法舒地爾對結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用*

望運(yùn)玲，岳源，武雙嬋，丁虹

(1.湖北省宜昌市第二人民醫(yī)院藥劑科，宜昌 443000；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430071)

·藥物研究·

法舒地爾對結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用*

望運(yùn)玲1，岳源2，武雙嬋2，丁虹2

(1.湖北省宜昌市第二人民醫(yī)院藥劑科，宜昌 443000；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430071)

目的 探討法舒地爾對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用。方法 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)雌性大鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組(0.9%氯化鈉溶液造模+腹腔注射0.9%氯化鈉溶液)、模型對照組(TNBS造模+腹腔注射0.9%氯化鈉溶液)和法舒地爾組(TNBS造模+腹腔注射法舒地爾4.5 mg·kg-1)，每組10只,連續(xù)給藥14 d。觀察法舒地爾對大鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結(jié)腸髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 及白細(xì)胞介素1β(IL-1β)含量的影響；蘇木精-伊紅(HE)染色觀察組織病理學(xué)變化；蛋白免疫印跡法觀察結(jié)腸組織Rho激酶含量變化。結(jié)果 正常對照組、模型對照組、法舒地爾組DAI評分分別為(0.00±0.00)，(7.76±1.32)，(3.20±0.98)分； MPO含量分別為(59.32±9.08)，(96.65±16.57)，(69.58±11.40) U·g-1； TNF-α含量分別為(0.15±0.11)，(0.28±0.22)，(0.20±0.62) ng·mL-1；IL-1β含量分別為(0.04±0.01)，(0.08±0.02)，(0.06±0.02) ng·mL-1；Rho激酶相對表達(dá)量分別為0.713±0.170，1.083±0.210，0.907±0.260。結(jié)論 法舒地爾可能通過降低Rho激酶的表達(dá)及減少炎癥因子的釋放來保護(hù)結(jié)腸炎模型大鼠。Rho激酶可能是治療炎癥性腸病的新靶標(biāo)。

法舒地爾；腸病，炎癥性；大鼠

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不確定的慢性腸道非特異性炎癥疾病，目前認(rèn)為腸黏膜免疫功能紊亂、感染、遺傳和環(huán)境等因素共同參與了IBD的發(fā)病過程[1]。目前治療策略著眼于控制炎癥和調(diào)節(jié)免疫，主要采用抗炎藥及免疫抑制藥治療，但始終未擺脫有效率低的現(xiàn)狀。研究表明，IBD中腸道血管的生理功能和血流狀態(tài)有所改變，三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的急性反應(yīng)中，腸微血管重構(gòu)后血容量增加，但血流速度減慢，灌注減少，導(dǎo)致腸道缺血缺氧、組織壞死，因此，逆轉(zhuǎn)血管功能不良可能有助于IBD的治療[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在IBD發(fā)生過程中，腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)Rho激酶活性增加[4]。在體內(nèi)，抑制Rho激酶通路可減少中性白細(xì)胞及單核細(xì)胞的浸潤，降低炎癥反應(yīng)[5]，改善微血管功能不良[6-7]。提示，減少Rho激酶表達(dá)有可能成為治療IBD的新靶標(biāo)。法舒地爾是Rho激酶抑制藥，可通過增加肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性，擴(kuò)張血管，改善腦組織微循環(huán)。但是，法舒地爾是否具有治療炎癥性腸病作用，能否成為治療IBD的新藥物，目前尚不清楚。鑒于此，筆者建立TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型，探討Rho激酶抑制藥法舒地爾對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠，雌性，體質(zhì)量220～240 g，武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[使用許可證號：SYXK(鄂)2008-0013；合格證號：SCXK(鄂)2008-0004]，在武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，溫度(25±2) ℃，濕度(60±10)%，12 h光照。

1.2 試劑 TNBS購于美國Sigma公司(批號：111M5001V)。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于美國R&D Systems公司。Rho激酶抗體購于武漢博士德公司(批號：O8D01)。鹽酸法舒地爾注射液購于天津紅日藥業(yè)股份有限公司(批號：1106021)。

