TGF-β1促進(jìn)食管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生發(fā)展

王 棟， 劉 清， 鄭樹濤， 劉 濤， 戴 芳， 楊晨晨， 盧曉梅， 買買提艾力·吾馬爾

(1新疆醫(yī)科大學(xué), 烏魯木齊 830011， 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院；3新疆維吾爾自治區(qū)食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

TGF-β1促進(jìn)食管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生發(fā)展

王 棟1,2， 劉 清2， 鄭樹濤2， 劉 濤2， 戴 芳2， 楊晨晨1， 盧曉梅3， 買買提艾力·吾馬爾1

(1新疆醫(yī)科大學(xué), 烏魯木齊 830011，2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院；3新疆維吾爾自治區(qū)食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)在促進(jìn)食管癌Eca109細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法 利用TGF-β1受體抑制劑和病毒轉(zhuǎn)染TGF-β1 干擾RNA(siRNA)處理Eca109細(xì)胞，分為3組：實(shí)驗(yàn)組(病毒穩(wěn)定TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列Eca109細(xì)胞)、空白對照組(正常未經(jīng)任何處理的Eca109細(xì)胞)，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測TGF-β1及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)指標(biāo)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)]在mRNA水平表達(dá)情況；EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白(E-cadherin、Vimentin)的表達(dá)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell法分別檢測細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的變化情況。結(jié)果 通過TGF-β1受體抑制劑(0、0.1、1、10 μm/mL)處理Eca109細(xì)胞后，在mRNA水平TGF-β1表達(dá)逐漸降低， E-cadherin表達(dá)逐漸升高，Vimentin、Snail表達(dá)逐漸降低(P<0.05)；在蛋白水平，E-cadherin表達(dá)逐漸升高，Vimentin表達(dá)逐漸降低，細(xì)胞增殖和遷移能力也逐漸降低(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與空白對照組和陰性對照組相比，在mRNA水平實(shí)驗(yàn)組TGF-β1表達(dá)降低(P<0.05)；在蛋白水平，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin表達(dá)增高，Vimentin表達(dá)降低；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均降低(P<0.05)。結(jié)論 在細(xì)胞水平，TGF-β1可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)；食管鱗癌；RNA干擾(RNAi)； 細(xì)胞增殖；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)

食管癌是我國最高發(fā)的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)食管鱗癌占所有食管癌的90%[1]。食管癌發(fā)病呈明顯的地區(qū)差異，新疆是其高發(fā)區(qū)[2]。食管癌病程進(jìn)展快，早期不易被發(fā)現(xiàn)，但較早發(fā)生鄰近組織和遠(yuǎn)端組織的轉(zhuǎn)移，以及對周圍組織的侵襲，大部分病人就診時病變已處于中晚期，造成其生存率普遍很低，其中75%的病人生存期少于1 a，癌的浸潤轉(zhuǎn)移是病人死亡的主要原因。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞通過特定程序喪失上皮表型而轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，與腫瘤細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[3-4]。轉(zhuǎn)化生子因子(TGF-β1)是調(diào)節(jié)腫瘤EMT的關(guān)鍵因子。本研究在細(xì)胞水平通過mRNA、蛋白、細(xì)胞功能學(xué)等實(shí)驗(yàn)探討TGF-β1在促進(jìn)食管癌Eca109細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，DMSO(美國Invitrogen公司)，慢病毒TGF-β1及陰性對照病毒(上海吉凱公司)，食管鱗癌細(xì)胞系Eca109(武漢大學(xué)細(xì)胞庫)。TRizol試劑(invitrogen)， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(thermo)，SYBRⅡ熒光試劑盒(Takara)，BCA蛋定量白試劑盒，Vimentin抗體(Santa Cruz)，E-cadherin抗體及GAPDH抗體(Santa Cruz)，transwell小室(Corning Costar, 8 μm)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管鱗癌細(xì)胞系Eca109用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。細(xì)胞均在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育。

1.2.2 TGF-β1抑制劑處理Eca109細(xì)胞 將正常Eca109細(xì)胞消化收集細(xì)胞沉淀，用含有1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，6孔板每孔接種細(xì)胞3×105個細(xì)胞，分為4組，每組做3個復(fù)孔，分別用TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μmol/mL處理Eca109細(xì)胞48 h，用含有1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育。

1.2.3 TGF-β siRNA病毒轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞 將正常Eca109細(xì)胞消化收集細(xì)胞沉淀，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，分為3組：空白對照組(正常未經(jīng)過任何處理的Eca109細(xì)胞)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染TFG-β1 siRNA)，每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞消化收集做流式分選，將分選收集的細(xì)胞重新種板培養(yǎng)。

