癲癇模型，并予以P2X2受體拮抗劑亮藍G（Brilliant Blue G，BBG）腹腔注射，應(yīng)用Western blot及Real－time PCR技術(shù)檢測大鼠海馬組織P2X2受體的表達，免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠海馬組織中谷氨酸（glutamate，GLU）表達水平。結(jié)果 Western blot及Real－time PCR結(jié)果顯示:慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作組中P2X2表達明顯增高（P＜0.05），BBG干預(yù)組表達減低P＜0.05）。免疫組化檢測顯示:GLU在BBG干預(yù)組較慢性自發(fā)性發(fā)作組中釋放減少（P＜0.05），且與BBG劑量呈負相關(guān)性。結(jié)論 P2X2受體通路可能參與顳葉癲癇的發(fā)病過程，并有望成為新一代治療顳葉癲癇的藥物靶點。

顳葉癲癇， P2X2受體， 亮藍G， 谷氨酸

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，盡管目前已有多種抗癲癇藥物應(yīng)用于臨床，但仍有三分之一的癲癇患者出現(xiàn)復發(fā)情況。顳葉癲癇是成人癲癇類型中最易復發(fā)的，約80%患者的癲癇發(fā)作未能完全控制［1］。

ATP是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮多種生物學功能。ATP受體包括促離子型的P2X受體和促代謝型的P2Y受體［23］。P2X受體的所有亞型均在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達，其中，P2X2受體多表達于神經(jīng)元細胞［4］。作為突觸傳遞的中間部分，P2X受體不僅參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸可塑性的調(diào)節(jié)，也可參與神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間及神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間的聯(lián)系［5］，但其是否參與慢性癲癇發(fā)作尚未可知。本實驗采用匹羅卡品致癇模型，檢測慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作大鼠海馬組織中P2X2受體及谷氨酸（glutamate，GLU）的表達，旨在闡明P2X2受體在慢性癲癇大鼠海馬組織的變化及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗研究符合華中科技大學實驗動物管理條例的相關(guān)規(guī)定，并獲得華中科技大學實驗動物倫理委員會批準。在實驗研究過程中，盡最大努力為實驗動物創(chuàng)造最舒適的環(huán)境并減少實驗動物在實驗操作中所承受的痛苦。本實驗使用SD雄性大鼠90只，體重范圍為200～250 g，均來源于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部。飼養(yǎng)環(huán)境標準為:溫度維持在24～25℃，濕度維持在50%～60%，人為創(chuàng)造12 h晝夜交替，并保證充足的飲用水以及飼料供應(yīng)。

1.2 實驗試劑

主要試劑與材料:氯化鋰（Sigma－Aldrich公司）；鹽酸匹羅卡品（Sigma－Aldrich公司）；硫酸阿托品針劑（購自上海禾豐制藥有限公司）；安定針劑（購自天津制藥有限責任公司）；10%水合氯醛（購自武漢協(xié)和醫(yī)院藥劑科）；兔抗P2X2受體一抗（美國Abcam公司）；亮藍G（BBG，Sigma－Aldrich公司）；氯化鋰粉劑以及鹽酸匹羅卡品粉劑均采用生理鹽水（購自青島華仁藥業(yè)有限公司）溶解后，于室溫避光保存。Nondrop2000微量分光光度計（Thermo公司）；實時熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.3 大鼠顳葉癲癇動物模型構(gòu)建

1.3.1 實驗分組及模型構(gòu)建 SD雄性大鼠90只，隨機選取6只腹腔注射生理鹽水為正常對照組，進行癲癇模型制作的大鼠共84只，分批給予大鼠腹腔注射氯化鋰溶液預(yù)處理（127 mg／kg），17.5 h后，腹腔注射硫酸阿托品（1 mg／kg），30 min后，腹腔注射匹羅卡品水溶液（15 mg／kg）。4只于注射藥品時死亡，余80只分批建立顳葉癲癇模型，依其行為學改變確定癲癇鼠模型，共有63只（75.0%）大鼠出現(xiàn)急性癲癇發(fā)作，急性期內(nèi)大鼠未見進食，其中13只因未能及時終止而死亡；44只誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠在24 h后進入潛伏期，行24 h視頻監(jiān)測，最終確定出現(xiàn)慢性自發(fā)性癇性發(fā)作的大鼠28只（33.3%），隨機分為4組:癲癇模型組（注射生理鹽水）、BBG 50 mg／kg組、BBG 100 mg／kg組、BBG 200 mg／kg組（每組7只），依組別給予相應(yīng)藥物2周。

