噬菌體展示庫篩選構(gòu)建血管細(xì)胞黏附分子－1單鏈抗體及其效價(jià)檢測＊

劉純寶， 宋夷齡， 張永學(xué)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，武漢 430022

噬菌體展示庫篩選構(gòu)建血管細(xì)胞黏附分子－1單鏈抗體及其效價(jià)檢測＊

劉純寶， 宋夷齡， 張永學(xué)△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，武漢 430022

目的 從噬菌體重組抗體庫中篩選獲得靶向血管細(xì)胞黏附分子－1（Vcam－1）的單鏈抗體，純化濃縮后進(jìn)行親和性鑒定，并與單克隆抗體效價(jià)進(jìn)行比較。方法 擴(kuò)增Vcam－1基因克隆質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中表達(dá)獲得Vcam－1抗原蛋白，純化后包被免疫管，通過4輪壓力逐漸增大的“吸附－洗脫－擴(kuò)增”過程篩選獲得陽性克隆。對陽性克隆進(jìn)行ELISA檢測，選取效價(jià)高的克隆送予測序并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌進(jìn)行表達(dá)，認(rèn)定高表達(dá)的樣品為最終的陽性克隆。將該陽性克隆轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)單鏈抗體，純化后經(jīng)ELISA檢測并評價(jià)其抗原親和性。結(jié)果 真核細(xì)胞表達(dá)的Vcam－1抗原蛋白的分子量為85～90 k D。以Vcam－1抗原蛋白為免疫原篩選4輪所得的陽性克隆進(jìn)行單噬菌體ELISA檢測，從檢測結(jié)果中選取9個(gè)效價(jià)高的克隆經(jīng)基因測序共獲得3個(gè)序列，其中1個(gè)序列對應(yīng)的克隆高表達(dá)。表達(dá)的單鏈抗體分子量約30 k D，ELISA檢測其對Vcam－1抗原蛋白有較高親和性，效價(jià)較單克隆抗體低。結(jié)論 利用噬菌體展示技術(shù)獲得了靶向Vcam－1的單鏈抗體，為隨后的診斷和治療應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

噬菌體展示； 單鏈抗體； 血管細(xì)胞黏附分子－1； 重組抗體

抗體是疾病診斷和治療的重要工具，抗體的制備經(jīng)歷了多克隆、單克隆和基因工程抗體三個(gè)階段。單克隆抗體克服了多克隆抗體均一性差、易交叉反應(yīng)、安全性不足等諸多缺陷，其較高的特異性使得其診斷和治療的靶向性更專一。多克隆及單克隆抗體均為完整免疫球蛋白分子，分子量約150 k D，進(jìn)入體內(nèi)后不易穿透細(xì)胞，在血液循環(huán)中停留時(shí)間過長，因而限制了其在體內(nèi)的診斷和治療應(yīng)用。單鏈抗體（single chain variable fragment antibody，scFv）是基因工程重組抗體，由抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過人工合成的肽段連接而成，分子量27～30 k D，是遠(yuǎn)小于單克隆抗體的抗體片段［1］。

血管細(xì)胞黏附分子－1（vascular cell adhesion molecule 1，Vcam－1）是免疫球蛋白超家族成員，在活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，炎癥因子（如IL－1，TNF－α）可誘導(dǎo)其表達(dá)［2］。Vcam－1參與炎癥細(xì)胞的活化、遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移病理過程中也有重要作用，對Vcam－1的監(jiān)測可用于粥樣硬化易損斑塊和腫瘤內(nèi)新生血管的評估。

噬菌體展示篩選方法是目前常用的單鏈抗體提取方法，其原理是將外源基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，使抗體展示于噬菌體表面，通過篩選而得到所需單鏈抗體［3］。本研究利用噬菌體展示篩選法獲得了Vcam－1單鏈抗體，并對其親和性進(jìn)行鑒定，為隨后的Vcam－1體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Vcam－1抗原蛋白的制備

