二硫化碳對大鼠睪丸組織氧化損傷及p53調(diào)控細(xì)胞凋亡的影響＊

王 為， 黃 浩， 黎麗茜， 陳 聯(lián)， 陳國元△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2009級八年制，武漢 430030

二硫化碳對大鼠睪丸組織氧化損傷及p53調(diào)控細(xì)胞凋亡的影響＊

王 為1， 黃 浩2， 黎麗茜2， 陳 聯(lián)2， 陳國元1△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2009級八年制，武漢 430030

目的 探討二硫化碳（carbon disulfide，CS2）對大鼠睪丸組織氧化損傷及p53調(diào)控細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機制。方法 清潔級SD雄性大鼠24只，隨機分為4組，即空白對照組（Ⅰ）、低濃度組（Ⅱ）、中濃度組（Ⅲ）、高濃度組（Ⅳ），CS2染毒濃度分別為0、50、250和1 250 mg／m3。靜式吸入染毒，每周5 d，每天2 h，共10周，空白對照組僅吸入新鮮空氣。染毒結(jié)束后記錄大鼠體重、睪丸臟器系數(shù)、精子計數(shù)和精子活動率；蘇木精－伊紅（HE）染色觀察其形態(tài)學(xué)改變；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）法檢測大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡情況；化學(xué)比色法測量大鼠睪丸組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活性及丙二醛（MDA）含量；Western blot法檢測p53、PARP、Bax和Bcl－2蛋白表達含量。結(jié)果 各CS2染毒組的大鼠體重、睪丸臟器系數(shù)、精子相對計數(shù)及精子活動率均低于空白對照組（均P＜0.05）；隨著CS2染毒濃度的增加，大鼠睪丸組織形態(tài)損傷更加明顯，中、高濃度組的凋亡指數(shù)明顯大于空白對照組（均P＜0.05），抗氧化酶SOD和GSH－Px活性呈下降趨勢而脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)物MDA則明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；Western blot檢測結(jié)果顯示，各CS2染毒組p53蛋白表達含量上升（P＜0.01），PARP蛋白僅在高濃度組有明顯降低（P＜0.05），而Bax與Bcl－2蛋白各自呈上升和下降趨勢，中、高濃度組Bax與Bcl－2蛋白含量與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 氧化應(yīng)激和p53參與了CS2誘導(dǎo)的大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡。

二硫化碳； 細(xì)胞凋亡； 氧化應(yīng)激； p53； 生殖毒性

二硫化碳（carbon disulfide，CS2）是常用的有機溶劑和工業(yè)原料，主要用于粘膠纖維生產(chǎn)。研究表明，長期接觸CS2可造成神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)等危害［1］。近年來其對男（雄）性生殖系統(tǒng)的影響也被廣泛認(rèn)知，主要表現(xiàn)為性功能障礙、生殖器萎縮、內(nèi)分泌激素紊亂及精子生成和活力的降低等［2］。當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激（oxidative stress）狀態(tài)時，活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成量大于機體清除能力，可導(dǎo)致機體脂質(zhì)過氧化水平升高，DNA氧化損傷及蛋白質(zhì)表達異常等，引起細(xì)胞損傷并將啟動細(xì)胞凋亡機制清除過度損傷的細(xì)胞［3］。而p53在ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［4］。因此，本實驗旨在研究氧化應(yīng)激與p53蛋白在CS2誘導(dǎo)大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡中的作用，為CS2對男（雄）性生殖系統(tǒng)損傷的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CS2（上海四試赫維化工有限公司），原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（Td T－mediated d UTP nick－end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所），p53、Bcl－2、Bax抗體（Santa Cruz Biotechnology），PARP抗體（Cell Signaling Technology），β－actin抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔／鼠Ig G（武漢谷歌生物科技有限公司），HRP化學(xué)發(fā)光液（北京天根生化科技有限公司）。有機玻璃染毒柜（同濟醫(yī)學(xué)院研制），臺式低溫離心機（Eppendorf公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio－Tek公司），722S可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），電泳槽和垂直電泳儀（Bio－Rad公司），熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及染毒 清潔級健康SD雄性大鼠24只，4～5周齡，體重（150±10）g，由同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，動物使用許可證編號: 4209800122。實驗動物經(jīng)檢疫1周后隨機分為4組，即空白對照組（Ⅰ）、低濃度組（Ⅱ）、中濃度組（Ⅲ）、高濃度組（Ⅳ），染毒濃度分別為0、50、250和1 250 mg／m3。采用靜式吸入染毒，每周5 d，每天2 h，共10周，空白對照組在其他條件相同的情況下吸入空氣。每周對各組大鼠體重進行稱重并記錄，觀察實驗動物進食、糞便等有無異常情況。