1.2.4 實(shí)時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qRT-PCR) 將收集的Eca109細(xì)胞同TRizol試劑處理提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Random Primer和Oligdt primer分別反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，SYBRⅡ熒光試劑盒對反轉(zhuǎn)錄的cDNA做RT-PCR，反應(yīng)條件：初始變性，95℃反應(yīng)10 min；變性，95℃反應(yīng)15 s；退火，55℃(β-actin)、57℃(Vimentin)、59℃(TGF-β)、62℃(E-cadherin、Snail)反應(yīng)30 s；延伸，72℃反應(yīng)30 s，3個步驟共進(jìn)行40個循環(huán)。β-actin作為mRNA的內(nèi)參，結(jié)果用log10(2-ΔΔCt)法進(jìn)行相對定量比較，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR所用引物序列見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR所用引物序列表

1.2.5 Western blot測定EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 測定蛋白濃度(BCA蛋定量白試劑盒)并調(diào)整蛋白上樣量為50 μg/孔。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入Vimentin抗體、E-cadherin抗體及GAPDH抗體。4℃搖床孵育過夜。加入二抗孵育2 h，化學(xué)試劑發(fā)光法(ECL)顯色。

1.2.6 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 每孔接種3×103個對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)4個復(fù)孔，分別于孵育0、24、48、72、96 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL的DMSO(二甲基亞砜)，充分震蕩混勻后，用酶標(biāo)儀測490 nm處吸光度值。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔板每孔接種5×105個細(xì)胞，過夜鋪滿6孔板，用10 μL無菌槍頭在每孔底部輕劃1條粗細(xì)均勻、力度和角度一致的直線。分別于0、24、48、72 h在倒置顯微鏡下的同一視野觀察劃痕寬度并拍照。

1.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取24孔板，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，每組細(xì)胞按3×105個用無血清RPMI1640培養(yǎng)基混勻接種于transwell小室上室，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定2 min，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗，在200倍視野下觀察，每一樣本隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)每個視野下染色細(xì)胞數(shù)量，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 用TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細(xì)胞后TGF-β1及EMT相關(guān)指標(biāo)mRNA的表達(dá)隨著TGF-β1受體抑制劑濃度的提高，TGF-β1表達(dá)量逐漸降低， EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin表達(dá)量逐漸升高，Vimentin、snail表達(dá)量逐漸降低，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 用TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細(xì)胞后EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白的表達(dá)分別用TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細(xì)胞48 h后，用Western blot檢測各組細(xì)胞Vimentin、E-cadherin、GAPDH蛋白的表達(dá)。抑制TGF-β1受體后能夠降低間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)，增加上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，從而延緩EMT的進(jìn)程(圖2)。

2.3 MTT檢測TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細(xì)胞后細(xì)胞增殖能力變化隨著TGF-β1抑制劑的濃度提高，Eca109細(xì)胞增殖能力減緩，與0 h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

與TGF-β1受體抑制劑0μm/mL比較，*P<0.05。

圖1 用TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細(xì)胞TGF-β、E-caherin、Vimentin、Snail的mRNA相對表達(dá)量

圖2 Western blot檢測TGF-β1受體抑制劑梯度抑制Eca109細(xì)胞后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖3 TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細(xì)胞的細(xì)胞增殖曲線

2.4 細(xì)胞劃痕檢測TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細(xì)胞后細(xì)胞遷移能力變化隨著TGF-β1受體抑制劑濃度的提高，細(xì)胞遷移速度顯著減慢，72 h后陰性對照組細(xì)胞劃痕寬度明顯減小(P<0.05) (圖4)。

2.5 熒光檢測Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染TGF-β1 siRNA效果熒光倒置顯微鏡下觀察見綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染效果良好(圖5)。

2.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1 siRNA后Eca109細(xì)胞中TGF-β1的mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)TGF-β1 mRNA表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖4 TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力比較(×100)

圖5 TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞

圖6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Eca109細(xì)胞TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量

2.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1 siRNA后Eca109細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯高于陰性對照組和空白對照組，而Vimentin表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組(圖7)。

圖7 Western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)TGF-β1 siRNA后Eca109細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.8 MTT檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1 siRNA的Eca109的細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)組增殖能力顯著低于陰性對照組和空白對照組，72、96 h時間段組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖8)。

圖8 MTT實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)TGF-β1 siRNA的Eca109細(xì)胞增殖能力

2.9 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1 siRNA后Eca109的細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的劃痕愈合能力明顯低于空白對照組及陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空白對照組與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) (圖9)。

圖9 穩(wěn)轉(zhuǎn)TGF-β1 siRNA實(shí)驗(yàn)組與空白對照組和陰性對照組的細(xì)胞遷移能力試驗(yàn)

2.10 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)TGF-β1 siRNA的Eca109的細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力顯著小于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)。而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖10)。

