農(nóng)桿菌介導(dǎo)的朝鮮堿茅PuP5CS基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究

徐 博，任 偉，王英哲，孫啟忠，郭 瑋，婁玉杰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 公主嶺136100；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 4.吉林省畜牧總站，吉林 長(zhǎng)春 130062)

植物生產(chǎn)層

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的朝鮮堿茅PuP5CS基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究

徐 博1，任 偉2，王英哲3，孫啟忠3，郭 瑋4，婁玉杰1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 公主嶺136100；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 4.吉林省畜牧總站，吉林 長(zhǎng)春 130062)

為提高紫花苜蓿(Medicagosativa)的抗逆性，利用在朝鮮堿茅(Puccinelliachinampoensis)已克隆的PuP5CS基因成功構(gòu)建了pCAMBIA3300-PuP5CS表達(dá)載體，以子葉為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿“公農(nóng)5號(hào)” (M.sativacv.Gongnong No.5)，并以2.0 mg·L-1的草銨膦進(jìn)行篩選，抗性愈傷組織誘導(dǎo)率為22.4%，經(jīng)草銨膦篩選的植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，共獲得11株轉(zhuǎn)化植株，表明PuP5CS基因已轉(zhuǎn)入T0紫花苜蓿植株，且能夠在RNA水平上正常表達(dá)。

PuP5CS；紫花苜蓿；遺傳轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

目前，土壤的鹽漬化已經(jīng)成為制約牧草生產(chǎn)的環(huán)境因子之一，在一定程度上限制了優(yōu)良牧草品種在我國(guó)北方牧草主產(chǎn)區(qū)的應(yīng)用[1]。作為世界上最重要的牧草之一，紫花苜蓿(Medicagosativa)享有“牧草之王”的美譽(yù)，具有分布廣泛、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，目前我國(guó)也選育出了多個(gè)耐鹽型紫花苜蓿品種[2-3]。作為我國(guó)東北地區(qū)的當(dāng)家苜蓿品種之一，“公農(nóng)5號(hào)”具產(chǎn)量高、抗旱性好等優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)東北地區(qū)近年來大量推廣種植的苜蓿品種之一。而利用生物技術(shù)手段獲得轉(zhuǎn)基因育種材料也是育種家在除傳統(tǒng)育種方式以外，在新品種選育方面經(jīng)常利用的一項(xiàng)技術(shù)[4]。

△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物脯氨酸合成的關(guān)鍵酶和限速酶，在受到外界脅迫條件下，P5CS基因能夠增加細(xì)胞質(zhì)中脯氨酸的合成，從而提高植物的抗逆性，但其合成也受到脯氨酸的反饋抑制[5-7]。近年來，許多學(xué)者克隆了P5CS的同源基因并進(jìn)行了其表達(dá)分析研究[8-10]。在NaCl處理?xiàng)l件下，P5CS基因在葉片里的相對(duì)表達(dá)量都高于對(duì)照[11-12]。李志亮等[10]將P5CS基因?qū)敫哐蛎?Festucaelata)后，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量比正常植株提高了31%～83%，其抗旱性也高于對(duì)照。轉(zhuǎn)P5CS基因的蒙農(nóng)冰草(Agropyroncristatum)在鹽脅迫的條件下，其游離脯氨酸的含量增加較快，耐鹽性明顯增加[13]。

