Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷所致胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用＊

陳 欣， 王 偉， 張建芳， 趙以林， 李世勇， 羅愛林

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢 430030

Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷所致胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用＊

陳 欣， 王 偉， 張建芳， 趙以林， 李世勇， 羅愛林△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢 430030

目的 探討Neuroprotectin D1（NPD1）對(duì)異氟烷所致胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。方法 培養(yǎng)孕16～18 d SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元5 d。這些神經(jīng)元被隨機(jī)分為5組:對(duì)照組（C組）、異氟烷組（I組）和不同濃度NPD1組（NPD11－3組）。C組接受含有30%氧氣和5%二氧化碳的混合氣體處理6 h；I組接受2%異氟烷處理6 h；NPD11－3組于麻醉前30 min在培養(yǎng)液中加入Neuroprotectin D1（終濃度分別為25、50、75 nmol／L），接受2%異氟烷處理6 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞損傷程度；TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測(cè)活化Caspase－3、Bax、Bcl－2、IL－1β及TNF－α蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與C組比較，I組TUNEL陽性細(xì)胞比例、活化Caspase－3、Bax、IL－1β及TNF－α蛋白表達(dá)水平顯著增加（均P＜0.05），細(xì)胞活性和Bcl－2蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01）。與I組比較，NPD11－3組IL－1β及TNF－α蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01）。與I組比較，NPD12－3組TUNEL陽性細(xì)胞比例、活化Caspase－3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05），NPD11－3組細(xì)胞活性和Bcl－2蛋白表達(dá)水平顯著增加（均P＜0.05）。結(jié)論 Neuroprotectin D1通過緩解促炎因子IL－1β和TNF－α產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Bcl－2和Bax表達(dá)，進(jìn)而抑制異氟烷所致的胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

Neuroprotectin D1； 異氟烷； 神經(jīng)元； 細(xì)胞凋亡； 炎癥反應(yīng)

異氟烷是臨床常用的吸入麻醉藥之一，在小兒麻醉中應(yīng)用廣泛。而臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異氟烷可產(chǎn)生發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙［1］。目前有效藥物及治療措施仍十分匱乏。研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷誘發(fā)的神經(jīng)元毒性與其所致神經(jīng)元促炎因子（TNF－α和IL－1β）釋放有關(guān)［2］。Neuroprotectin D1（NPD1）是二十二碳六烯酸（DHA）經(jīng)脂氧合酶分解產(chǎn)生的衍生物［3］。研究發(fā)現(xiàn)，Neuroprotectin D1可通過下調(diào)促炎因子釋放，有效緩解阿爾茨海默病體外模型中凋亡信號(hào)通路激活［4］，并在多種動(dòng)物模型（如阿爾茨海默病和中風(fēng)）中證實(shí)有顯著的腦保護(hù)作用［5－6］。而Neuroprotectin D1能否通過下調(diào)促炎因子釋放，緩解異氟烷麻醉誘發(fā)的發(fā)育期海馬神經(jīng)元凋亡尚不清楚。本研究擬探討Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷麻醉誘發(fā)的胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

胎鼠取自孕16～18 d孕鼠（SD大鼠），該孕鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、Neurobasal培養(yǎng)液、B27生長(zhǎng)因子、胰蛋白酶均由美國Gibco公司提供；Neuroprotectin D1由美國Cayman公司提供；異氟烷由美國Baxter公司提供（批號(hào):088008）；抗Bax抗體由美國BD公司提供；抗Bcl－2小鼠抗體由美國eBioscience公司提供；抗活化Caspase－3抗體和抗總Caspase－3抗體由美國Cell Signaling Technology公司提供；抗活化MAP－2、IL－1β和TNF－α抗體由美國Abcam公司提供；抗β－actin抗體由武漢博士德公司提供；TUNEL染色試劑盒由德國Roche公司提供；MTT試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 胎鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