1.3.2 行為學觀察 癲癇發(fā)作嚴重程度參照Racine分級標準劃分為5個等級:①咀嚼運動，即面部肌肉抽搐；②規(guī)律性點頭運動；③前肢的陣攣運動；④四肢的陣攣運動以及站立不穩(wěn)；⑤大鼠旋轉(zhuǎn)、全身陣攣及左右搖晃跌倒。模型建立成功的標準為大鼠發(fā)作等級必須達到≥4級的分級標準。若大鼠癲癇發(fā)作嚴重程度＜4級，則按30 min的時間間隔以質(zhì)量分數(shù)為15 mg／kg的標準再次注射匹羅卡品溶液。經(jīng)4次注射匹羅卡品后（總劑量為60 mg／kg），大鼠仍未達到≥4級的發(fā)作，則不再注射。成功誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠，在其癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)1 h后，以腹腔注射安定（10 mg／kg）終止癲癇持續(xù)狀態(tài)［6］。

1.4 實驗方法

1.4.1 腦電圖監(jiān)測 大鼠麻醉后，常規(guī)固定四肢于木板上，按常規(guī)方法檢測腦電圖。

1.4.2 Western blot檢測P2X2受體 取各組冷凍海馬組織塊常規(guī)裂解提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白濃度，以每孔20μg的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h后，以兔抗P2X2受體一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗（10 min ×3次），以辣根過氧化物酶標記的二抗（武漢谷歌生物有限公司）室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，以β－actin為內(nèi)參拍照分析。

1.4.3 Real－time PCR檢測P2X2受體 取約100 mg冰凍大鼠海馬組織提取RNA，測定RNA濃度及純度（A260／280在1.80～1.95之間），逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板后，以β－actin作為內(nèi)參，按照PCR試劑盒SYBR GreenⅠ的操作說明行cDNA擴增，采用2－ΔΔCt法進行PCR數(shù)據(jù)分析［78］。同一實驗重復3次，取其平均值。引物序列如下:P2X2 receptor F: TCTGGGACTACGAGAC－GCCTAA；R:CGAAGTAAAGCAGGATGAGAAGC；β－actin F:TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG；R:GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG。

1.4.4 免疫組織化學技術(shù)檢測谷氨酸 大鼠腦組織石蠟切片采用梯度乙醇常規(guī)脫蠟，修復抗原，0.01 mol／L PBS緩沖液漂洗（5 min×3次），0.3% H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性（15 min），山羊血清封閉（20 min，室溫），兔抗谷氨酸一抗（1∶500）4℃孵育過夜，使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，PBS漂洗后二抗室溫孵育40 min。免疫組化染色采用SABC法，DAB顯色，蘇木精復染。每張切片在相同放大倍數(shù)（×200）、相同光強度下拍攝，經(jīng)灰度調(diào)節(jié)后用Image－Pro plus 6.0測量切片上陽性反應(yīng)物的平均吸光度值。用平均吸光度值表示陽性顆粒表達強度。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)輸入SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差（AVONA）分析，兩兩比較采用SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦電圖記錄

選用水合氯醛為鎮(zhèn)靜劑來麻醉大鼠，以行頭皮腦電圖。大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛后，束縛固定于操作臺上，2枚針灸針作為電極，插入與顳葉相對的頭皮處（位于內(nèi)耳門前方0.65 cm，中線旁0.4 cm），參考電極置于兩眼外眥連線之間的皮下。腦電圖信號經(jīng)0.53 Hz及30 Hz的頻率濾波后，輸入腦電信號采集系統(tǒng)。正常對照組的腦電圖波形主要以α波為主，并伴有低幅度的β波及少量的δ波，幾乎未捕捉到棘波發(fā)放。慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠的腦電圖出現(xiàn)較為規(guī)律的棘波發(fā)放，其頻率多集中于28 Hz，波幅不高于200μV。BBG干預(yù)組的腦電圖特點為在各個簇狀棘波發(fā)放的波形后存在平直線性波形（圖1）。