目前對(duì)于紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的研究較多，方法上傾向于利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[14]。而為了達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)化效率，針對(duì)不同的受體基因型、不同的植物受體的研究顯得尤為重要。本研究的目的基因PuP5CS基因是從朝鮮堿茅(Puccinelliachinampoensis)中克隆得到的，通過構(gòu)建含目的基因及帶bar篩選基因的植物表達(dá)載體，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將PuP5CS基因整合到紫花苜蓿的基因組中，以期得到轉(zhuǎn)基因植株，為未來檢驗(yàn)PuP5CS基因能提高苜蓿抗逆性、進(jìn)而得到具有更強(qiáng)抗逆性的轉(zhuǎn)基因材料，以及紫花苜蓿的抗逆育種研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 紫花苜蓿所用材料為公農(nóng)5號(hào)(M.sativacv. Gongnong No.5)，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 質(zhì)粒選用含bar基因的pCAMBIA3300，由吉林省農(nóng)科院轉(zhuǎn)基因中心提供。大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌LBA4404均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑 產(chǎn)品由Takara公司提供，限制性內(nèi)切酶、RNaseA、Taq酶、dNTP、T4連接酶等由Takara公司提供；反轉(zhuǎn)錄酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒由OMEGA公司提供，DNA的提取選用OMEGA的E.Z.N.A.?Plant DNA Kit，頭孢霉素(Cef)、利福平(Rif)、鏈霉素(Str)卡那霉素(Km)、草銨膦(glufosinate-ammonium)購自Sigma公司提供，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)朝鮮堿茅PuP5CS基因的DNA序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物均由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 植物表達(dá)載體 pCAMBIA3300-PuP5CS的構(gòu)建 根據(jù)PuP5CS基因的序列和選取的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，由于選用的酶切位點(diǎn)為XbaI和SacI，引物序列為：PF(5′-TCTAGAATGGCCACCGCGGACC-3′)；PR(5′-GAGCTCTCATTG CAAAGGAAGGTTCTTATG-3′)。采用XbaI和SacI雙酶切pMD18-T-PuP5CS和pCAMBIA3300載體，分別回收載體片段，將PuP5CS基因和pCAMBIA3300載體片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基(含Kan抗性)平板上進(jìn)行篩選，挑取陽性單菌落進(jìn)行菌液PCR，經(jīng)酶切和PCR鑒定，構(gòu)建植物表達(dá)載體。

1.2.3 表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得 利用凍融法制備農(nóng)桿菌感受態(tài),并將表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404在培養(yǎng)基[YEP+25 mg·L-1Rif+100 mg·L-1Kan]上進(jìn)行篩選，利用PCR法進(jìn)行菌落鑒定。

1.2.4 紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化和草銨膦抗性篩選 將紫花苜蓿種子先用70%酒精處理2 min，20%次氯酸鈉滅菌30 min，無菌水沖洗5次后4 ℃保存一夜，再用20%次氯酸鈉滅菌30 min，無菌水沖洗5次后接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌苗。以培養(yǎng)7 d無菌苗的子葉為外植體，在活化后的農(nóng)桿菌(含PuP5CS)菌液中侵染30 min，在愈傷誘導(dǎo)共培養(yǎng)基[UM+2 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)+0.25 mg·L-1KT(kinetin)]上共培養(yǎng)3 d，移入含草銨膦濃度為0、1、2、3 mg·L-1四個(gè)梯度愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基[UM+2 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1KT+350 mg·L-1Cef(cefotaxime)]上，每個(gè)培養(yǎng)基中擺放20個(gè)外植體，共設(shè)置5個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)7 d和20 d時(shí)觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)以確定草銨膦的最佳篩選濃度。愈傷誘導(dǎo)20 d后移入含草銨膦的分化篩選培養(yǎng)基[UM+1.2 mg·L-1KT+350 mg·L-1Cef]中，分化培養(yǎng)40 d后移入減半后的含草銨膦生根篩選培養(yǎng)基[1/2 MS+350 mg·L-1Cef]中培養(yǎng)至得到紫花苜?？剐赞D(zhuǎn)化植株。

1.2.5 抗性轉(zhuǎn)化的分子檢測(cè) 紫花苜蓿葉片的DNA提取按照OMEGA的Plant DNA Mini Kit說明書進(jìn)行，RNA提取采用Trizol法，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后備用。以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株作為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)，體系為25 μL，反應(yīng)條件同上。根據(jù)bar基因的序列設(shè)計(jì)引物BF(5′-GGTCTAGAATGAGCCCAGAACGACGCC-3′)和BR(5′-CTCGGATCCTCAGATCTCG GTGAC-3′)進(jìn)行bar基因的PCR檢測(cè)。RT-PCR檢測(cè)根據(jù)PuP5CS序列用設(shè)計(jì)好的引物(PF5′-TCTAGAATGGCCACCGCGGACC-3′)和(PR5′-GAGCTCTCATTGCAAAGGAAGGTTCTTATG-3′)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS的鑒定

所構(gòu)建的pCAMBIA3300-PuP5CS載體的圖譜見圖1，選擇了XbaI位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)，根據(jù)這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)，進(jìn)行雙酶切鑒定，得到兩個(gè)片段，其中2 100 bp左右的片段為PuP5CS，依照電泳的結(jié)果(圖2)，驗(yàn)證了所構(gòu)建的pCAMBIA3300-PuP5CS載體是正確的，能夠用于后續(xù)的紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