以鼠源Vcam－1基因克隆質(zhì)粒（購自北京義翹神州生物公司）為模板，在兩端引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得到2 000 bp左右的產(chǎn)物，膠回收PCR產(chǎn)物并純化。以NheⅠ和XhoⅠ雙酶切膠回收產(chǎn)物，并將其連入同樣酶切的真核表達(dá)載體pRAG1a中，DNA連接酶連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒并命名為p RAG1a－Vcam－1。以熱擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞中。挑取p RAG1a－Vcam－1轉(zhuǎn)化板上的克隆進(jìn)行PCR鑒定，取PCR鑒定片段大小為2 000 bp左右的克隆測序驗(yàn)證。取驗(yàn)證正確的陽性克隆菌落加入培養(yǎng)液中搖菌過夜，用質(zhì)粒中量抽提試劑盒（購自Axygen公司）抽提得到100μg以上質(zhì)粒。

用所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，SDS－PAGE電泳進(jìn)行表達(dá)鑒定。電泳確認(rèn)Vcam－1有表達(dá)后繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，7 d后離心收集表達(dá)上清。0.45μm濾膜處理上清后，用緩沖液平衡的鎳柱純化上清，收集洗脫產(chǎn)物。洗脫產(chǎn)物透析到PBS溶液中，并濃縮至濃度0.5 mg／m L，即得到純化的Vcam－1抗原蛋白。

1.2 單鏈抗體的制備

1.2.1 重組抗體庫的篩選 以提取的Vcam－1抗原蛋白包被免疫管，使用鼠源的噬菌體重組抗體天然庫（購自上海銳勁生物公司，庫容1.5×1010，產(chǎn)物帶E－tag標(biāo)簽）在免疫管中實(shí)施4輪篩選。4輪篩選中免疫管包被的Vcam－1抗原量遞減（依次為10，5，1，0.1μg），PBST（T:0.05%吐溫20）洗滌次數(shù)增加（依次為7，17，37和37次），經(jīng)過“吸附－洗脫－擴(kuò)增”過程將每輪篩選所得的噬菌體置于下一輪篩選條件中，從而使陽性噬菌體得到富集。

1.2.2 陽性克隆的檢測 從第4輪篩選的陽性噬菌體所涂布的2×YT－AG平板上隨機(jī)挑單克隆接種到96孔深孔板，設(shè)立空白對照并培養(yǎng)過夜。從該96孔板中分別對應(yīng)轉(zhuǎn)接20μL至另一含2×YT－A培養(yǎng)液的96孔深孔板，加入輔助噬菌體M13KO7進(jìn)行噬菌體援救。次日離心取上清進(jìn)行單噬菌體酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測。

在單噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)中，96孔板每孔包被Vcam－1抗原200 ng，并在另一96孔板每孔包被500 ng的牛血清白蛋白（BSA）作為對照。ELISA板經(jīng)封閉后，每孔加入噬菌體上清，室溫下放置2 h。PBST洗滌后，每孔加入抗M13－POD抗體（購自上海銳勁生物公司，1∶5 000稀釋），室溫下靜置1 h。PBST洗滌后，加入底物顯色液顯色至合適的時(shí)間，加終止液終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀（BIO－RAD Model－680）讀取各孔在450 nm處的吸光度值。取吸光度值大的孔所對應(yīng)的樣品送予測序，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌進(jìn)行表達(dá)，認(rèn)定高表達(dá)的樣品為最終的陽性克隆。

1.2.3 單鏈抗體的表達(dá)與純化 將所得到的陽性克隆質(zhì)粒熱擊法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞HB2151（購自上海銳勁生物公司），誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)后取單克隆菌落接種至2×YT－AG培養(yǎng)液，至A值為0.5左右時(shí)，離心棄上清，用2×YT－AI培養(yǎng)液重懸沉淀，然后30℃培養(yǎng)20 h，離心收集菌體和上清。

