小白菊內(nèi)酯改善胰島素抵抗的分子學(xué)機(jī)制*

?；o，何羨霞，海洋，吳新榮

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010)

小白菊內(nèi)酯改善胰島素抵抗的分子學(xué)機(jī)制*

?；o1，2，何羨霞2，海洋2，吳新榮2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010)

目的 探討小白菊內(nèi)酯(PTL)對胰島素抵抗(IR) 的作用及其分子學(xué)機(jī)制。方法 用不同濃度的胰島素對HepG2 細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)，通過葡萄糖氧化酶法測定HepG2 細(xì)胞葡萄糖含量，明確建立穩(wěn)定的HepG2胰島素抵抗模型的胰島素誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間。模型建立后，應(yīng)用不同濃度PTL分別作用于IR細(xì)胞24 h，通過CCK8法評價(jià)細(xì)胞活性，葡萄糖氧化酶法測定IR模型HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量，明確PTL最佳作用濃度，Q-PCR法檢測細(xì)胞核因子κB(NF-κB)及IκBα mRNA表達(dá)情況，免疫蛋白印跡技術(shù)檢測蛋白IκBα表達(dá)情況。結(jié)果 HepG2 細(xì)胞產(chǎn)生IR的最佳作用時(shí)間是24 h，最佳胰島素濃度為10 μg·mL-1。PTL的最佳作用濃度為 20 μmol·L-1，應(yīng)用其干預(yù)IR的HepG2細(xì)胞后，與IR的HepG2細(xì)胞相比，NF-κB活性明顯降低(P<0.05)，IκBα降解被抑制(P<0.05)。結(jié)論 PTL可明顯抑制IκBα降解，減少NF-κB解離， 改善高胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生的IR。

小白菊內(nèi)酯；胰島素抵抗；HepG2細(xì)胞；核因子κB；核因子κB抑制蛋白

小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTL)是從天然紫苑屬菊科植物Tanacetumparthenium中提取的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。近年來，有研究證實(shí)PTL具有改善胰島素抵抗(insulin resistence，IR)的作用[2]。另有文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病患者體內(nèi)核因子kappaB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路的激活與IR密切相關(guān)[3]，但PTL改善IR的效應(yīng)機(jī)制筆者尚未見報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)中建立高胰島素刺激人肝癌HepG2細(xì)胞所致IR模型，并采用PTL干預(yù)，觀察其效應(yīng)與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人肝癌HepG2細(xì)胞株(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供)。

1.2 試劑 PTL(成都瑞芬生物科技有限公司，批號：GR-133-130120，含量>98%)，二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，廣州威佳科技有限公司，批號：D5879)溶液配成100 mmol·L-1并保存于4 ℃。胎牛血清(Gibco，批號：96118006-2)，高糖培養(yǎng)液(DMEM/high glucose，批號：NXM0771，Hyclone),0.25%胰酶(Gibco，批號：21995)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8，武漢博士德生物工程有限公司，批號：C0038)葡萄糖檢測試劑盒(Glucose Assay Kit，武漢博士德生物工程有限公司，批號：GCK08)；總RNA提取試劑盒(TriPure kit，ROX，批號：11667165001)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthensis Kit，ROX，批號：04896866001)，熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master，ROX，批號：14526100)；蛋白測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：P0010),兔一抗β-actin(cst，批號：122625)、兔一抗IκBα(cst，批號：44D4)、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054)。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀(Biocell，型號：MultisKanS/N：1510-06233)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo，型號：LRH-250A)，凈化工作臺(AIRTECH，型號：BCM-1000A)，離心機(jī)(KUBOTA，型號：5220)，冷凍型微量離心機(jī)(Thermo，型號：FRESCO17S/N:40990590/75002420),普能PCR儀(Thermo，型號：MJminiS/N:012025)。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng) 將人肝癌HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代，每隔2 d換液，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 HepG2細(xì)胞IR模型的建立 將細(xì)胞按照每孔5 000個(gè)接種于96孔板上，分為正常對照組和模型對照組。待細(xì)胞貼壁80%后正常對照組加入正常培養(yǎng)液，模型對照組加入新配制的胰島素濃度分別4，8，10，20 μg·mL-1的培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育12，24，36和48 h，用葡萄糖氧化酶法分別測定各組細(xì)胞上清液葡萄糖水平，計(jì)算各模型對照組與正常對照組差值，差值越大IR越明顯。選擇24 h時(shí)間點(diǎn)測定CCK8，判斷各組細(xì)胞活性。通過葡萄糖消耗差值計(jì)算、CCK8測定細(xì)胞活性，確定胰島素最佳作用濃度和胰島素作用時(shí)間，通過葡萄糖消耗差值計(jì)算確定最佳胰島素濃度和胰島素作用時(shí)間，由此建立適宜的高濃度胰島素誘發(fā)的 HepG2細(xì)胞IR模型[4-6]。

