結(jié)核分枝桿菌抗原HBHA在恥垢分枝桿菌中的重組表達(dá)和鑒定＊

余 菲， 尋 陽(yáng)， 田茂鵬， 李華秀， 朱可橙， 袁 野， 滕新棟△， 范雄林△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，第一臨床學(xué)院，武漢 430022

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，武漢 430030

結(jié)核分枝桿菌抗原HBHA在恥垢分枝桿菌中的重組表達(dá)和鑒定＊

余 菲1＃， 尋 陽(yáng)1＃， 田茂鵬2， 李華秀1， 朱可橙1， 袁 野1， 滕新棟2△， 范雄林2△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，第一臨床學(xué)院，武漢 430022

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，武漢 430030

目的 構(gòu)建高效表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原肝素結(jié)合血凝素（HBHA）的重組恥垢分枝桿菌。方法 針對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv株HBHA的編碼基因Rv0475設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)從細(xì)菌基因組中獲取目的基因，并克隆入p ET－30b（＋）載體構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒p ETHBHA，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pETHBHA轉(zhuǎn)化的重組E.coli BL21（DE3）細(xì)菌，Ni柱純化攜帶C－端His標(biāo)簽的HBHA蛋白，并制備鼠源多克隆抗體。PCR擴(kuò)增含自身啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列的Rv0475基因并克隆入大腸埃希菌－分枝桿菌穿梭載體p MV261，構(gòu)建重組分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒p MVHBHA，并經(jīng)酶切鑒定證實(shí)后，電轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌，涂布含卡那霉素的7H11平板，挑選抗性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，15%SDS－PAGE和Western blot鑒定重組恥垢分枝桿菌的表達(dá)。結(jié)果 分別成功構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pETHBHA和重組分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒p MVHBHA；重組蛋白HBHA在大腸埃希菌中成功表達(dá)并純化后，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度為1.912 5μg／μL，用其制備鼠源多抗；證實(shí)HBHA利用其自身的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列在重組恥垢分枝桿菌中表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)HBHA的重組恥垢分枝桿菌，為研究該蛋白參與結(jié)核病的致病機(jī)制和研發(fā)新型疫苗和診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

肝素結(jié)合血凝素（HBHA）； 恥垢分枝桿菌； 結(jié)核病； 表達(dá)

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染所引起的、嚴(yán)重危害人類健康的傳染病之一。卡介苗（M.bovis BCG）是預(yù)防TB的唯一疫苗，但對(duì)成人結(jié)核缺乏預(yù)防能力。肝素結(jié)合血凝素（HBHA）是M.tb的重要毒力因子［1］，其甲基化部分具有重要的免疫學(xué)特性，而大腸埃希菌表達(dá)的HBHA缺少甲基化修飾。恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）無(wú)致病性、生長(zhǎng)快并且可以表達(dá)甲基化修飾的HBHA［2］。鑒于HBHA的重要性，本文采用恥垢分支桿菌的基因工程體系表達(dá)HBHA，以便于對(duì)HBHA進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

M.tb H37Rv，M.smegmatis，大腸埃希菌（E.coli）DH5α和BL21（DE3）菌株，大腸埃希菌－分枝桿菌穿梭表達(dá)載體p MV261，大腸埃希菌表達(dá)載體p ET－30b（＋），由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存。M.tb H37Rv HBHA的編碼基因Rv0475的特異引物P1:5′－TTCCATATGGCTGAAAACTCGAACATTGATGACATCAA－3′（含NdeⅠ酶切位點(diǎn)），P2: 5′－CCCAAGCTTCTTCTGGGTGACCTTCTTGGCCGC－3′（含Hin dⅢ酶切位點(diǎn)），P3:5′－CCCAAGCTTCCGTTGGCCGGCTGTTTTGC－3′（含Hin dⅢ酶切位點(diǎn)），P4:5′－GGAATTCCCAACACGTCGACTCCGAG－3′（含Eco RⅠ切位點(diǎn)），均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）His－Tag柱購(gòu)自美國(guó)GE公司。Taq DNA多聚酶，T4DNA ligase購(gòu)自Fermentase公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Invitrogen公司。DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自華美公司。DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。Middlebrook 7H9、7H11和ADC增菌培養(yǎng)液購(gòu)自Difco公司。C57BL／6小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ig G為二抗購(gòu)自Proteintech公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 HBHA在重組E.coli中的表達(dá)和純化