取上清進(jìn)行ELISA檢測，確認(rèn)有單鏈抗體表達(dá)后，接種上述收集的菌體至2×YT－AG培養(yǎng)液，搖菌過夜。次日轉(zhuǎn)接至2 L的2×YT－AG培養(yǎng)液，至A值為0.5左右時(shí)離心棄上清，用2×YT－AI培養(yǎng)液重懸沉淀，30℃培養(yǎng)20 h后，離心收集菌體和上清。取15 m L的離子交換柱，用20 mmol／L p H 5.5的磷酸鹽緩沖液平衡80 mL后將上清上樣，收集流出液并重復(fù)上樣1次，洗脫后收集90 mL洗脫產(chǎn)物，在透析袋中濃縮至4.2 mg／mL，即得到純化的單鏈抗體。

1.3 單鏈抗體的效價(jià)檢測

取2個(gè)96孔板，每孔包被50 ng的Vcam－1抗原，4℃過夜，PBST沖洗后用BSA室溫下封閉2 h。PBST洗滌后第1個(gè)板前3排每孔加入100μL稀釋的Vcam－1單克隆抗體（購自Abcam公司），以2倍逐級(jí)稀釋（濃度依次為2、1、0.5……μg／m L），第4、5、6排每孔加入100μL所制備的單鏈抗體稀釋液，以2倍逐級(jí)稀釋（濃度依次為2、1、0.5……μg／m L），第2個(gè)板前3排加入100μL PBS作為對照，37℃溫育1 h。PBST沖洗后第1個(gè)板前3排加入100μL抗鼠Ig G－HRP二抗（購自Biosharp公司，1∶2 000稀釋），第4、5、6排加入100μL抗E－tag－HRP二抗（購自上海銳勁生物公司，1∶2 000稀釋），第2個(gè)板前3排加入100μL抗鼠IgG－HRP二抗（購自Biosharp公司，1∶2 000稀釋），37℃溫育1 h。PBST洗滌后加入底物顯色液顯色至合適的時(shí)間，用酶標(biāo)儀（BIO－RAD Model－680）讀取各孔在630 nm處的吸光度值。

艦艇、飛行器和車輛對于核動(dòng)力裝置的空間要求遠(yuǎn)高于核能發(fā)電廠，而傳統(tǒng)核聚變反應(yīng)堆體積、重量很大，遠(yuǎn)超這些運(yùn)輸工具的體積和重量限制，難以做成適配于這些需求的移動(dòng)式能量供應(yīng)源。洛馬公司稱該堆的體積僅為同功率傳統(tǒng)托卡馬克裝置的1/10，一座直徑7米、長18米的該型反應(yīng)堆就可實(shí)現(xiàn)200兆瓦的熱功率輸出，運(yùn)行一年所需的燃料量僅為25千克，可以在線補(bǔ)充燃料，無需像裂變堆那樣定期停堆更換燃料棒，可連續(xù)運(yùn)行，大幅提升續(xù)航能力，而且設(shè)計(jì)與建造周期也只有數(shù)月，成本遠(yuǎn)低于大型聚變裝置。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

單鏈抗體的效價(jià)檢測結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式，各組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vcam－1抗原蛋白的電泳鑒定

Vcam－1基因在293細(xì)胞中成功表達(dá)，表達(dá)上清經(jīng)純化后電泳圖（圖1）未見雜帶，所得抗原蛋白分子量為85～90 kD，與文獻(xiàn)［4］一致。

圖1 293細(xì)胞表達(dá)Vcam－1抗原蛋白的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of Vcam－1 antigen protein in 293 cells

2.2 重組抗體庫的篩選滴定

4輪篩選中的噬菌體滴定結(jié)果見表1。

表1 篩選噬菌體滴定結(jié)果Table 1 Titration result of screened phages

從滴定結(jié)果可以看出，隨著篩選壓力的增加（抗原包被量減少，洗滌次數(shù)增加），各輪的回收率仍然顯示出增長趨勢，并且各輪總的噬菌體回收值維持在較高水平，表明目的噬菌體經(jīng)過4輪篩選得到了有效富集，可用于單噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)。