1.2.2 臟器稱重及精子計數(shù) 染毒結(jié)束后稱量各組大鼠體重，斷頸處死大鼠，剖開腹腔取出睪丸，稱量睪丸重量，臟器稱重后用4%多聚甲醛固定，剩余新鮮組織置于－80℃冰箱保存。取一側(cè)附睪按照Mahmoud等［56］方法在37℃生理鹽水中采用“縱1＋橫2”方式剪3刀，靜置約5 min讓精子自由游出，得到精子懸液。取適量混懸液，用0.5%甲醛溶液生理鹽水稀釋固定后滴于Neubauer型血球計數(shù)板上，在200倍的光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)1 mm2面積上精子個數(shù)，并換算為每100 mg附睪重量精子相對總數(shù)，計算精子活動率（精子活動率＝活動精子數(shù)／精子總數(shù)×100%）。

1.2.3 蘇木精－伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色 常規(guī)石蠟切片，脫蠟處理:二甲苯（Ⅰ）5 min，二甲苯（Ⅱ）5 min，無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。脫蠟后的切片用蘇木精染液染色5 min，流水沖洗。1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅染色2 min后脫水、透明及封片。于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 TUNEL檢測 常規(guī)石蠟切片脫蠟、水化，蛋白酶K工作液常溫下處理20 min，PBS漂洗3次。嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作方法配制TUNEL反應(yīng)混合液，加50μL反應(yīng)混合液滴于切片上，避光37℃濕盒孵育60 min，PBS漂洗3次。HRP抗熒光素抗體37℃濕盒避光孵育30 min，PBS漂洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5～10 min，PBS漂洗3次，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核數(shù)秒，流水沖洗，脫水、透明及封片。于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，棕色顆粒為TUNEL陽性即凋亡細(xì)胞。

1.2.5 氧化損傷檢測 適量睪丸組織置于預(yù)冷的生理鹽水中機械勻漿，制成10%的組織勻漿液，2 500 r／min離心10 min，取上清液待測。嚴(yán)格按照試劑盒所提供的方法進行操作，采用化學(xué)比色法測定SOD、GSH－Px活力和MDA含量。

1.2.6 Western blot檢測蛋白含量 適量大鼠睪丸組織置于預(yù)冷的Western及IP細(xì)胞裂解液中充分研磨勻漿，離心后獲取上清，用蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，并將各組蛋白濃度統(tǒng)一，用Western blot方法檢測蛋白表達水平。SDS－PAGE電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。相應(yīng)蛋白抗體用5%脫脂牛奶1∶1 000稀釋并4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。HRP標(biāo)記的羊抗兔／鼠IgG用5%脫脂牛奶1∶2 000稀釋并在常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，使用HRP化學(xué)發(fā)光液檢測，置于熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，并使用該系統(tǒng)自帶分析軟件Gene Tools計算相對吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料表示為ˉx±s，組間均數(shù)差異采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one－way ANOVA），檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 CS2對大鼠體重、睪丸臟器系數(shù)及精子計數(shù)的影響