圖1 典型腦電圖記錄Fig.1 Typical electroencephalogram record of rats

2.2 行為學觀察

共90只SD雄性大鼠，6只為正常對照組，腹腔注射匹羅卡品后，與對照組相比，大鼠出現(xiàn)明顯的行為學異常，包括口部運動、點頭運動、濕狗樣抖動，采用BBG干預(yù)后，大鼠慢性自發(fā)性發(fā)作頻率有所減少、癲癇樣發(fā)作程度減弱，本實驗未進行具體發(fā)作次數(shù)統(tǒng)計。

2.3 Western blot檢測

Western blot結(jié)果示，慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作組P2X2受體蛋白表達較正常對照組明顯增多（P＜0.05），BBG干預(yù)后，P2X2受體表達減低，且與BBG劑量呈負相關(guān)，見圖2。

圖2 Western blot檢測大鼠海馬組織中P2X2受體表達Fig.2 Detection of P2X2 receptor expression in rat hippocampus by Western blotting

2.4 Real－time PCR檢測

PCR結(jié)果顯示在慢性自發(fā)性發(fā)作組中，P2X2基因表達量明顯高于對照組（P＜0.05），而BBG干預(yù)組中，P2X2基因表達量降低，且與BBG劑量呈負相關(guān)，見圖3。

圖3 RT－PCR檢測大鼠海馬組織中P2X2受體mRNA表達Fig.3 Detection of P2X2 receptor mRNA in rat hippocampus by RT－PCR

2.5 免疫組化染色

大鼠海馬組織谷氨酸免疫組化染色顯示:慢性自發(fā)性發(fā)作組海馬組織CA1、CA3區(qū)谷氨酸水平明顯高于對照組（P＜0.05），在BBG干預(yù)組中，該部位的谷氨酸水平則顯著下降，且與BBG的劑量呈負相關(guān)，見圖4。

圖4 免疫組化檢測海馬組織CA1、CA3區(qū)域谷氨酸表達（×200）Fig.4 Immunohistochemical staining for GLU in CA1 and CA3 regions in rat hippocampus（×200）

3 討論

癲癇是一種由神經(jīng)元異常放電所引起的以反復癇性發(fā)作為特征的疾病，顳葉癲癇則是臨床上最常見的難治性癲癇［9］。在眾多的癲癇造模中，因腹腔注射氯化鋰－匹羅卡品能從癥狀及病理改變上高度模擬人顳葉癲癇，如，出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作、海馬區(qū)神經(jīng)元丟失和星形膠質(zhì)細胞聚集等［10］，兼之具有簡單可行、對動物所造成的痛苦較小等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于實驗研究。顳葉癲癇的發(fā)生與腦組織形態(tài)、功能異常密不可分，發(fā)病機制涉及海馬硬化、苔蘚纖維出芽、皮質(zhì)發(fā)育畸變、膠質(zhì)細胞過度增生、神經(jīng)元微環(huán)境紊亂［1113］等。目前研究認為，匹羅卡品致癇機制主要有二:離子通道障礙致使神經(jīng)元持續(xù)去極化［14］和興奮性谷氨酸通路異常［15］。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸的釋放呈現(xiàn)顯著鈣離子依賴性，其與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ－氨基丁酸的平衡在維持腦微環(huán)境中起著重要作用，細胞外谷氨酸的過度蓄積不僅可導致神經(jīng)元興奮性增高，進而出現(xiàn)神經(jīng)元異常放電［16］，而且谷氨酸與突觸后膜上的谷氨酸受體結(jié)合后則能夠激活Na＋、Ca2＋進一步內(nèi)流，最終導致鈣超載而引發(fā)神經(jīng)元死亡［17］。因此，谷氨酸的表達變化也一直是癲癇研究領(lǐng)域的熱點，如何減低癲癇患者腦內(nèi)谷氨酸的含量或是谷氨酸受體的敏感性，進而保護神經(jīng)元，對癲癇治療藥物的研究有著重要的指導意義。