在Vcam－1抗原包被的96孔（12×8）深孔板中每孔加入經(jīng)4輪篩選獲得的陽性噬菌體克隆孵育，其中設(shè)置D7、D8為2×YT－AG培養(yǎng)液空白對照孔，E7、E8為ER2738菌液陰性對照孔，其余各孔為樣品孔。各孔經(jīng)M13－POD抗體孵育并洗滌后用酶標(biāo)儀測在450 nm處的吸光度值。針對Vcam－1抗原蛋白的單噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 單噬菌體ELISA檢測結(jié)果Table 2 Results of single phage ELISA

測得D11的DNA序列為:

ATGGCCGAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGG－ATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTATAGGTACGGTCGATATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTAGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG

2.4 單鏈抗體純化的電泳鑒定

取單鏈抗體的表達(dá)上清在離子交換柱上樣，收集流出液重復(fù)上樣一次。上樣后用緩沖液（20 mmol／L PB，p H 5.5）沖洗30 m L后用緩沖液（20 mmol／L PB，p H 5.5，電導(dǎo)率7.0 ms／cm）洗脫80 m L，收集洗脫液，然后用緩沖液（20 mmol／L PB，p H 5.5，電導(dǎo)率14.2 ms／cm）洗脫90 m L，收集50 m L目標(biāo)產(chǎn)物E1和40 m L目標(biāo)產(chǎn)物E2。二辛可寧酸法（BCA法）測蛋白濃度，E1為0.2 mg／m L。所得樣品經(jīng)電泳后得到結(jié)果見圖2。

圖2 單鏈抗體表達(dá)上清的純化電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of supernatant with scFv expression

從電泳圖可以看出，表達(dá)上清原樣及流出液的電泳雜帶較多，經(jīng)過離子交換柱洗脫，目的蛋白得到了純化，洗脫液E1和E2含雜帶少。表達(dá)的單鏈抗體其分子量在30 k D左右，與文獻(xiàn)［1］基本一致。

2.5 單鏈抗體的ELISA效價(jià)檢測

分別以單鏈抗體和單克隆抗體作為一抗，用ELISA法檢測其對Vcam－1抗原的親和活性。每組設(shè)置6個(gè)濃度梯度以2倍逐級(jí)稀釋（濃度依次為2、1、0.5……μg／m L），且每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度值后計(jì)算各復(fù)孔的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果見表3。

在各濃度梯度下單鏈抗體的效價(jià)與單克隆抗體及陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。由此說明，在ELISA檢測中單鏈抗體對Vcam－1抗原蛋白有親和活性，其效價(jià)較單克隆抗體低。

表3 單鏈抗體與單克隆抗體ELISA檢測結(jié)果（ˉx±s，n＝3）Table 3 ELISA result of sc Fv and monoclonal antibody（ˉx±s，n＝3）

3 討論

抗體是疾病診斷和生物治療的重要組成部分，抗體的發(fā)展經(jīng)歷了多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程重組抗體三個(gè)階段。多克隆抗體通過免疫動(dòng)物提取血清獲得，其親和性可針對不同的抗原決定簇，因此特異性較差。雜交瘤技術(shù)制備而成的單克隆抗體特異性強(qiáng)、純度高，然而雜交瘤細(xì)胞的制備和長期培養(yǎng)有可能使其丟失抗體基因，抗體的異源性也使其不適于人體內(nèi)應(yīng)用?；蚬こ讨亟M抗體保留了抗體的特異性抗原識(shí)別部位而去除了其他部分，降低了抗體分子大小，也減少了免疫原性，基因工程還可改變重組抗體的生化和免疫特性，增加其親和性［5］。重組抗體由于分子量小，其組織穿透性和血液清除速度都大大增加，有利于在診斷性顯像方面的應(yīng)用［6］。單鏈抗體由基因工程將抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接而成，分子量小，可制備成多價(jià)（如二價(jià)的diabody，三價(jià)的triabody，四價(jià)的tetrabody）以增加其親和性［7］，也可連接核素、細(xì)胞毒藥物、肽、脂類、納米顆粒等以提供診斷和治療功能［8］。單鏈抗體的分子量約為30 k D，腎臟清除的分子量閾值約為60 k D，因此單鏈抗體可通過腎臟從體內(nèi)快速清除，在血液的生物半衰期為2～4 h，明顯短于完整的免疫球蛋白分子。單鏈抗體在大腸埃希菌內(nèi)的大規(guī)模生產(chǎn)降低了制備成本［9］，為更多的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供可能。

