地塞米松預(yù)處理減輕小腸缺血-再灌注損傷*

袁偉，楊娟，陳美雪，潘莉萍

(1.三峽大學(xué)消化疾病研究所、宜昌市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科，宜昌 443000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430030)

地塞米松預(yù)處理減輕小腸缺血-再灌注損傷*

袁偉1，楊娟2，陳美雪2，潘莉萍1

(1.三峽大學(xué)消化疾病研究所、宜昌市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科，宜昌 443000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430030)

目的 探討地塞米松對小鼠小腸缺血-再灌注損傷的作用及其機(jī)制。方法 健康雄性C57BL/6小鼠18只，隨機(jī)分為3組(n=6)，分別為假手術(shù)組、模型對照組和地塞米松組。假手術(shù)組和模型對照組缺血前30 min腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，地塞米松組缺血前30 min腹腔注射地塞米松10 mg·kg-1，模型對照組和地塞米松組小鼠用血管夾夾閉腸系膜上動脈，置于32 ℃溫箱30 min后松開血管夾。再灌注24 h后處死小鼠，收集血清和小腸標(biāo)本。蘇木精-伊紅染色后觀察小腸黏膜病理形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行損傷評分，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測白細(xì)胞介素6(IL-6)、干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)，Western blotting 檢測p-AKT和AKT。 結(jié)果 假手術(shù)組、模型對照組和地塞米松組小腸損傷評分分別為(4±2)，(13±3)，(7±2)分。模型對照組IL-6、IFN-γ和TNF-α mRNA水平明顯上調(diào)，p-AKT表達(dá)明顯增加。與模型對照組比較，地塞米松組小腸損傷評分下降，IL-6、IFN-γ 和TNF-α表達(dá)降低，p-AKT表達(dá)進(jìn)一步增加。結(jié)論 地塞米松預(yù)處理可通過激活A(yù)KT信號通路抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕小腸缺血-再灌注損傷。

地塞米松；損傷，缺血-再灌注，小腸；炎癥

在腹部外傷、失血性休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、燒傷等病理狀態(tài)下，往往存在腸道缺血-再灌注損傷和功能障礙，腸屏障功能降低，腸內(nèi)細(xì)菌和毒素通過受損的腸黏膜進(jìn)入體循環(huán)，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，引起大量炎癥遞質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，造成全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，甚至發(fā)生多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF )[1-3]。采取有效措施避免或減少腸道損傷尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體激動藥可以減輕腸缺血-再灌注損傷，但具體機(jī)制不明[4]。地塞米松具有廣泛的抗炎效應(yīng)，筆者在本實(shí)驗(yàn)中利用小鼠腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)夾閉模型[5]，研究腹腔注射地塞米松對缺血-再灌注損傷后腸道的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 C57BL/6小鼠購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級，常規(guī)飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號：420005000，使用許可證號：SYXK(鄂)2010-0057。地塞米松(鄭州卓峰制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H41020057，批號：12074376)，水合氯醛(Google 生物科技有限公司，批號：SF0541)。TRIzol reagent (Invitrogen，USA，批號：15596-026)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia，USA，批號：A2301-1)，SYBR green(Takara，Japan，批號：D01010A)，qPCR引物(擎科生物技術(shù)有限公司，批號：A3804)，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎病實(shí)驗(yàn)室配制。紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher)、逆轉(zhuǎn)錄儀、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)儀(BIO-RAD IQ5)、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均為華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所提供。

1.2 動物模型的建立與分組 健康雄性C57BL/6小鼠18只，2個(gè)月齡，平均體質(zhì)量20～25 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對照組和地塞米松組，每組6只。地塞米松組術(shù)前0.5 h給予地塞米松10 mg·kg-1腹腔注射，假手術(shù)組和模型對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液；假手術(shù)組行假手術(shù)，模型對照組和地塞米松組行小腸缺血-再灌注手術(shù)。具體手術(shù)方式如下：麻醉狀態(tài)下，腹部正中切口，鈍性分離腸系膜上動脈根部，用微血管夾夾閉腸系膜上動脈根部，完全阻斷血流30 min后松開血管夾，恢復(fù)腸道血流形成再灌注。縫合腹部，術(shù)畢放回動物房。 假手術(shù)組則開腹后不夾閉腸系膜上動脈。24 h后處死小鼠，收集小腸標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)中，動物狀態(tài)較好，蘇醒較快，無死亡動物。手術(shù)后給予正常飲食飲水。

1.3 腸道組織學(xué)檢查 小腸組織切片經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋，HE染色之后，在光鏡下觀察小腸組織病理組織學(xué)變化。小腸損傷程度采用積分法[2]評估，0分：正常絨毛和腺體；1分：部分絨毛頂部上皮輕度受損；2分：上皮下腺體輕度受損；3分：上皮下間隙擴(kuò)大，毛細(xì)血管充血；4分：上皮與固有層中度分離，腺體受損；5分：部分絨毛頂部脫落；6分：絨毛脫落明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張；7分：固有層絨毛脫落，腺體受損明顯；8分：固有層開始消化分解；9分：出血、潰瘍。