1.2.1 PCR擴(kuò)增Rv0475基因 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取M.tb H37Rv基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)體系包括:10× PCR緩沖液5μL，MgCl22μL，4×d NTPs 2μL，引物P1和P2各2μL，基因組DNA 5μL，Taq DNA多聚酶2μL，加無(wú)菌去離子水至終體積50μL。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒回收和純化。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pETHBHA的構(gòu)建和鑒定

分別將回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒p ET－30b（＋）用NdeⅠ／Hin dⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后，利用T4DNA ligase連接酶切產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物用熱休克法轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB固體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg／m L）。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取5個(gè)單克隆菌落，分別接種LB培養(yǎng)液（含卡那霉素50μg／m L），37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。保存菌種后，質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒并酶切鑒定。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)一步送上海英駿生物技術(shù)有限公司基因測(cè)序證實(shí)，并命名為p ETHBHA。

1.2.3 重組HBHA蛋白的原核表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pETHBHA轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌。挑取單個(gè)菌落，接種于LB培養(yǎng)液中（含卡那霉素50μg／m L），37℃培養(yǎng)16 h。按照1∶20的比例放大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)2 h（振蕩速度200 r／min）后，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。分別將誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、誘導(dǎo)菌超聲裂解，獲取菌體上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，證實(shí)表達(dá)目的蛋白及其可溶性。采用Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）His－Tag柱純化目的蛋白。產(chǎn)品的最終濃度采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。

1.3 制備小鼠抗HBHA的多克隆抗體

將純化的HBHA重組蛋白100μg／100μL，與等體積的弗氏不完全佐劑混勻、乳化，背部皮下多點(diǎn)注射免疫C57BL／6小鼠。首次免疫劑量為200μg／只，間隔2周，加強(qiáng)免疫2次，免疫劑量為100μg／只，末次免疫后2周，處死小鼠，收集血清，分裝，－20℃保存待用，并用ELISA法測(cè)定血清中抗體滴度。

1.4 HBHA在重組恥垢分枝桿菌中的表達(dá)和鑒定

1.4.1 重組分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒p MVHBHA的構(gòu)建和鑒定 利用引物P3和P4，參照1.2.1的方法和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增含自身啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列的Rv0475。將回收純化的PCR產(chǎn)物和p MV261分別用Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切、回收后，利用T4DNA ligase連接酶切產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α。涂布于含卡那霉素（終濃度25μg／m L）的LB瓊脂平板。37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取卡那霉素抗性菌落，分離純化后進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。用Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切鑒定證實(shí)。陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為p MVHBHA。

1.4.2 制備M.smegmatis的感受態(tài)和電轉(zhuǎn)化 參考課題組發(fā)表的文獻(xiàn)［3］，制備M.smegmatis感受態(tài)，即:將M.smegmatis接種于10 m L 7 H9培養(yǎng)液，添加10%的ADC，37℃培養(yǎng)3 d，5 000 r／min離心10 min，收集細(xì)菌，用10 m L冰冷的10%甘油滅菌水溶液清洗菌體后，離心、棄上清。用2 m L冰冷的10%甘油滅菌水溶液重洗1次。然后用500μL的冰冷的10%甘油滅菌水溶液重懸，分裝入EP管中，每管100μL，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將500μL的重組p MVHBHA質(zhì)粒，加入到100μL的M.smegmatis電感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后移入直徑為0.2 mm的電轉(zhuǎn)化杯，冰浴放置10 min后，置入Bio－Rad電轉(zhuǎn)化儀。電轉(zhuǎn)化條件為:電阻1 000Ω，電壓2.5 k V，電容25μF，轉(zhuǎn)化時(shí)間15～25 ms。電轉(zhuǎn)后立即將細(xì)菌轉(zhuǎn)入1 m L 7 H9培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，涂布于含卡那霉素（終濃度25μg／m L）的7H11瓊脂平板，37℃靜置培養(yǎng)5 d。挑取13個(gè)卡那霉素抗性的單菌落，分別接種于5 m L含卡那霉素（終濃度25μg／m L）的7 H9培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)5 d。