噬菌體展示篩選方法是獲取單鏈抗體的主要方法。將抗體基因克隆引入到噬菌體載體中可建立不同抗原特異性的抗體文庫（庫容為108～1012），抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋白中并展示于噬菌體表面，通過特定抗原對其篩選可得到含有目的抗體基因的克隆，對篩選的克隆進(jìn)行表達(dá)并純化表達(dá)產(chǎn)物即可獲得目的抗體。控制篩選條件可改變目的抗體的特性［10］，更大的庫容則有助于生成更高親和力和更加特異的抗體［11］。本實(shí)驗(yàn)采用固相篩選的方法經(jīng)4輪包被抗原遞減和洗滌次數(shù)增加的“吸附－洗脫－擴(kuò)增”過程獲得了陽性克隆。固相篩選是較為常用的方法，但其不足在于固相化包被可能影響包被抗原的天然構(gòu)象，不利于篩選出對天然抗原有親和性的陽性克隆［12］。液相篩選不影響抗原表位，且抗原抗體在液相中自由運(yùn)動(dòng)有利于二者相互結(jié)合，提高了篩選效率。噬菌體展示篩選獲得的抗體具有易于篩選、完全人源、可大量制備及易穿透細(xì)胞的特性，可作為人體內(nèi)的靶向載體。目前，通過噬菌體展示文庫篩選的抗體已走向臨床［13］，顯示了其良好的應(yīng)用前景。

單鏈抗體的親和性改進(jìn)是自基因工程重組抗體問世以來一直在進(jìn)行的工作，定向進(jìn)化是構(gòu)建大型文庫獲得高親和性、良好穩(wěn)定性抗體的較好方法［14］。未來綜合性的基因工程技術(shù)將有助于優(yōu)化重組抗體的親和性、內(nèi)化率和穩(wěn)定性，推動(dòng)基于重組抗體的納米顆粒在疾病診斷、治療方面的應(yīng)用［15］。本研究通過ELISA方法驗(yàn)證了單鏈抗體與單克隆抗體的抗原親和性，單鏈抗體活性雖不及完整單克隆抗體分子，但已足夠用于后期實(shí)驗(yàn)研究。

本研究利用噬菌體文庫篩選獲得了靶向Vcam－1的單鏈抗體，后期將用核素、熒光分子等標(biāo)記該單鏈抗體制備顯像探針，示蹤Vcam－1介導(dǎo)的粥樣硬化易損斑塊，用以探究Vcam－1分子在相關(guān)病理過程中的作用。該單鏈抗體的獲得為粥樣硬化的分子影像評估奠定了基礎(chǔ)，有助于克服傳統(tǒng)影像技術(shù)的諸多不足，為粥樣硬化的診斷和治療提供新的無創(chuàng)方法［16］。

［1］ Zeng X，Shen Z，Mernaugh R.Recombinant antibodies and their use in biosensors［J］.Anal Bioanal Chem，2012，402（10）:3027－3038.

［2］ Cook－Mills J M，Marchese M E，Abdala－Valencia H.Vascular cell adhesion molecule－1 expression and signaling during disease:regulation by reactive oxygen species and antioxidants［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（6）:1607－1638.

［3］ Rentero I，Heinis C.Screening of large molecule diversities by phage display［J］.Chimia（Aarau），2011，65（11）:843－845.

［4］ Wellicome S M，Kapahi P，Mason J C，et al.Detection of a circulating form of vascular cell adhesion molecule－1:raised levels in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus［J］.Clin Exp Immunol，1993，92（3）:412－418.

［5］ Altshuler E P，Serebryanaya D V，Katrukha A G.Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity［J］.Biochemistry（Mosc），2010，75（13）:1584－1605.

［6］ Krishnaswamy S，Lin Y，Rajamohamedsait W J，et al.Antibody－derived in vivo imaging of tau pathology［J］.J Neurosci，2014，34（50）:16835－16850.