3 討論

食管鱗癌是我國常見的惡性腫瘤之一。大部分病人在就診時已處于食管癌晚期，出現(xiàn)了浸潤和轉(zhuǎn)移，因此從分子水平研究食管癌發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)原理更為重要。EMT是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生、發(fā)展中的重要過程，以間質(zhì)特征的獲得及其上皮細(xì)胞極性的喪失為主要特征，在腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。許多相關(guān)EMT相關(guān)因子如血管生成因子、細(xì)胞生長因子等在腫瘤早期促進(jìn)了EMT的發(fā)展。許多研究證實(shí)TGF-β1作為生長因子的一種可通過多種途徑促進(jìn)EMT的進(jìn)程。已有研究表明TGF-β通過經(jīng)典的TGF-β/Smad途徑誘導(dǎo)多種基因如HMGA2[5]、Ets1[6]等促進(jìn)EMT的發(fā)展，除了Smads，TGF-β還可介導(dǎo)其他信號通路調(diào)節(jié)EMT，包括Erk、PI3K-Akt、RhoA、cofilin等[7-8]。

a：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)圖示結(jié)果(100×)

b: 100倍視野下細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

本研究首先在細(xì)胞水平探討了TGF-β1生長因子與食管鱗癌的EMT的相關(guān)性，進(jìn)而利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法干擾TGF-β1的表達(dá)后，分別從EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化以及細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等方面，從分子水平和細(xì)胞功能方面探討了TGF-β1與EMT的關(guān)系，以期為進(jìn)一步深入研究食管癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

在癌癥的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中，TGF-β1具有兩面性，在癌癥早期可起到抑癌作用。Kang等[9]研究表明TGF-β可通過Smad通路抑制乳腺的骨轉(zhuǎn)移； Padua等[10]研究表明TGF-β可通過誘導(dǎo)ANGPTL4的分泌促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移，Gao等[11]研究表明TGF-β可通過抑制BMP的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌往遠(yuǎn)處的定植轉(zhuǎn)移，而起到促進(jìn)EMT的致癌作用。本研究首先從TGF-β1受體方面證明了抑制TGF-β1受體后能夠抑制食管癌的增殖和遷移，并且抑制EMT的發(fā)展進(jìn)程。進(jìn)而從細(xì)胞內(nèi)干擾TGF-β1的表達(dá)后，再次從細(xì)胞內(nèi)證明TGF-β1可以促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生EMT。

綜上所述，在細(xì)胞水平，TGF-β1在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用，促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生EMT，進(jìn)一步促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究有待在組織水平和動物水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。深入研究EMT對食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，對于尋找食管癌浸潤、轉(zhuǎn)移的阻斷治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

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(本文編輯 楊晨晨)

TGF-β1 promotes esophageal cancer Epithelial-Mesenchymal-Transition process

WANG Dong1,2, LIU Qing2, ZHENG Shutao2, LIU Tao2, DAI Fang2, YANG Chenchen1,LU Xiaomei3, Maimaitiaili Wumaer1

(1XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011,China；2ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity；3EsophagealCancerResearchInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegin,Urumqi830054,China)

Objective To investigate whether TGF-β1 could promote cell proliferation, migration, invasion and epithelial-mesenchymal-transition (EMT) process in Eca109. Methods With stimulation of TGF-β1 receptor inhibitor, the expression of TGF-β1 and EMT-associated mRNAs were detected by qRT-PCR; the expression of EMT-associated proteins were detected by western blot. Then TGF-β1 siRNA was transfected into Eca109 cells by lentiviral vector, the expression level of TGF-β1 was detected by qRT-PCR, EMT-associated proteins were measured by western blot after transfection. MTT, Wound-healing assay and transwell assay were performed to detect cell proliferation, migration and invasion ability. Results Treatment of TGF-β1 receptor inhibitor, TGF-β1 and Vimentin, Snail mRNA were significantly decreased, while the expression of E-cadherin mRNA was increased (P<0.05).EMT-associatedproteinscouldinducethedown-regulationofVimentinexpressionandup-regulatetheE-cadherinexpression.AftertransfectedwithTGF-β1siRNA,themRNAexpressionofTGF-β1andtheproteinexpressionofVimentinweredown-regulated(P<0.05),whiletheproteinexpressionofE-cadherinwasup-regulated.Furthermore,treatmentofTGF-β1receptorinhibitororTGF-β1siRNAinhibitedcellmigration,proliferationandinvasionability.ConclusionThesedatasuggestthatTGF-β1promotesesophagealcancerepithelial-mesenchymal-transitionprocess.

TGF-β1;ESCC;RNAi;cell proliferation; epithelial-mesenchymal-transition (EMT)

國家自然科學(xué)基金(81160303，81260359、U1303321); 新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)計(jì)劃(201430123-1)

王 棟(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子病理學(xué)。

買買提艾力·吾馬爾，男(維吾爾族)，副教授，研究方向：消化道腫瘤的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，E-mail： dashu_0@qq.com。 盧曉梅，女，博士，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34;R

A

1009-5551(2015)12-1471-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.003

2015-08-30]