1.4 Western blotting檢測 取小腸組織于分析天平稱質(zhì)量，每50 mg組織中加入RIPA裂解液(以1：50加入50×cocktail)1 mL，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃、12 000 r·min-1(r=8.6 cm)離心30 min后取上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。以含蛋白質(zhì)50 μg的上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V)后轉(zhuǎn)膜(聚偏二氟乙烯膜，恒流300 mA)，然后洗膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h，AKT (1：2 000)，p-AKT (1：1 000)，β-actin(1：3 000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑，Kodak化學(xué)發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白，并攝像。以Quantity one對條帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值。

1.5 qPCR檢測白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ) 稱取適量小腸組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測量濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。實(shí)時(shí)定量PCR檢測的引物序列見表1。

表1 IL-6、TNF-α和IFN-γ引物序列

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對缺血-再灌注損傷小腸組織結(jié)構(gòu)的影響 光鏡下觀察腸道組織病理學(xué)變化，可見假手術(shù)組腸道黏膜細(xì)胞排列基本整齊，結(jié)構(gòu)完整，無組織壞死、缺失及水腫，其損傷評分為(4±2)分；模型對照組可見小腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大，腺體受損及毛細(xì)血管充血、水腫，腸道組織有大量絨毛脫落、糜爛、炎性細(xì)胞浸潤、腸道組織結(jié)構(gòu)破壞，其損傷評分為(13±3)分；地塞米松組可見小腸缺血-再灌注損傷程度減輕，其損傷評分為(7±2)分。見圖1。

2.2 地塞米松預(yù)處理對TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA表達(dá)的影響 qPCR檢測顯示，與假手術(shù)組比較，模型對照組炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA水平明顯上調(diào)(χ2值分別為15.732，14.260，11.780，均P<0.01)；與模型對照組比較，地塞米松組炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(χ2=8.960，9.156，P<0.01和χ2=6.456，P<0.05)，見表2。

2.3 地塞米松預(yù)處理對p-AKT表達(dá)水平的影響 實(shí)時(shí)Western blotting檢測顯示，假手術(shù)組、模型對照組和地塞米松組p-AKT/AKT分別為0.15±0.03，0.27±0.04，0.45±0.08。與假手術(shù)組比較，模型對照組p-AKT表達(dá)水平明顯上調(diào)(χ2=8.960，P<0.01)，AKT表達(dá)沒有改變；地塞米松組p-AKT 表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)(χ2=5.712，P<0.05)，AKT表達(dá)沒有改變，見圖2。

3 討論

糖皮質(zhì)激素因其廣泛的抗炎和免疫抑制作用被廣泛用于臨床，地塞米松是一種經(jīng)典合成類糖皮質(zhì)激素，具有廣泛的代表性[6]。糖皮質(zhì)激素可通過激活糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)或不通過激活GR兩種方式發(fā)揮抗炎作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素對心臟、肝臟、腎臟等缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用[7-9]。腸道缺血-再灌注損傷常伴發(fā)于失血性休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷等病理狀態(tài)下，可導(dǎo)致腸道屏障功能降低，腸內(nèi)細(xì)菌和毒素通過受損的腸黏膜進(jìn)入體循環(huán)，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，引起大量炎癥遞質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，造成SIRS，甚至MOF等[2，10]。減輕腸道缺血-再灌注損傷成為學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。地塞米松因具有抗炎和免疫抑制作用，故筆者推測地塞米松對腸缺血-再灌注損傷也具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，小腸缺血-再灌注損傷可導(dǎo)致腸道充血、水腫、出血、壞死，腸腔內(nèi)可見糜爛、出血及潰瘍。常規(guī)HE染色病理切片可見腸絨毛毛細(xì)血管擴(kuò)張、瘀血，腸腺上皮細(xì)胞水腫、壞死脫落。地塞米松預(yù)處理后能明顯降低腸缺血-再灌注后腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，腸黏膜損傷評分明顯降低，說明地塞米松預(yù)處理對腸黏膜上皮細(xì)胞和腸道機(jī)械屏障具有明顯的保護(hù)作用。