［7］ Holliger P，Hudson P J.Engineered antibody fragments and the rise of single domains［J］.Nat Biotechnol，2005，23（9）: 1126－1136.

［8］ Weisser N E，Hall J C.Applications of single－chain variable fragment antibodies in therapeutics and diagnostics［J］.Biotechnol Adv，2009，27（4）:502－520.

［9］ Hagemeyer C E，von Zur Muhlen C，von Elverfeldt D，et al.Single－chain antibodies as diagnostic tools and therapeutic agents［J］.J Thromb Haemost，2009，101（6）:1012－1019.

［10］ Geyer C R，McCafferty J，Dübel S，et al.Recombinant antibodies and in vitro selection technologies［J］.Methods Mol Biol，2011，901:11－32.

［11］ Ponsel D，Neugebauer J，Ladetzki－Baehs K，et al.High affinity，developability and functional size:the holy grail of combinatorial antibody library generation［J］.Molecules，2011，16（5）:3675－3700.

［12］ Nimmagadda S V，Aavula S M，Biradhar N，et al.Development of recombinant single－chain variable fragment against hepatitis A virus and its use in quantification of hepatitis A antigen［J］.Biologicals，2012，40（4）:299－308.

［13］ Nelson A L，Dhimolea E，Reichert J M.Development trends for human monoclonal antibody therapeutics［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9（10）:767－774.

［14］ Turner N J.Directed evolution drives the next generation of biocatalysts［J］.Nat Chem Biol，2009，5（8）:567－573.

［15］ Lamdan H，Gavilondo J V，Mu?oz Y，et al.Affinity maturation and fine functional mapping of an antibody fragment against a novel neutralizing epitope on human vascular endothelial growth factor［J］.Mol Biosyst，2013，9（8）:2097－2106.

［16］ 劉純寶，蘭曉莉，張永學(xué).粥樣硬化易損斑塊傳統(tǒng)影像與分子影像檢測與評價(jià)現(xiàn)狀［J］.國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志，2014，38（2）:101－105.

（2014－09－16 收稿）

Screening scFv Specific to Vcam－1 by Phage Display Library and Its Activity Evaluation

Liu Chunbao，Song Yiling，Zhang Yongxue△
Department of Nuclear Medicine，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To screen out single chain variable fragment antibody（scFv）specific to vascular cell adhesion molecule 1（Vcam－1）from phage recombinant antibody library，and to evaluate its activity and compare its activity with full－length monoclonal antibody.Methods Amplification of Vcam－1 was performed by PCR and Vcam－1 gene plasmid was transferred into eukaryotic cells to express Vcam－1 antigen protein.Immune cuvette was coated with purified Vcam－1 antigen，and the positive clones were screened out by 4 rounds of“adhesion－elution－proliferation”process with gradually increasing pressure.The positive clones were tested by ELISA method and high titer clones were chosen for gene sequencing.Then the high－titer clones were transferred into E.coli，and the clone with the highest expression was regarded as the final requisite one.Competent cells were infected by the final requisite clone and sc Fv was expressed.After purification，the activity of scFv was tested by ELISA and its affinity was evaluated.Results Molecular weight of Vcam－1 antigen protein was 85－90 kD.Positive clones were screened out by taking Vcam－1 protein as the antigen，and 9 high titer clones were obtained by single phage ELISA.Gene sequencing of these clones was carried out and 3 sequences were obtained，1 of which got the highest expression.Molecular weight of the expressed sc Fv was about 30 k D.The sc Fv got high affinity to Vcam－1 antigen according to ELISA，in spite of its lower activity than fulllength monoclonal antibody.Conclusion scFv antibody specific to Vcam－1 was successfully obtained from phage display library，which laid the foundation of subsequent in vivo diagnosis and therapy.

phage display； single chain variable fragment antibody； vascular cell adhesion molecule－1； recombinant antibody

R543.1；R541.4

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.004

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81271623）

劉純寶，男，1986年生，博士研究生，E－mail:chunbao_liu＠sina.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:zhyx1229＠163.com