由表1可見，隨著CS2染毒濃度的增加，各染毒組大鼠體重均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）；睪丸臟器系數(shù)呈下降趨勢，中、高濃度組的睪丸臟器系數(shù)與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各CS2染毒組的精子相對計數(shù)與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而精子活動率只在中、高濃度組下降比較明顯，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 CS2染毒對雄性大鼠體重、睪丸臟器系數(shù)、精子活動率及凋亡指數(shù)的影響（ˉx±s，n＝6）Table 1 Effects of CS2on body weight，organ coefficient，sperm motility and apoptotic index in the male rats（ˉx±s，n＝6）

2.2 CS2對大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

圖1A可見，空白對照組曲細(xì)精管呈圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)完整飽滿，支持細(xì)胞及各級生精細(xì)胞排列規(guī)則緊密，管腔內(nèi)含有大量精子。與空白對照組比較，低濃度組大鼠睪丸組織曲細(xì)精管無明顯變化，而CS2中、高濃度組發(fā)現(xiàn)，睪丸曲細(xì)精管萎縮，管腔間隙增寬，間質(zhì)增生，生精上皮變薄，生精細(xì)胞明顯減少，各級生精細(xì)胞排列紊亂、連接松散，部分管腔可見大量生精細(xì)胞脫落。

2.3 CS2對大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響

空白對照組及各CS2染毒組均有凋亡發(fā)生，空白對照組和低濃度組中只見極少量的凋亡細(xì)胞；隨CS2染毒濃度增加，中、高濃度組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯高于空白對照組（圖1B）。各CS2染毒組凋亡指數(shù)也呈上升趨勢，中、高濃度組凋亡指數(shù)與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 CS2對大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of CS2on HE staining and TUNEL of testis tissues in the rats

2.4 CS2對大鼠睪丸組織SOD、GSH－Px活性和MDA含量的影響

各組睪丸組織中SOD、GSH－Px活性及MDA含量變化見表2。隨著CS2染毒濃度增加，各CS2染毒組大鼠睪丸組織SOD與GSH－Px活性呈下降趨勢，而MDA含量則呈上升趨勢，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 CS2對大鼠睪丸組織SOD、GSH－Px活性和MDA含量的影響（ˉx±s，n＝6）Table 2 Effects of CS2treatment on activities of SOD and GSH－Px，and MDA level in rat’s testes（ˉx±s，n＝6）

2.5 CS2對大鼠睪丸組織相關(guān)凋亡蛋白表達的影響

與空白對照組比較，各CS2染毒組p53蛋白表達含量均明顯增加，中、高濃度組p53蛋白含量有顯著提升（均P＜0.01）（圖2A）。隨著CS2染毒濃度的增加，PARP蛋白含量呈下降趨勢，但只有高濃度組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2B）。圖2C與圖2D顯示，Bax蛋白含量呈上升趨勢而Bcl－2蛋白含量呈下降趨勢，中、高濃度組的Bax，Bcl－2蛋白含量與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 大鼠睪丸組織p53、PARP、Bax及Bcl－2蛋白相對表達水平Fig.2 Relative expression levels of p53，PARP，Bax and Bcl－2 proteins in rat’s testes