神經(jīng)元的原代培養(yǎng)參考Garwood等［7］的實(shí)驗(yàn)方法。孕鼠麻醉消毒后，開腹取出胎鼠，迅速斷頭取腦，使用75%乙醇消毒，將腦組織取出置入裝有3 m L DMEM培養(yǎng)液的玻璃皿中，將玻璃皿放于冰袋上，分離出海馬組織，用鑷子撥去組織上的血管膜，并將組織剪成小于1 mm3的小塊，加入3 m L 0.25%的胰蛋白酶，置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化5 min。將組織塊吸出，置于15 m L的離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止胰酶消化。之后，將離心管置于低速離心機(jī)中，1 000 r／min離心8 min，離心結(jié)束后，棄去上清，向離心管中加入1 m L培養(yǎng)液，輕輕吹打，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106／m L。以7×105／孔的細(xì)胞密度接種到經(jīng)多聚賴氨酸包被的24孔板中，培養(yǎng)板中提前置入蓋玻片并加入0.5 m L含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。6 h后將培養(yǎng)液換成含2%B27的Neurobasal培養(yǎng)液。每天觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察有無發(fā)生細(xì)菌或真菌污染，第3天換液1次，換液量為總液體量的1／2，培養(yǎng)至第5天時(shí)采用MAP2與DAPI熒光染色法鑒定神經(jīng)元純度達(dá)95%，即可開展下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及異氟烷神經(jīng)元毒性模型的建立

將培養(yǎng)5 d的原代神經(jīng)元置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)小室中。培養(yǎng)小室有進(jìn)氣口和出氣口各一。以含有30%氧氣和5%二氧化碳的混合氣體作為載體氣體。異氟烷濃度為2%［2］，通氣流量為2 L／min。麻醉完成后，關(guān)閉異氟烷揮發(fā)罐，繼續(xù)保持通氣30 min。Neuroprotectin D1使用含5%乙醇的生理鹽水溶解成儲(chǔ)存液（500×，Neuroprotectin D1濃度25μmol／L），于異氟烷處理前30 min加入培養(yǎng)液中，使其終濃度分別為25、50或75 nmol／L［4］。

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組（n＝5）:對(duì)照組（C組）、異氟烷組（I組）和不同濃度NPD1組（NPD11－3組）。C組接受含有30%氧氣和5%二氧化碳的混合氣體處理6 h；I組接受2%異氟烷處理6 h；NPD11－3組于麻醉前30 min在培養(yǎng)液中加入Neuroprotectin D1（終濃度分別為25、50、75 nmol／L），接受2%異氟烷處理6 h。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)參考van Meerloo等［8］的實(shí)驗(yàn)方法。異氟烷處理后1 h，以MTT法來評(píng)測(cè)細(xì)胞活力和損傷程度。使用外源性MTT（5 mg／m L）與活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶作用，產(chǎn)生難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物formazan；而死細(xì)胞及線粒體功能損傷的細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)生該反應(yīng)。之后，加入適量的DMSO溶解細(xì)胞中沉積的formazan并呈現(xiàn)為紫紅色，可用酶標(biāo)儀（BIO－RAD Model 680）在490 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光度，以間接反映細(xì)胞活力和細(xì)胞損傷程度。

1.5 TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

TUNEL染色法檢測(cè)參考Liu等［9］實(shí)驗(yàn)方法。異氟烷處理后1 h，進(jìn)行TUNEL（Td T－mediated d UTP nick end labeling；Roche公司，德國）染色。室溫下使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。PBS洗去多余的多聚甲醛后，加新鮮配制的破膜液（含0.3%Triton X－100）處理5 min。按試劑盒操作說明配制TUNEL反應(yīng)液（Td T酶∶FITC熒光標(biāo)記溶液＝1∶9）。每個(gè)樣本加入反應(yīng)混合液40～50μL（覆蓋玻片即可）。于37℃的暗箱內(nèi)孵育l h。使用含DAPI水溶性封片劑，所有細(xì)胞核在DAPI染色下，發(fā)藍(lán)色熒光，同時(shí)凋亡細(xì)胞發(fā)綠色熒光。熒光顯微鏡（Leica DM2500）下每個(gè)樣本隨機(jī)選5個(gè)視野（×400），并計(jì)算TUNEL陽性凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)（DAPI）的百分比（%），即凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.6 Western blot檢測(cè)