1.6 PTL在HepG2的IR模型最佳實(shí)驗(yàn)濃度的篩選 復(fù)制IR模型，區(qū)組隨機(jī)化分組法分為8組，其中7組分別加入PTL濃度為5，7.5，10，15，20，50，75 μmol·L-1的完全培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，另一組作為模型對照組，同時(shí)以正常HepG2細(xì)胞作為正常對照組。正常對照組和模型對照組加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。藥物干預(yù)24 h后，測定各組細(xì)胞上清液糖含量，每孔加入CCK8試劑10 μL，輕輕震蕩混勻，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀(波長450 nm)測定吸光度(A值)，判斷細(xì)胞活性，確定PTL最佳實(shí)驗(yàn)濃度。細(xì)胞存活率(%)=(用藥組A值/正常對照組A值)×100%。

1.7 Q-PCR法檢測各組細(xì)胞NF-κB mRNA及IκBα mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，Trizol試劑提取總RNA，鑒定RNA完整性及純度，各實(shí)驗(yàn)組按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，cDNA產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。采用Rotor-Gene Q Series Software 1.7軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增及熒光檢測，PCR反應(yīng)條件為95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，70 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增目的基因，以β-actin作為內(nèi)參引物序列:β-actin:5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′(forward),5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′(reverse);NF-κB:5′-GGACCAGCAAAGGTTATTGTTC-3′(forward),5′-TTATACACGCCTCTGTCATTCG-3′(reverse)[7-8]；5′-ATGAATGGTGCGACAGCG-3′(forward),IκB:5′-CGTAGCCGAAGACGAGGG-3′(reverse)[9]。

1.8 Western blot 檢測IκBα蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取蛋白，蛋白試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白45 μg，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)，室溫封閉1.5 h，分別用一抗孵育4 ℃過夜，1×TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：5 000)二抗孵育1 h，1×TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，顯影，定影。Image J分析軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同胰島素濃度和胰島素作用時(shí)間對 HepG2 細(xì)胞IR的影響 見表1。隨著時(shí)間和胰島素濃度的增加，HepG2 細(xì)胞對葡萄糖的消耗量逐漸降低。胰島素濃度為4 ，8 μg·mL-1時(shí)，孵育細(xì)胞12，24，36，48 h后，與正常對照組(胰島素濃度為0)比較，模型對照組細(xì)胞上清液葡萄糖含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IR不明顯。與正常對照組比較，孵育細(xì)胞12 h后，10 μg·mL-1胰島素組HepG2細(xì)胞開始出現(xiàn)IR(P<0.05)，24 h后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IR明顯。與正常對照組比較，20 μg·mL-1濃度組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，HepG2 細(xì)胞上清葡萄糖含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IR明顯。不同濃度胰島素作用24 h后，CCK-8法吸光度值檢測，正常對照組吸光度值為(0.76±0.03)，10 μg·mL-1胰島素組吸光度值為(0.53±0.04)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20 μg·mL-1胰島素組吸光度值為(0.35±0.05)，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明高濃度胰島素誘發(fā)的HepG2細(xì)胞IR模型造模最佳胰島素濃度為10 μg·mL-1，最佳作用時(shí)間24 h。

表1 不同濃度胰島素不同作用時(shí)間的細(xì)胞上清液葡萄糖水平

與0 μg·mL-1胰島素比較，*1P<0.05,*2P<0.01

Compared with normal control group(without insulin)，*1P<0.05,*2P<0.01

2.2 PTL在HepG2的IR模型最佳實(shí)驗(yàn)濃度的篩選 見表2。不同濃度PTL干預(yù)后，與模型對照組比較，各濃度組葡萄糖消耗能力有一定程度提高(P<0.05)，IR狀態(tài)有所改善,且隨著PTL濃度增加，葡萄糖消耗量明顯增加，推測藥物有量效關(guān)系。藥物干預(yù)后，與模型對照組比較，50，75 μmol·L-1胰島素組細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTL最佳試驗(yàn)濃度為20 μmol·L-1。

2.3 Q-PCR法檢測各組細(xì)胞NF-κB mRNA及IκBα mRNA的表達(dá) 10 μg·mL-1胰島素作用于HepG2細(xì)胞24 h后 根據(jù) 2-ΔΔCt計(jì)算各基因相對表達(dá)量，正常對照組2-ΔΔCt值為1，模型對照組細(xì)胞NF-κB mRNA相對表達(dá)量(1.91±0.256)，IκBα mRNA相對表達(dá)量(0.78±0.180)，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明HepG2細(xì)胞產(chǎn)生IR后NF-κB mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，IκBα mRNA明顯下調(diào)；采用20 μmol·L-1PTL干預(yù)24 h后，NF-κB mRNA相對表達(dá)量(1.22±0.195)(P<0.05)，IκBα mRNA相對表達(dá)量(0.96±0.134)(P<0.05)，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明PTL干預(yù)后，HepG2細(xì)胞中NF-κB mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，IκBα mRNA表達(dá)上調(diào)。