3 討論

CS2作為有機溶劑在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，已有大量流行病學(xué)研究表明長期接觸一定濃度的CS2可導(dǎo)致男工性功能障礙、精液質(zhì)量下降及子代流產(chǎn)率增加等［79］。蔡世雄等［10］在雄性小鼠吸入CS2實驗發(fā)現(xiàn)，10和100 mg／m3CS2吸入組的精子畸變率都顯著高于對照組。Tepe等［11］報道600 mg／LCS2吸入染毒能夠?qū)е庐惓５男孕袨椤⒕訑?shù)量減少以及血清睪酮水平的降低。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高濃度CS2染毒組大鼠體重、睪丸臟器系數(shù)及精子活動率出現(xiàn)較為明顯的下降，與文獻報道基本一致；HE染色結(jié)果顯示，CS2可導(dǎo)致大鼠睪丸組織間質(zhì)水腫，曲細(xì)精管內(nèi)也出現(xiàn)生精細(xì)胞層次和數(shù)目減少，排列紊亂、疏松，各級精母細(xì)胞從生精上皮脫落，影響精子的發(fā)生。以上結(jié)果表明，CS2對大鼠生長發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育及精子發(fā)生等均有損害作用。同時TUNEL法檢測大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，隨著CS2染毒濃度的增加，中、高濃度組凋亡指數(shù)明顯增加。因此，我們有理由相信CS2導(dǎo)致男（雄）性生殖系統(tǒng)損傷與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是一種有別于壞死的細(xì)胞程序性死亡，涉及一系列基因的激活、蛋白表達及調(diào)控等。大量研究表明，活性氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化很可能是外源性化合物對機體造成損傷的分子機制之一［12］。當(dāng)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生超過機體抗氧化能力時，可導(dǎo)致組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷及蛋白質(zhì)表達異常，進一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡［1314］。MDA是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物之一，可反映機體組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的速率和程度，并間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度。SOD和GSH－Px是體內(nèi)主要的抗氧化酶，SOD能夠歧化O2－形成H2O2，消除超氧陰離子毒性；GSH－Px能夠催化脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的醇類，同時能夠催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2。本研究發(fā)現(xiàn)，CS2染毒使大鼠睪丸組織中SOD和GSH－Px活性下降，MDA含量升高，說明了CS2誘導(dǎo)大鼠睪丸組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化以及組織內(nèi)抗氧化酶活性的減弱，當(dāng)機體無法扭轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激狀態(tài)時，細(xì)胞凋亡隨即發(fā)生。

腫瘤抑制因子p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，同時作為基因毒性應(yīng)激感受器，在調(diào)控基因表達和對細(xì)胞生存的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮極其重要的作用。眾多研究表明活性氧在多條通路上參與了p53信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)［1517］，而最常見的就是自由基直接攻擊核酸分子引起DNA損傷［18］，并通過轉(zhuǎn)錄激活p53從而增強自身穩(wěn)定性和DNA結(jié)合活力。激活的p53將進一步活化眾多凋亡因子促進細(xì)胞凋亡。有文獻表明p53在過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［19］，而在過氧化氫處理過的細(xì)胞中，基因手段消除p53功能有助于增加細(xì)胞存活率［2021］，這提示我們在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中p53有著不可忽視的作用。多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP－ribose polymerase，PARP）是一種DNA修復(fù)酶，參與調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)、基因組完整性的維持及在轉(zhuǎn)錄復(fù)制分化水平上各種蛋白質(zhì)的表達，同時是細(xì)胞凋亡Caspases活化后的剪切底物。最近研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷發(fā)生后細(xì)胞核內(nèi)的p53受到PARP的多聚核糖基化修飾，無法向核外轉(zhuǎn)運而在核內(nèi)積累［22］，PARP在調(diào)節(jié)p53轉(zhuǎn)運出核這一過程中起到關(guān)鍵作用。因此，p53信號通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，PARP受到其下游Caspases酶的剪切，同時PARP對p53轉(zhuǎn)運出核起到調(diào)控作用。Bcl－2家族在細(xì)胞凋亡中主要是對線粒體外膜的完整性進行調(diào)節(jié)，當(dāng)眾多凋亡因子結(jié)合p53后被激活轉(zhuǎn)錄表達，Bax基因表達增高而對Bcl－2基因則抑制其表達［23］。大量文獻指出，Bax／Bcl－2的比例對于細(xì)胞凋亡極其關(guān)鍵，高Bax／Bcl－2將啟動線粒體通路的細(xì)胞凋亡［2426］。本實驗采用Western blot對大鼠睪丸組織p53、PARP、Bax和Bcl－2蛋白進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、Bax蛋白表達呈上升趨勢而PARP、Bcl－2蛋白表達呈下降趨勢，說明p53和PARP參與了CS2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而上調(diào)Bax／Bcl－2比例可能是CS2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機制之一。

綜上所述，我們可以認(rèn)為CS2作用于大鼠睪丸組織時發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量自由基，而體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力減弱無法全部清除，自由基對組織和細(xì)胞直接造成毒性作用，如:大鼠體重、睪丸臟器系數(shù)、精子活動率下降，大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)損傷以及凋亡指數(shù)增加等。而CS2所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p53信號通路、Bcl－2家族蛋白表達有關(guān)。

［1］ Beauchamp R J，Bus J S，Popp J A，et al.A critical review of the literature on carbon disulfide toxicity［J］.Crit Rev Toxicol，1983，11（3）:169－278.