異氟烷處理后1 h，細(xì)胞用PBS迅速洗1次，加入RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集到Eppendorf管中，用BCA試劑盒對(duì)所抽提的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品調(diào)整為相同濃度。相同濃度和相同體積的蛋白樣品加入5×樣品緩沖液，100℃沸水中煮8 min，12 000 g離心8 min，然后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，并經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜在5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，PVDF膜浸于5%脫脂牛奶稀釋的相應(yīng)濃度一抗（抗活化Caspase－3抗體，1∶500；抗總Caspase－3抗體，1∶1 000；抗Bax抗體，1∶1 000；抗Bcl－2抗體，1∶1 000；抗IL－1β抗體，1∶1 000；抗TNF－α抗體，1∶1 000；抗β－actin抗體，1∶500）中，在4℃環(huán)境中孵育過夜。次日將膜取出，TBST液洗滌3次，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)生物二抗（武漢博士德生物工程有限公司），室溫孵育2 h，TBST液洗滌3次，然后進(jìn)行ECL顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio Rad公司，美國）中成像，采用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，連續(xù)變量的組間比較采用單因素方差分析；凋亡指數(shù)（AI）為非連續(xù)變量，組間比較采用Mann Whitney檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)鑒定

使用神經(jīng)元標(biāo)記物MAP2［10］免疫熒光染色可見，細(xì)胞胞體形態(tài)多為錐形或多極型，突起明顯。DAPI染色與MAP2染色顯示，細(xì)胞純度達(dá)95%以上，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)鑒定（×400）Fig.1 Identification of cultured neurons from hippocampi of fetal rats（×400）

2.2 Neuroprotectin D1可緩解異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元IL－1β和TNF－α上調(diào)

首先觀察異氟烷（2%，6 h）暴露后0.5、1和2 h，胎鼠海馬神經(jīng)元IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)水平的變化。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，神經(jīng)元IL－1β蛋白表達(dá)水平在異氟烷暴露后0.5、1和2 h均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），在異氟烷暴露后1 h達(dá)到峰值（P＜0.01）；神經(jīng)元TNF－α蛋白表達(dá)水平在異氟烷暴露后0.5和1 h亦均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），在異氟烷暴露后1 h達(dá)到峰值（P＜0.01）。見圖2。

因IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)水平均在異氟烷暴露后1 h達(dá)峰，本研究在異氟烷暴露后1 h觀察Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元炎癥反應(yīng)和凋亡的影響。與I組比較，NPD11、NPD12和NPD13組IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)（均P＜0.01）。見圖3。

2.3 Neuroprotectin D1可緩解異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元凋亡和細(xì)胞損傷

MAP2和TUNEL免疫雙標(biāo)染色可見，一些神經(jīng)元細(xì)胞核出現(xiàn)TUNEL陽性染色。見圖4 A～D。與C組比較，I組神經(jīng)元凋亡指數(shù)（AI）和活化Caspase－3蛋白表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.01）。與I組比較，NPD12和NPD13組神經(jīng)元凋亡指數(shù)（AI）和活化Caspase－3蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（均P＜0.01）。見圖4E～K。

圖2 異氟烷暴露后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元IL－1β和TNF－α蛋白表達(dá)水平的變化Fig.2 IL－1βand TNF－αprotein expression changes after isoflurane exposure for different time lengths

圖3 Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷所致神經(jīng)元炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of Neuroprotectin D1 on isoflurane－induced neuronal inflammatory response

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，各組結(jié)果分別為:C組（100.0±6.2）%，I組（64.3±4.8）%，NPD11組（78.1±7.2）%，NPD12組（94.7±9.4）%，NPD13組（112.2±8.5）%。與C組比較，I組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）。與I組比較，NPD11、NPD12和NPD13組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05或P＜ 0.01）。

2.4 Neuroprotectin D1可緩解異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元促凋亡分子Bax上調(diào)和抗凋亡分子Bcl－2下調(diào)

與C組比較，I組神經(jīng)元促凋亡分子Bax蛋白表達(dá)水平升高，抗凋亡分子Bcl－2蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.01）。與I組比較，NPD12和NPD13組Bax蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（均P＜0.01），而Bcl－2蛋白表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05）。見圖5。