1.4.3 SDS－PAGE和Western blot鑒定 離心收集菌體和上清，分別加入上樣緩沖液并煮沸5 min，將菌體沉淀和上清進(jìn)行15%的SDS－PAGE電泳鑒定。以載體p MV261電轉(zhuǎn)化的重組M.smegmatis為陰性對(duì)照。用小鼠抗HBHA的多克隆抗體（1∶5 000）為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，結(jié)合ECL化學(xué)發(fā)光法，進(jìn)行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白HBHA在E.coli中的高效表達(dá)及純化

以M.tb H37Rv的基因組DNA為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增大小約為600 bp的Rv0475基因。圖1A所示是PCR擴(kuò)增出特異性條帶，且大小與預(yù)期一致。

圖1 大腸埃希菌表達(dá)重組HBH A蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及純化Fig.1 Construction，expression and purification of recombinant E.coli strain expressing protein HBHA

將重組表達(dá)質(zhì)粒p ET HBHA用NdeⅠ和Hin dⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)大小約為600 bp的目的基因和大小約為5 300 bp的載體的2條DNA片段（圖1B），與預(yù)期一致。酶切鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒p ETHBHA中的目的基因插入片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)正確。

重組表達(dá)質(zhì)粒pET HBHA在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)的重組蛋白HBHA，主要以可溶性形式存在于菌體內(nèi)。使用Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）His－Tag柱在非變性條件下純化目的蛋白。HBHA的表達(dá)、純化過(guò)程經(jīng)SDS－PAGE電泳鑒定（圖1C），證實(shí)重組蛋白HBHA的大小約為28 k D。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定HBHA蛋白溶液的濃度為1.912 5μg／μL。

2.2 重組蛋白HBHA在M.smegmatis中的表達(dá)及鑒定

利用引物P3和P4，從M.tb H37Rv基因組中PCR擴(kuò)增出含有自身啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列的HBHA基因，大小約為1 kb（圖2A）。并構(gòu)建重組分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒p MVHBHA。用Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可分別見(jiàn)大小約為1 kb的目的基因和大小約為4.4 kb的載體的2條DNA片段，大小與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2B）。

將重組表達(dá)質(zhì)粒p MVHBHA用電穿孔的方法轉(zhuǎn)化入M.smegmatis電感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含卡那霉素的7H11瓊脂平板，并培養(yǎng)5 d。挑取卡那霉素抗性的13個(gè)單克隆，經(jīng)7H9培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)后，將高溫裂解的菌體沉淀和上清，分別進(jìn)行15%的SDS－PAGE電泳和Western blot檢測(cè)，證實(shí)HBHA的表達(dá)。用載體p MV261轉(zhuǎn)化的重組M.smegmatis作對(duì)照。SDS－PAGE檢測(cè)結(jié)果證實(shí)上清未見(jiàn)蛋白的表達(dá)（結(jié)果未提供），在菌體裂解成份中，僅第2～7和第10～13克隆表達(dá)了28 k D的重組HBHA蛋白（圖2C）。Western blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果（圖2D）。

圖2 恥垢分枝桿菌表達(dá)重組HBHA蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及證實(shí)Fig.2 Construction，expression and identification of recombinant M.smegmatis strain expressing protein HBHA

A:含有自身啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列的HBH A基因的PCR擴(kuò)增，M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；B:重組M.smegmatis表達(dá)質(zhì)粒p MVHBH A的Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切鑒定，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；C:含質(zhì)粒p MVHBHA的13個(gè)重組M.smegmatis克隆的SDS－PAGE鑒定，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；G:含載體p MV261的重組M.smegmatis對(duì)照，1～13:含重組質(zhì)粒p MVHBH A的重組M.smegmatis，其中2～7、10～13克隆表達(dá)了28 k D的重組HBHA蛋白；D:含質(zhì)粒p MVHBHA的重組M.smegmatis的Western blot鑒定