通過利用凍融法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，28 ℃培養(yǎng)48 h后挑取5個(gè)單菌落，搖菌后進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，5個(gè)單菌落都能夠擴(kuò)增出PuP5CS的特異性片段，約2 100 bp(圖3)，說明表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS的酶切位點(diǎn)和圖譜Fig.1 Sketch map and restriction sites of pCAMBIA3300-PuP5CS

圖2 pCAMBIA3300-PuP5CS重組載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of pCAMBIA3300-PuP5CSwith Xba I and Sac I

注：Maker為DNA Marker DL15000 plus；1為質(zhì)粒pCAMBIA3300-PuP5CS； 2為Xba I和Sac I雙酶切質(zhì)粒。

Note: M, DNA Marker DL15000 plus;1, pCAMBIA3300-PuP5CS; 2, Double-enzyme cleavage with Xba I and Sac I.

圖3 pCAMBIA3300-PuP5CS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pCAMBIA3300-PuP5CSagrobacterium independent

2.3 草銨膦選擇壓的確定

不同草銨膦濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響見表1。隨著培養(yǎng)時(shí)間從7 d增加到20 d，愈傷組織受草銨膦的影響逐漸顯現(xiàn)，因此培養(yǎng)20 d的愈傷組織誘導(dǎo)率低于培養(yǎng)7 d的愈傷組織誘導(dǎo)率。在草銨膦濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的影響，在培養(yǎng)20 d后，部分愈傷褐化并最終死亡，最終誘導(dǎo)率為65%。而在草銨膦濃度達(dá)到2.0 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)7 d時(shí)愈傷組織褐化現(xiàn)象就較為明顯，且愈傷誘導(dǎo)率顯著下降(31%)，而在培養(yǎng)20 d后，只有10個(gè)外植體誘導(dǎo)出愈傷而沒有褐化。而當(dāng)草銨膦的濃度增加到3.0 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)7 d所有愈傷組織均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，所有的外植體都沒能夠誘導(dǎo)出愈傷組織就已經(jīng)死亡。因此選擇2.0 mg·L-1草銨膦作為篩選壓。

表1 不同草銨膦濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

注：同列不同小寫字母表示不同濃度間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference among different concentration of glufosinate ammonium at 0.05 level.

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后抗性愈傷的分化及幼苗的獲得

子葉在經(jīng)農(nóng)桿菌侵染30 min后，經(jīng)過3 d的共培養(yǎng)(圖4A)，轉(zhuǎn)移至愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基[UM+2.0 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)+0.25 mg·L-1KT(kinetin)+2.0 mg·L-1草銨膦+350 mg·L-1Cef(cefotaxime)]上培養(yǎng)20 d，后移入分化篩選培養(yǎng)基[UM+1.2 mg·L-1KT+2.0 g·L-1草銨膦+350 mg·L-1Cef]培養(yǎng)40 d，非抗性愈傷逐漸褐化并且沒有愈傷組織產(chǎn)生，而抗性愈傷組織表面分生出綠色點(diǎn)狀組織(圖4B)，參試的250個(gè)外植體共獲得56個(gè)抗性愈傷組織，抗性愈傷組織獲得率為22.4%，抗性愈傷組織逐漸分化成苗(圖4C)，成苗后再轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基[1/2 MS+1.0 mg·L-1草銨膦+350 mg·L-1Cef ]后生根(圖4D)，待根系足夠發(fā)達(dá)后移栽至小盆中，共獲得13株抗性苗。

2.5 抗性轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定

將獲得的草銨膦抗性植株移栽至花盆中后，共獲得的13株存活植株，在其中選取8株，提取DNA，以質(zhì)粒pCAMBIA3300-PuP5CS為陽性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，部分抗性轉(zhuǎn)化植株能夠擴(kuò)增出2 100 bp左右的特異性條帶，在陰性對(duì)照泳道上則沒有該特異性條帶，通過引物BF和BR進(jìn)行bar基因的檢測(cè)結(jié)果(圖6)，可以認(rèn)為目的基因PuP5CS已經(jīng)整合到公農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿的基因組中(圖5)。

圖4 公農(nóng)2號(hào)紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.4 Genetic transformation system of Madicago sativa cv. Gongnong No.5

注：A，共培養(yǎng)；B，胚性愈傷；C，分化；D，誘導(dǎo)生根。

Note: A, coculture； B, callus induction； C, regeneration； D, rooting.