圖4 Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷所致神經(jīng)元凋亡的影響Fig.4 Effects of Neuroprotectin D1 on isoflurane－induced neuronal apoptosis

圖5 Neuroprotectin D1對(duì)異氟烷所致Bax上調(diào)和Bcl－2下調(diào)的影響Fig.5 Effects of Neuroprotectin D1 on isoflurane－induced alterations of neuronal Bax and Bcl－2 protein expression

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期吸入麻醉藥（如異氟烷）暴露可導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)毒性，并誘發(fā)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙［11］。異氟烷導(dǎo)致發(fā)育期神經(jīng)毒性的機(jī)制主要有:一方面增高發(fā)育期神經(jīng)元鈣離子濃度［12］，干擾線粒體功能［13］，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡；另一方面抑制神經(jīng)元突觸傳遞并導(dǎo)致神經(jīng)元突觸功能異常［14］。進(jìn)一步研究顯示，異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元凋亡和突觸功能障礙可能與異氟烷所致炎癥反應(yīng)相關(guān)。異氟烷可誘發(fā)胎鼠海馬神經(jīng)元促炎因子（如IL－1β和TNF－α）釋放［2］。這些神經(jīng)元促炎因子釋放可導(dǎo)致神經(jīng)元谷氨酸產(chǎn)生增多［15］，誘發(fā)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，促使線粒體功能紊亂，進(jìn)而細(xì)胞凋亡［16］；另一方面，促使神經(jīng)元內(nèi)誘發(fā)型一氧化氮合酶（i NOS）的表達(dá)，進(jìn)而加劇發(fā)育期神經(jīng)元突觸功能障礙［1718］。由此可見，炎癥反應(yīng)在異氟烷所致的發(fā)育期神經(jīng)毒性中起到十分重要的作用。

腦組織中，海馬是管理學(xué)習(xí)和記憶功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［19］。而孕16～18 d是胎鼠海馬發(fā)育和神經(jīng)元突觸形成的關(guān)鍵時(shí)期［20］。在此期間，異氟烷處理可導(dǎo)致胎鼠神經(jīng)元凋亡和突觸功能異常［21］。體外培養(yǎng)5 d胎鼠海馬神經(jīng)元也已成為研究發(fā)育期全身麻醉藥神經(jīng)毒性的常用模型［2122］，故本研究采用培養(yǎng)5 d胎鼠海馬神經(jīng)元構(gòu)建異氟烷發(fā)育期神經(jīng)毒性模型。與前期結(jié)果一致，本研究結(jié)果表明異氟烷可增加胎鼠海馬神經(jīng)元活化Caspase－3表達(dá)，促進(jìn)促凋亡相關(guān)分子Bax表達(dá)而抑制抗凋亡分子Bcl－2表達(dá)。這就說明，異氟烷發(fā)育期神經(jīng)毒性模型制作成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Neuroprotectin D1是二十二碳六烯酸（DHA）衍生物［3］。研究發(fā)現(xiàn)，Neuroprotectin D1及其類似物具有顯著的抗炎和腦保護(hù)作用［23］。Neuroprotectin D1一方面可通過抑制促炎相關(guān)基因表達(dá)并緩解毒性過氧化物表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡［24］；另一方面，可通過抑制TRPV1和TNF－α介導(dǎo)突觸功能損傷達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元突觸可塑性的作用［2526］。本研究采用不同濃度Neuroprotectin D1（25、50或75 nmol／L）干預(yù)胎鼠海馬神經(jīng)元，觀察其對(duì)異氟烷所致發(fā)育期促炎因子釋放的影響。與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2］，本研究結(jié)果表明，2%異氟烷處理6 h可以顯著升高胎鼠海馬神經(jīng)元IL－1β和TNF－α表達(dá)水平。而25、50和75 nmol／L Neuroprotectin D1均能顯著緩解異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元IL－1β和TNF－α表達(dá)上調(diào)，這就提示Neuroprotectin D1可能是緩解異氟烷發(fā)育期促炎因子釋放的重要物質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷誘發(fā)的神經(jīng)元毒性與其所致神經(jīng)元促炎因子（如IL－1β和TNF－α）釋放有關(guān)［2］。而近期研究表明，Neuroprotectin D1不僅可緩解促炎因子（如IL－1β和TNF－α）釋放，亦可有效緩解阿爾茨海默病［4］和蛋白毒性［27］體外模型中凋亡信號(hào)通路激活。在阿爾茨海默病［4］體外模型中，Neuroprotectin D1可通過下調(diào)凋亡相關(guān)分子Bax和上調(diào)抗凋亡分子Bcl－2緩解細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，2%異氟烷處理6 h可以顯著增加胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)（AI）及活化Caspase－3、凋亡相關(guān)分子Bax蛋白表達(dá)，同時(shí)減少抗凋亡分子Bcl－2蛋白表達(dá)。而50 nmol／L和75 nmol／L Neuroprotectin D1能顯著緩解異氟烷所致神經(jīng)元凋亡指數(shù)（AI）增加及活化Caspase－3、凋亡相關(guān)分子Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，并恢復(fù)異氟烷所致抗凋亡分子Bcl－2蛋白表達(dá)下調(diào)。這就提示Neuroprotectin D1可能通過下調(diào)凋亡相關(guān)分子Bax和上調(diào)抗凋亡分子Bcl－2的表達(dá)從而減少異氟烷所致發(fā)育期神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，Neuroprotectin D1通過緩解促炎因子釋放，調(diào)節(jié)Bcl－2和Bax表達(dá)，進(jìn)而緩解異氟烷所致的胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