3 討論

據(jù)估計(jì)全球約有三分之一的人口感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)病例約800萬(wàn)，死亡人數(shù)約200萬(wàn)［4］。近年來(lái)，耐多藥結(jié)核?。∕DR－TB）的顯著增加以及與HIV合并感染等因素，進(jìn)一步惡化了TB的流行情況。

HBHA作為為數(shù)不多的已被證實(shí)的結(jié)核分枝桿菌的致病因子之一，是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000的細(xì)菌表面黏附素，可在菌體和培養(yǎng)液中同時(shí)出現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所有成員均可分泌，而非致病的恥垢分枝桿菌則不能合成［5］。HBHA不僅可以通過(guò)與補(bǔ)體C3結(jié)合，介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞吞噬M.tb，調(diào)理肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)M.tb的吞噬，引發(fā)M.tb入侵肺部［6］，更重要的是，HBHA的編碼基因還是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)與結(jié)核肺外轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，HBHA通過(guò)其碳末端功能區(qū)與非吞噬細(xì)胞，如肺上皮細(xì)胞黏附，介導(dǎo)M.tb的肺外轉(zhuǎn)移［7］。過(guò)去，采用大腸埃希菌基因工程表達(dá)系統(tǒng)獲得大量的HBHA用于研究，但是質(zhì)譜分析表明，這種重組HBHA與天然HBHA顯著不同，后者在分枝桿菌中表達(dá)時(shí)的翻譯后加工過(guò)程中，C末端出現(xiàn)富含賴氨酸－脯氨酸－丙氨酸的甲基化修飾部分［8］，可介導(dǎo)與硫酸化多糖受體的結(jié)合，這不僅對(duì)蛋白本身的性質(zhì)具有重要影響，也是其與肝素結(jié)合而被純化的依據(jù)［9］。HBHA的甲基化部分不僅具有保護(hù)自身不被蛋白酶水解和通過(guò)控制肌動(dòng)蛋白來(lái)幫助M.tb逃逸吞噬體的作用［10］，也在結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)T和B細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)中占主導(dǎo)地位［11］。有研究顯示，相當(dāng)大一部分成人感染結(jié)核分枝桿菌后成為潛伏感染者［12］，而潛伏感染者體內(nèi)產(chǎn)生的T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)烈依賴HBHA的甲基化［1314］，其外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），相對(duì)于活動(dòng)性TB患者和健康者，針對(duì)甲基化修飾HBHA的刺激，會(huì)顯著增加IFN－γ的分泌［14］，這表明天然HBHA不僅是區(qū)分結(jié)核患者、潛伏感染者和健康人的良好診斷指標(biāo)［1516］，也是一個(gè)強(qiáng)有力的保護(hù)性抗原［15］和抗TB疫苗的候選者，尤其對(duì)于感染了結(jié)核分枝桿菌但還未發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核的患者［1］。