［2］ 鄧菁，季佳佳，趙艷芳，等.二硫化碳對男性生殖系統(tǒng)的毒性研究進展［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2007，24（6）:636－639.

［3］ Chandra J，Samali A，Orrenius S.Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress［J］.Free Radic Biol Med，2000，29（3／4）:323－333.

［4］ Bragado P，Armesilla A，Silva A，et al.Apoptosis by cisplatin requires p53 mediated p38 alpha MAPK activation through ROS generation［J］.Apoptosis，2007，12（9）:1733－1742.

［5］ Mahmoud A M，Depoorter B，Piens N，et al.The performance of 10 different methods for the estimation of sperm concentration［J］.Fertil Steril，1997，68（2）:340－345.

［6］ Lee W M，Tsang A Y，Wong P Y.Effects of divalent and lanthanide ions on motility initiation in rat caudal epididymal spermatozoa［J］.Br J Pharmacol，1981，73（3）:633－638.

［7］ Vanhoorne M，Comhaire F，De Bacquer D.Epidemiological study of the effects of carbon disulfide on male sexuality and reproduction［J］.Arch Environ Health，1994，49（4）:273－278.

［8］ Patel K G，Yadav P C，Pandya C B，et al.Male exposure mediated adverse reproductive outcomes in carbon disulphide exposed rayon workers［J］.J Environ Biol，2004，25（4）:413－418.

［9］ Ma J Y，Ji J J，Qing D，et al.The effects of carbon disulfide onmale sexual function and semen quality［J］.Toxicol Ind Health，2010，26（6）:375－382.

［10］ 蔡世雄，黃美媛，王貽嘉，等.二硫化碳對雄性小鼠生殖細(xì)胞作用的實驗研究［J］.衛(wèi)生研究，1988，17（5）:1－4.

［11］ Tepe S J，Zenick H.The effects of carbon disulfide on the reproductive system of the male rat［J］.Toxicology，1984，32（1）:47－56.

［12］ 武陽，常青，楊旭.不同濃度甲醛致大鼠肝細(xì)胞DNA氧化損傷作用［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，29（11）:2415－2419.

［13］ Kujoth G C，Hiona A，Pugh T D，et al.Mitochondrial DNA mutations，oxidative stress，and apoptosis in mammalian aging［J］.Science，2005，309（5733）:481－484.

［14］ Ott M，Gogvadze V，Orrenius S，et al.Mitochondria，oxidative stress and cell death［J］.Apoptosis，2007，12（5）:913－922.

［15］ Cardaci S，F(xiàn)ilomeni G，Rotilio G，et al.Reactive oxygen species mediate p53 activation and apoptosis induced by sodium nitroprusside in SH－SY5Y cells［J］.Mol Pharmacol，2008，74（5）:1234－1245.

［16］ Chowdhury R，Chowdhury S，Roychoudhury P，et al.Arsenic induced apoptosis in malignant melanoma cells is enhanced by menadione through ROS generation，p38 signaling and p53 activation［J］.Apoptosis，2009，14（1）:108－123.

［17］ Yan W，Chen X.GPX2，a direct target of p63，inhibits oxidative stress－induced apoptosis in a p53－dependent manner［J］.J Biol Chem，2006，281（12）:7856－7862.

［18］ Agarwal A，Said T M.Oxidative stress，DNA damage and apoptosis in male infertility:a clinical approach［J］.BJU Int，2005，95（4）:503－507.