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（2015－03－03 收稿）

Neuroprotective Effects of Neuroprotectin D1 on Isofluane－induced Apoptosis and Inflammatory Response in Hippocampal Neurons of Fetal Rats

Chen Xin，Wang Wei，Zhang Jianfang et al
Department of Anesthesiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the neuroprotective effects of Neuroprotectin D1 on isofluane－induced apoptosis and inflammatory response in hippocampal neurons of fetal rats.Methods Sixteen－to 18－day pregnant Sprague Dawley rats were anesthetized.The fetal rats were obtained under sterile condition and decapitated.The hippocampal neurons were isolated and cultured for 5 days.Then these neurons were randomly divided into 5 groups:Control group（group C），Isoflurane group（group I）and Neuroprotectin D1（at 3 different concentrations）＋I(xiàn)soflurane group（group NPD11－3）.Group C

control gas（30% oxygen and 5%carbon dioxide）exposure for 6 h.Group I and NPD11－3received 2%isoflurane exposure for 6 h.For group NPD11－3，neurons were incubated with Neuroprotectin D1 at the concentrations of 25，50 and 75 nmol／L，respectively 30 min before isoflurane exposure.MTT was used to detect cell viability.TUNEL assays were used to detect cell apoptosis.Western blotting was conducted to detect protein expression of active Caspase－3，Bax，Bcl－2，IL－1βand TNF－α.Results Compared with group C，the percentage of TUNEL－positive cells and the protein levels of active Caspase－3，Bax，IL－1βand TNF－αwere significantly increased in the neurons in group I（P＜0.01）.Compared with group C，cell viability and the protein level of Bcl－2 were significantly decreased in the neurons in group I（P＜0.05）.Compared with group I，the protein levels of IL－1βand TNF－αwere significantly decreased in the neurons in group NPD11－3（P＜0.05）.Compared with group I，the percentage of TUNEL－positive cells and the protein levels of active Caspase－3 and Bax were significantly decreased in the neurons in group NPD12－3（P＜0.05）.Compared with group I，cell viability and the protein level of Bcl－2 in the neurons in group NPD11－3were significantly increased（P＜0.05）.Conclusion Neuroprotectin D1 can protect the hippocampal neurons of fetal rats from apoptosis triggered by isoflurane via down－regulating IL－1βand TNF－αproduction and regulating the expression of Bcl－2 and Bax.

Neuroprotectin D1； isoflurane； neuron； apoptosis； inflammatory response

R742.8

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.001

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81271233）

陳 欣，男，1987年生，博士研究生，E－mail:chen_xinrandom＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:alluo＠tjh.tjmu.edu.cn