表2 不同濃度PTL對IR模型對照組細(xì)胞上清液葡萄糖水平及細(xì)胞存活率的影響

與正常對照組比較，*1P<0.05

Compared with normal control group(without insulin)，*1P<0.05

2.4 Western blot 檢測IκBα蛋白的表達(dá) 以目的蛋白IκBα蛋白的條帶灰度均值作半定量比較，正常對照組灰度值為(0.632 2±0.231)，模型對照組IκBα蛋白灰度值為(0.373 8±0.256)，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；20 μmol·L-1PTL干預(yù)后IκBα蛋白灰度值為(0.600 4±0.195)，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明PTL可明顯抑制模型對照組IκBα蛋白降解。

3 討論

IR是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一， 若得不到及時(shí)改善，向心性肥胖、高脂血癥、冠心病、高血壓等代謝綜合征的危險(xiǎn)性將大大增加[10]。早期干預(yù)和治療以逆轉(zhuǎn)IR，成為治療2型糖尿病和代謝綜合征(metabolic syndrom,MS)的重要模式之一。有研究發(fā)現(xiàn)，PTL是繼阿司匹林后又一個(gè)具有抗炎作用的活性成分[11]， 另外已有研究報(bào)道證實(shí)，PTL也有類似阿司匹林的逆轉(zhuǎn)IR作用，但具體機(jī)制尚不清楚[12]。

本研究應(yīng)用高濃度胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞制備IR模型，模擬體內(nèi)IR發(fā)生過程。在IR建立過程中，以模型細(xì)胞的葡萄糖利用及細(xì)胞活力測定來判斷模型成功標(biāo)準(zhǔn)，最終確定10 μg·mL-1胰島素為最佳IR濃度， 24 h為最佳作用時(shí)間，成功建立HepG2細(xì)胞IR模型，從而為篩選治療2型糖尿病的中藥奠定了基礎(chǔ)。

正常情況下，NF-κB以一種不活潑的狀態(tài)存在，IκBα是調(diào)控NF-κB的關(guān)鍵蛋白，NF-κB未被激活時(shí)和IκBα形成復(fù)合物[13]。當(dāng)炎癥因子及其他誘導(dǎo)因素存在時(shí)，NF-κB被激活，IκBα被磷酸化，隨后被泛素-蛋白酶體途徑降解。NF-κB和IκBα解聚后，其核定位序列被暴露，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄[14]。因此，通過Western blot 檢測IκBα是否顯著降解是檢測NF-κB是否激活的一個(gè)重要指標(biāo)。研究證實(shí)，不管病程長短，糖尿病患者體內(nèi)均有NF-κB異常表達(dá)[15]。高胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞，IκBα蛋白降解，NF-κB信號通路被激活，20 μmol·L-1PTL干預(yù)后，已經(jīng)發(fā)生IR的HepG2細(xì)胞IκBα蛋白降解，表明PTL可以阻斷NF-κB信號通路表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，PTL能抑制高胰島素誘導(dǎo)的IR的HepG2細(xì)胞中IκBα蛋白降解，進(jìn)而抑制NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)一步表明PTL可以通過阻斷NF-κB信號通路來改善逆轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞的IR狀態(tài)，PTL在糖尿病的治療過程中可能具有重要作用，對延緩糖尿病的發(fā)展可能具有重要的臨床意義，但具體的作用靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.003

Molecular Mechanism of Parthenolide Improving Insulin Resistance Induced by Insulin

CHANG Huajing1，2，HE Xianxia2，HAI Yang2，WU Xinrong2

(1.GraduateSchoolofSouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China；2.DepartmentofPharmacy，GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA，Guangzhou510010，China)

Objective To investigate the reversal effect and molecular mechanisms of NF-κB inhibitor parthenolide (PTL) on insulin resistance (IR). Methods HepG2 cells were treated with insulin at different concentrations and time points, the glucose consumption of HepG2 cells was measuredviaglucose oxidase method to determine the best concentrations and time for establishing insulin-induced insulin resistance on HepG2 cells.After modeling, different concentrations of PTL were added in cells for 24 h for determining cell activity and glucose-consumption.Q-PCR was used to detect the expression of NF-κB and IκBα mRNA in cells, and western blot was used to detect the expression of protein IκBα. Results The best reaction time and concentration for insulin inducing resistance of HepG2 cells were 24 h and at 10 μg·mL-1.The optimum acting dose of PTL was 20 μmol·L-1.NF-κB activity was significantly reduced (P<0.05)， IκBα degradation was significantly inhibited (P<0.05) compared to HepG2 cells with insulin resistance upon intervention on insulin resistance HepG2 cells by PTL. Conclusion PTL can inhibit IκBα degradation and disassociation of it from NF-κB, which in turn improves insulin resistance, providing theoretical basis for preventing and treating diabetes with PTL.

Parthenolide; Insulin resistance; HepG2 cell; Nuclear factor kappaB; Inhibitor of nuclear factor kappaB

2014-03-22

2014-04-21

*廣東省重大科技專項(xiàng)(2011A080300004)

?；o(1990-)，女，山東菏澤人，在讀碩士，主要研究方向：中藥制劑開發(fā)。電話：020-88654670，E-mail：843118534@qq.com。

吳新榮(1959-) ，女，主任藥師，博士生導(dǎo)師，碩士，研究方向:中藥篩選及藥理研究。電話：020-88653476，E-mail:gzwxrong@yahoo.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0294-04