［19］ Kitamura Y，Ota T，Matsuoka Y，et al.Hydrogen peroxide－induced apoptosis mediated by p53 protein in glial cells［J］.Glia，1999，25（2）:154－164.

［20］ Yin Y，Terauchi Y，Solomon G G，et al.Involvement of p85 in p53－dependent apoptotic response to oxidative stress［J］.Nature，1998，391（6668）:707－710.

［21］ Buschmann T，Yin Z，Bhoumik A，et al.Amino－terminal－derived JNK fragment alters expression and activity of c－Jun，ATF2，and p53 and increases H2O2－induced cell death［J］.J Biol Chem，2000，275（22）:16590－16596.

［22］ Kanai M，Hanashiro K，Kim S H，et al.Inhibition of Crm1－p53 interaction and nuclear export of p53 by poly（ADP－ribosyl）ation［J］.Nat Cell Biol，2007，9（10）:1175－1183.

［23］ Miyashita T，Krajewski S，Krajewska M，et al.Tumor suppressor p53 is a regulator of Bcl－2 and Bax gene expression in vitro and in vivo［J］.Oncogene，1994，9（6）:1799－1805.

［24］ 何樂亞，魏欣，徐豐，等.G0／G1期異時相Cyclin B1的表達對細(xì)胞凋亡的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2013，42（1）:38－41.

［25］ Sakinah S A，Handayani S T，Hawariah L P.Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax／Bcl－2 ratio［J］.Cancer Cell Int，2007，7（4）:1－11.

［26］ Gao M，Zhang W C，Liu Q S，et al.Pinocembrin prevents glutamate－induced apoptosis in SH－SY5Y neuronal cells via decrease of bax／bcl－2 ratio［J］.Eur J Pharmacol，2008，591（1－3）:73－79.

（2015－03－16 收稿）

Effects of Carbon Disulfide on Oxidative Stress and p53 mediated Apoptosis of Rat’s Testes

Wang Wei1，Huang Hao2，Li Liqian2et al
1Department of Occupational and Environmental Health，School of Public Health，2Eight－year Program of Clinical Medicine，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate effects of carbon disulfide（CS2）on oxidative stress and p53－mediated apoptosis in male rat’s testes，and explore its possible molecular mechanisms.Methods Twenty－four SD male rats were randomly divided into four groups:control group（Ⅰ），low－concentration group（Ⅱ），medium－concentration group（Ⅲ）and high－concentration group（Ⅳ）.Three treatment groups were exposed to CS2at different concentrations（50，250，1250 mg／m3）by inhalation for 10 weeks，with 2 h per day，5 days per week.Rats of control group inhaled fresh air.Body weight，organ index，sperm count and sperm motility were recorded 10 weeks after CS2treatment.Histopathological changes of the testes were observed by HE staining.TUNEL was used to detect apoptosis of the testes.SOD，GSH－Px activities and MDA level were measured by chemical colorimetry in the rats.Also，we used Western blotting to detect the p53，PARP，Bax and Bcl－2 proteins levels in each group.Results Body weight，organ index，sperm count and sperm motility were decreased in CS2treatment groups，compared with the control group（P＜0.05）.The histopathological changes of the testes became more serious with the increase of CS2concentration.The apoptosis index was significantly higher in middle and high concentration groups than in control group（P＜0.05）.Meanwhile，activities of SOD and GSH－Px were significantly decreased，and MDA level was significantly increased（P＜0.05，P＜0.01）.Western blotting showed that the level of p53 was significantly increased in CS2treatment groups（P＜0.01）.the level of PARP was declined significantly in high－concentration group（P＜0.05）.There were significant differences in the levels of Bax and Bcl－2 between medium and high concentration groups and the control group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion

Oxidative stress and p53 are involved in CS2induced apoptosis in rat’s testes.

carbon disulfide； apoptosis； oxidative stress； p53； reproductive toxicity

R588.1

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.002

＊國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81172637）

王 為，男，1989年生，碩士研究生，E－mail:wangeternal＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:guoychen＠163.com