圖5 轉(zhuǎn)PuP5CS苜蓿的PCR檢測(cè)Fig.5 The PCR analysis of transgenic plant

注：Maker為DL15000；CK+為質(zhì)粒DNA；CK-為野生型陰性對(duì)照；1,2,3,4,5,6,7,8分別為檢測(cè)DNA樣品。

Note: M, DNA Marker DL15000; CK+, plasmid DNA; CK-, wild type plant;1,2,3,4,5,6,7,8,DNA samples.

圖6 轉(zhuǎn)PuP5CS苜蓿的bar基因PCR檢測(cè)Fig.6 The PCR analysis of transgenic plant

注：Maker為DL2000；CK+為質(zhì)粒DNA，CK-為野生型陰性對(duì)照，1,2,3,4,5,6,7,8分別為檢測(cè)DNA樣品。

Note: M, DNA Marker DL2000; CK+, plasmid DNA; CK-, wild type plant;1,2,3,4,5,6,7,8,DNA samples.

2.6 抗性轉(zhuǎn)化植株

為了在mRNA水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)PuP5CS抗性轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)情況，選取PCR鑒定為陽性的再生植株，進(jìn)行RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈。以引物BF,BR進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，選擇PCR鑒定陽性的植株進(jìn)行檢測(cè)，在2 100 bp左右檢測(cè)到了條帶，且與目的片段的大小一致，該基因可以在抗性轉(zhuǎn)化紫花苜蓿植株中轉(zhuǎn)錄為mRNA，在RNA水平能夠被檢測(cè)到(圖7)，最終共獲得11株抗性植株。

圖7 轉(zhuǎn)PuP5CS苜蓿的RT-PCR檢測(cè)Fig.7 The RT-PCR testing of PuP5CS transgenic plant

注：Maker為DL15000；CK+為質(zhì)粒DNA，CK-為PCR檢測(cè)陰性植株，1,4,5分別為PCR鑒定陽性植株。

Note: M, DNA Marker DL15000; CK+, plasmid DNA; CK, non-transgenic plant; 2, 4, 5, cDNA of transgenic plants.

3 討論和結(jié)論

3.1 pCAMBIA3300-PuP5CS表達(dá)載體的構(gòu)建

是否能夠構(gòu)建一個(gè)含目的基因的高效植物表達(dá)載體，是成功進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要前提之一。本研究成功構(gòu)建了由CaMV35s強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的脯氨酸合成酶PuP5CS的植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-PuP5CS，并轉(zhuǎn)入LBA4404農(nóng)桿菌中，能夠?yàn)檫M(jìn)一步進(jìn)行紫花苜蓿農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。目前在植物表達(dá)載體的構(gòu)建中，多使用CaMV35s強(qiáng)啟動(dòng)子[15-16]，使外源基因能夠在植物的各個(gè)部位都能表達(dá)，但相對(duì)特異性較差，外源基因可能會(huì)在植物體內(nèi)表達(dá)出無功能的蛋白質(zhì)，從而影響正常生理代謝。在下一步的工作中，希望能夠構(gòu)建用于PuP5CS的特異性啟動(dòng)子來替換CaMV35s啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，以更有利于獲得抗逆性強(qiáng)的紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

3.2 侵染材料的選擇

對(duì)于農(nóng)桿菌侵染的受體，一般選擇由外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，愈傷組織的細(xì)胞分裂旺盛，對(duì)于外源DNA的轉(zhuǎn)入效果好[17-18]。但在紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化中，由于紫花苜蓿外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地松軟，在農(nóng)桿菌侵染過程中極易碎裂成小塊，在后續(xù)試驗(yàn)中帶來很多困擾的因素，因此大部分學(xué)者雖然選擇了不同外植體作為侵染材料，而較少使用愈傷組織[19-20]，驗(yàn)證了以外植體為農(nóng)桿菌侵染的受體也是可行的。而本研究中通過之前研究中得出的結(jié)果，選用子葉作為侵染材料，并最終獲得了抗性轉(zhuǎn)化植株，因此在以“公農(nóng)5號(hào)”為材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，使用子葉作為外植體是可行的。