ATP是一種重要的細胞能源物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機體多種生物學功能。P2X受體屬于配體離子門控通道，在外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，ATP作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，能通過與P2X受體結(jié)合發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能［18］。但病理條件下，如發(fā)生腦缺氧、腦缺血、腦外傷或癲癇發(fā)作［1920］時，內(nèi)源性ATP釋放致使細胞外液ATP濃度急劇升高，激活P2X受體后引起細胞膜上陽離子通道（K＋、Na＋、Ca2＋）開放、胞膜通透性增加，陽離子大量內(nèi)流，產(chǎn)生內(nèi)向跨膜電流，使細胞去極化，參與神經(jīng)信號的產(chǎn)生及傳導、突觸可塑性調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌［21］等，而這些電生理及神經(jīng)遞質(zhì)分泌的異常等與癲癇的發(fā)病密切相關(guān)。已有研究報道，P2X受體的不同亞型在癲癇發(fā)作中均有變化，這提示其可能通過多種機制參與了癲癇的發(fā)病、進展，如P2X7受體在匹羅卡品致癲癇大鼠神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達增高［2223］，而應(yīng)用抗P2X7受體抗體則有抗癲癇發(fā)作的作用，盡管在細胞實驗中，并沒有直接檢測到抗P2X7受體抗體能夠影響癇樣放電，但發(fā)現(xiàn)抗P2X1及抗P2X3受體抗體均可影響癲癇放電［24］。P2X受體拮抗劑則被證實有一定的神經(jīng)保護作用，有的還有延緩神經(jīng)衰老疾病的功能［2526］，蘇拉明是一種常用的P2X受體拮抗劑，可滲透血腦屏障，減輕腦缺血所致的損傷，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用［27］。由此得知，P2X拮抗劑在抗癲癇藥物研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。

P2X2受體在神經(jīng)元上的表達豐富，大腦皮質(zhì)、海馬組織、僵核、尾狀核及黑質(zhì)致密部等均可檢測到P2X2受體的表達［28］，提示其在維持神經(jīng)功能方面有重要作用。在該研究中，我們采用腹腔注射匹羅卡品建立慢性自發(fā)性癲癇模型，檢測發(fā)現(xiàn)癲癇鼠海馬區(qū)域P2X2受體、谷氨酸的表達明顯增高，使用P2X2受體阻斷劑BBG后，P2X2受體表達明顯減低，癲癇大鼠的癲癇發(fā)作頻率及程度均有所減輕，同時，免疫組化染色提示，谷氨酸的含量有所減低，且與BBG濃度呈顯著負相關(guān)。由此我們得出，P2X2受體參與了顳葉癲癇的發(fā)病過程，且其拮抗劑有一定的抗癲癇作用，其中機制可能與阻斷P2X2后，細胞內(nèi)外離子流發(fā)生變化有關(guān)，并最終使得突觸間隙興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放減少，但具體P2X2通過何種機制影響谷氨酸的釋放而參與癲癇發(fā)病，及其是否能對神經(jīng)元發(fā)揮直接保護作用仍需進一步研究。

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（2015－03－22 收稿）

Increased Expression of P2X2 Receptor in Hippocampus of Rats with Pilocarpine－induced Spontaneous Recurrent Seizure

Liu Yan1，Song Penghui2，Li Gangqin1et al
1Department of Neurology，The Eighth Hospital of Wuhan，Wuhan 430010，China
2Department of Neurology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To investigate expression of P2X2 receptor in lithium－pilocarpine－treated rats and the possible role it played in temporal lobe epileptis（TLE）.Methods TLE rat model was established by lithium－pilocarpine intraperitoneal injection.Then，brilliant blue G（BBG），a specific P2X2 receptor antagonist was injected intraperitoneally to the TLE rats.The expression of P2X2 receptor and P2X2 receptor mRNA in hippocampus was detected by Western blotting and RT－qPCR respectively，while the level of glutamate（GLU）in hippocampus was assessed by immunohistochemistry.Results The expression of P2X2 receptor in spontaneous recurrent seizure group was significantly increased（P＜0.05），while the expression of P2X2 receptor in the rats treated with BBG was significantly decreased（P＜0.05），concomitantly，a parallel result was investigated in the expression of P2X2 receptor mRNA（P＜0.05）.Furthermore，GLU was also significantly reduced in the BBG group as compared with spontaneous recurrent seizure group（P＜0.05），and it was negatively correlated with the dose of BBG.Conclusion P2X2 receptor may play a critical role in the development of TLE，and could be a potential therapeutic target for the treatment of TLE.

temporal lobe epileptic； P2X2 receptor； brilliant blue G； glutamate

R742.1

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.006

＊武漢市衛(wèi)計委臨床醫(yī)學科研項目（No.WX14A09）

劉 艷，女，1971年生，主任醫(yī)師，E－mail:miss8670＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:dengxuejun1965＠126.com