長(zhǎng)久以來(lái)，因?yàn)镸.tb主要寄居于人體巨噬細(xì)胞內(nèi)，生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)其細(xì)胞壁厚且富含脂質(zhì)，具有致病性，是一種較難在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)菌，所以高通量抗TB藥物篩選和鑒定受到較多技術(shù)和方法上的限制［3］。而M.smegmatis則是一種增殖快、轉(zhuǎn)化效率高的非致病菌，并且轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程也與M.tb十分類似。研究顯示，恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞裂解液均能使大腸埃希菌表達(dá)的無(wú)甲基化的HBHA實(shí)現(xiàn)甲基化，由此可見(jiàn)恥垢分枝桿菌含有能使HBHA甲基化的氨基轉(zhuǎn)移酶，其表達(dá)的HBHA同樣可以形成甲基化結(jié)構(gòu)［2］。此外，M.smegmatis還是比較強(qiáng)的細(xì)胞免疫佐劑，可代替BCG作為疫苗載體［1718］。因此，通過(guò)恥垢分枝桿菌體系的基因工程技術(shù)獲得的大量具有天然結(jié)構(gòu)的HBHA，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本研究顯示，我們從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中獲得的特異的HBHA DNA片段的大小與文獻(xiàn)［19－20］報(bào)道相符；得到的含p MVHBHA的重組M.smegmatis菌株表達(dá)出的條帶的大小與文獻(xiàn)［2］報(bào)道相符。同時(shí)本研究中的SDS－PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果，也證實(shí)了M.smegmatis自身表達(dá)的與HBHA的氨基酸水平同源性達(dá)68%的類似物也在重組M.smegmatis中低水平表達(dá)，但該類似物不具有HBHA可粘附到上皮細(xì)胞的能力，且和HBHA對(duì)肝素的親和吸附能力也不同，因此，不會(huì)影響HBHA的純化［21］。此外，M.smegmatis還表達(dá)了一種可識(shí)別HBHA抗血清的粘附素，即層粘連蛋白（LBP），其大小約為31 k D，有與HBHA相似的甲基化修飾［22］，但該蛋白對(duì)肝素?zé)o吸附能力。由此，本研究建立的重組M.smegmatis，成功為天然HBHA的大量純化和制備提供了條件，這將為深入研究HBHA的致病機(jī)制、發(fā)展高效準(zhǔn)確診斷方法和研制新型抗TB疫苗和藥物等奠定良好基礎(chǔ)。

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（2015－03－10 收稿）

Recombinant Expression and Identification of Antigen Heparin－binding Hemagglutinin（HBHA）of Mycobacterium Tuberculosis in Mycobacterium Smegmatis

Yu Fei1＃，Xun Yang1＃，Tian Maopeng2et al
1Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China
2Department of Pathogeny Microbiology，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To establish recombinant Mycobacterium smegmatis（M.smegmatis）strain highly expressing antigen heparin－binding hemagglutinin（HBHA）of Mycobacterium tuberculosis（M.tuberculosis）.Methods The gene Rv0475，encoding HBHA of M.tuberculosis H37Rv strain was obtained by PCR and cloned into the vector p ET－30b（＋），to construct the recombinant prokaryotic expression plasmid p ETHBH A.Recombinant protein HBHA was prepared as C－terminal His－tagged fusion protein from p ETHBHA transformed E.coli BL21（DE3）strain after induction with IPTG and was used to prepare mouse original polyclonal antibodies.Rv0475 containing its promoter and regulatory sequence was amplified by PCR and cloned into E.coli－Mycobacterium shuttle vector p MV261，namely p MVHBHA.p MVHBHA was transformed into M.smegmatis after identification by restriction enzyme analysis，and recombinant M.smegmatis strain was cultivated on 7H11 plate.The kanamycinresistant clones were identified with 15%SDS－PAGE and Western blotting.Results Recombinant prokaryotic expression plasmid p ETHBHA and recombinant mycobacteria expression plasmid p MVHBHA were constructed successfully.The recombinant protein HBHA was successfully expressed and purified in recombinant E.coli strain.The protein concentration was 1.912 5μg／μL determined by a method called BCA Protein Assay Kit，and the protein was used to prepare mouse original polyclonal antibodies.Recombinant protein HBH A was expressed in recombinant M.smegmatis using its own promoter and regulatory sequences.Conclusion Recombinant M.smegmatis strain expressing HBH A was established successfully，which provides foundation to study pathogenesis of tuberculosis and development of new vaccines and diagnostic reagents for TB.

heparin－binding hemagglutinin； Mycobacterium smegmatis； tuberculosis； expression

R378.91

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.007

＊華中科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（No.教育部高教司函［2014］24號(hào)）

＃共同第一作者:余 菲，女，1993年生，本科生，E－mail:yufei623＠foxmail.com；尋 陽(yáng)，男，1993年生，本科生，E－mail:876442369＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，滕新棟E－mail:543623770＠qq.com；范雄林E－mail:xlfan＠hust.edu.cn