3.3 草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

由于選用了pCAMBIA3300載體進(jìn)行雙元表達(dá)載體的構(gòu)建，其篩選基因?yàn)閎ar基因。相對(duì)于其他載體的篩選基因，其篩選效果較好，在本研究中紫花苜蓿對(duì)于草銨膦的敏感程度也很高。在進(jìn)行的草銨膦選擇壓的確定時(shí)，選擇了愈傷誘導(dǎo)階段能夠誘導(dǎo)出愈傷的數(shù)量作為判斷紫花苜蓿選擇壓的標(biāo)準(zhǔn)。而在進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化苜蓿的試驗(yàn)中，選擇了分化期才加入草銨膦進(jìn)行篩選，這主要是為了能夠得到更多的分化植株，也是為了避免草銨膦對(duì)愈傷誘導(dǎo)和生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。而在生根期，由于考慮到生根對(duì)于篩選壓的承受能力較差，過于敏感，適當(dāng)降低了選擇壓，使用了1.0 mg·L-1的草銨膦在這一步驟進(jìn)行篩選。草銨膦在分化初期就能夠篩選掉大量的愈傷組織，盡管在試驗(yàn)的過程中，大量侵染后的外植體在誘導(dǎo)分化為植株的過程中被篩選掉，最終得到的植株數(shù)量也非常少，但經(jīng)篩選得到的陽性植株基本都能確定為轉(zhuǎn)基因植株，大大節(jié)省了組培過程中的培養(yǎng)基配制等工作，以及植株移栽后的DNA提取、PCR檢測(cè)等工作所用的時(shí)間。在未來大量進(jìn)行苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，是一種非常有效的篩選基因。

為提高紫花苜蓿的抗逆性，本研究利用已克隆的朝鮮堿茅PuP5CS成功構(gòu)建了pCAMBIA3300-PuP5CS表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，得到了經(jīng)草銨膦篩選的抗性植株，目的基因和bar基因的PCR檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明PuP5CS已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入紫花苜蓿的基因組當(dāng)中，且能夠正常表達(dá)，共獲得11個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，為紫花苜蓿耐鹽新品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

致謝：該論文是第二屆全國(guó)草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文，并得到中國(guó)草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Transformation ofPuccinelliachinampoensisPuP5CSgene into alfalfa withAgrobacterium-mediated method

XU Bo1, REN Wei2, WANG Ying-zhe3, SUN Qi-zhong3, GUO Wei4, LOU Yu-jie1

(1.College of animal science and technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling 136100, China; 3.Grassland Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences，Huhhot 010010, China; 4.Jilin province animal husbandry, Changchun 130062, China)

In order to cultivate resistance alfalfa (Medicagosativa), the plant expression vector pCAMBIA3300-PuP5CSwas constructed and transformed into alfalfa from cotyledon via agrobacterium mediated. The transformed plants were selected with 2.0 mg·L-1glufosinate ammonium and the ratio of transformation callus differentiation was 22.4%. Eleven transformed plants were identified as positive in the gene expression by PCR and RT-PCR which suggested that thePuP5CSgene had been integrated into the genome of the regenerated plants.

PuP5CSgene; alfalfa; genetic transformation;Agrobacterium-mediated

LOU Yu-jie E-mail：lyjjlau@163.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0556

2014-12-08 接受日期：2015-03-03

吉林省科技廳青年科研基金(20140520177JH);吉教科合字[2015]第197號(hào)

徐博(1983-)，男，吉林公主嶺人,講師，博士，研究方向?yàn)槟敛莘N質(zhì)資源開發(fā)與利用、牧草育種。E-mail：xubo0308@126.com

婁玉杰(1956-)，女,吉林省吉林市人,教授，博導(dǎo)，博士,研究方向?yàn)槟敛蒿暳腺Y源開發(fā)與利用。 E-mail：lyjjlau@163.com

S816;Q943.2

A

1001-0629(2015)06-0895-06

徐博,任偉,王英哲,孫啟忠,郭瑋,婁玉杰.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的朝鮮堿茅PuP5CS基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(6):895-901.

XU Bo,REN Wei,WANG Ying-zhe,SUN Qi-zhong,GUO Wei,LOU Yu-jie.Transformation ofPuccinelliachinampoensisPuP5CSgene into alfalfa withAgrobacterium-mediated method[J].Pratacultural Science，2015,32(6)：895-901.