腸缺血-再灌注過程中原發(fā)的低氧、氧自由基生成及通過受損腸壁的內(nèi)毒素均可能參與了小腸炎癥遞質(zhì)表達(dá)的介導(dǎo)，而炎癥在腸缺血-再灌注的發(fā)病中起重要作用。腸缺血-再灌注可顯著提高動物對內(nèi)毒素攻擊的敏感性，可使機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子及炎癥遞質(zhì)，使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，從而引發(fā)SIRS，甚至MODS。TNF-α、IL-6和IFN-γ都是強(qiáng)有力的促炎癥細(xì)胞因子[2]。地塞米松在腎缺血-再灌注損傷中可以抑制TNF-α、IL-6和IFN-γ 等促炎癥細(xì)胞因子釋放[11]。本研究顯示，腸缺血-再灌注后TNF-α、IL-6和IFN-γ等促炎癥細(xì)胞因子均明顯升高；地塞米松預(yù)處理組TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA水平則明顯降低，提示地塞米松可抑制促炎癥因子的釋放，控制持續(xù)擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)，防止腸黏膜局部及全身組織器官損傷，從而達(dá)到防治腸缺血-再灌注損傷的目的。但地塞米松抑制腸缺血-再灌注損傷釋放促炎癥因子的具體機(jī)制仍不清楚。

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.地塞米松組

表2 3組小鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ mRNA相對表達(dá)量比較

Tab.2 Comparison of the relative mRNA expression amount of TNF-α，IL-6 and IFN-γ among three groups of mice

組別TNF-αIL-6IFN-γ假手術(shù)組1.0±0.01.0±0.01.0±0.0模型對照組12.0±4.0*15.0±0.5*17.0±1.0*1地塞米松組5.0±0.8*23.0±0.5*23.0±0.8*3

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01; compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.地塞米松組

圖2 3組小鼠小腸組織中p-AKT和AKT的表達(dá)比較

A.sham operation group；B.model control group；C.dexamethasone group

Fig.2 Comparison of intestinal expression of p-AKT and AKT among three groups of mice

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT，也被稱為蛋白激酶B，最初被認(rèn)為是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidy-linositol-3-kinase,PI3K)的一個(gè)下游靶點(diǎn)?；罨腁KT在多種細(xì)胞信號的介導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用，這些信號涉及細(xì)胞生長、細(xì)胞存活(抗凋亡)、細(xì)胞周期進(jìn)程、分化、轉(zhuǎn)錄、翻譯和糖代謝，AKT的調(diào)節(jié)在炎癥過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，p-AKT信號通路參與了腎缺血-再灌注損傷和心臟缺血-再灌注損傷，而地塞米松可以調(diào)節(jié)p-AKT信號通路[11]。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了腸缺血-再灌注損傷能夠激活p-AKT，給予地塞米松可以進(jìn)一步激活p-AKT，推測地塞米松可以通過激活p-AKT信號通路抑制炎癥反應(yīng)從而拮抗腸缺血-再灌注損傷。但在腸缺血-再灌注損傷中，地塞米松激活A(yù)KT的具體信號通路目前依然不清楚，尚需進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.003

Pretreatment with Dexamethasone Ameliorates Intestinal Ischemia Reperfusion Injury

YUAN Wei1, YANG Juan2, CHEN Meixue2, PAN Liping1

(1.ResearchInstituteofDigestiveDisease，ThreeGorgesUniversity，DepartmentofDigestive,YichangCentralPeople'sHospital，Yichang443000，China；2.DepartmentofNephropathy，TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 ,China)

Objective To investigate potential effect and mechanism of dexamethasone (DEX) on intestinal ischemia reperfusion injury. Methods A total of 18 male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups(n=6 each): sham operation group, model control group , and DEX group.Mice in the model control and sham operation groups

intraperitoneal normal saline 0.5 hour before ischemia, and mice in DEX group received intraperitoneal injection of DEX 10 mg·kg-1, 0.5 hour before ischemia.Mice in the model control and DEX groups were placed in the 32 degree infant incubator for 30 minutes after clamping superior mesenteric artery, followed by clamps removal and reperfusion for 24 hours.Mice were then sacrificed to obtain the intestinal tissues.The pathology of intestinal tissues was observed after hematoxylin-eosin (HE) staining.The mRNA expression level of pro-inflammatory cytokines IL-6, TNF-α and IFN-γ were measured by PCR.The expression of AKT and p-AKT were measured by Western blotting. Results The level of mesenteric injuries in the sham operation group, model control group and DEX group was (4±2),(13±3),(7±2) points, respectively. The mRNA level of IL-6, TNF-α and IFN-γ and the expression of p-AKT were all higher in the model control group.Compared to the model control group, the level of mesenteric injuries, the mRNA level of IL-6, TNF-α and IFN-γ in DEX group were significantly attenuated, but the expression of p-AKT were further increased. Conclusion Pretreatment with DEX can reduce intestinal ischemia-reperfusion injury by activating AKT signaling pathway and suppressing inflammation.

Dexamethasone; Injury, ischemia reperfusion, intestine; Inflammation

2013-12-10

2014-06-13

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100264)

袁偉 (1979-)，男，湖北宜昌人，主治醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：腸道疾病。電話：(0)13477133590，E-mail：26012678@qq.com。

潘莉萍 (1979-)，女，湖北赤壁人，主治醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：腸道疾病。電話：(0)13872651937，E-mail：gunsuerlily2008@sohu.com。

R977.11；R965

A

1004-0781(2015)05-0574-04