1.3 模型制備與分組給藥 SD大鼠30只，據(jù)體質(zhì)量分層隨機(jī)分成3組，分別為正常對照組(0.9%氯化鈉溶液造模+腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液)、模型對照組(TNBS造模+腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液)和法舒地爾組(TNBS造模+腹腔注射法舒地爾4.5 mg·kg-1)，每組10只。造模前大鼠禁食24 h，自由飲水。參照文獻(xiàn)[8]建立大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,乙醚麻醉大鼠后用一直徑2.0 mm硅膠管由肛門輕緩插入8 cm，80 mg·kg-1TNBS溶解于體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液，緩慢推入結(jié)腸,迅速堵住大鼠肛門并倒拎60 s。正常對照組用0.9%氯化鈉溶液代替造模液，其他操作步驟相同。造模后第2天開始給藥，每日上午10：00時(shí)給藥，連續(xù)給藥14 d，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水?dāng)z食。

1.4 疾病活動指數(shù)( disease activity index，DAI) 評分實(shí)驗(yàn)過程中每日觀察大鼠體質(zhì)量變化和大便性狀，并且每天觀察或用糞便隱血試紙檢測大便帶血情況，參考文獻(xiàn)[9]的標(biāo)準(zhǔn)略作改動進(jìn)行DAI 評分，按下述指標(biāo)進(jìn)行積分，大鼠體質(zhì)量改變百分率(0分：無改變；1分：下降1%～5%；2分：下降～10%；3分：下降～15%；4分：下降>15%)、大便黏稠度(正常為0分；松散大便為2分；腹瀉為4分)和血便程度(正常0分；隱血陽性為2分；顯性出血為4分)，三者相加累計(jì)。

1.5 結(jié)腸組織大體形態(tài)和組織學(xué)評分 兩位不知實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的獨(dú)立觀察者對結(jié)腸組織進(jìn)行大體形態(tài)和組織學(xué)評分。解剖去結(jié)腸，測量結(jié)腸長度和質(zhì)量計(jì)算結(jié)腸單位長度質(zhì)量。肛門至盲腸段結(jié)腸沿腸系膜縱軸剪開，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，進(jìn)行大體形態(tài)評分。參照參考文獻(xiàn)[9]，0分：無損傷；1分：輕度充血、水腫,無糜爛或潰瘍；2分：中度充血、水腫,糜爛或淺潰瘍；3分：重度充血、水腫,黏膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍直徑<1 cm；4分：重度充血、水腫，壞死及潰瘍形成，潰瘍直徑>1 cm。切取距肛門8 cm處結(jié)腸組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察，按文獻(xiàn)[9]方法行病理評分( histological index，HI) 和結(jié)腸組織學(xué)損傷評分，指標(biāo)包括潰瘍、肉芽腫，纖維化按無、輕及重計(jì)為0，1，2分，病變深度(達(dá)黏膜下層1分，肌層2分，漿膜層3分),各項(xiàng)相加得總分。

1.6 結(jié)腸勻漿檢測髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)含量 在結(jié)腸三等分處切取3段0.5 cm腸段，去除脂肪系膜組織，平均兩等分，一份加0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液制備10%勻漿，按操作說明檢測MPO活性和TNF-α、IL-1β含量。

1.7 結(jié)腸組織Rho激酶含量檢測 取上述另一份結(jié)腸組織加入5倍RIPA(Radio-Immunoprecipitation Assay)裂解液，勻漿后低溫高速離心(4 ℃，12 000 r· min-1，r=5 cm，20 min)，取上清液后，二喹啉甲酸法測定并調(diào)節(jié)蛋白濃度。取預(yù)染蛋白Marker 5 μL，蛋白上樣量30 μL，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(80 V，30 min；120 V至染料移至凝膠底部)，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(200 mA，2 h)，5%牛血清清蛋白封閉過夜(4 ℃)，加入Rho相關(guān)蛋白激酶2(Rho kinase 2,ROCK2)一抗(1：400)，β-actin一抗(1：1 000)室溫孵育1.5 h，二抗(1：10 000)室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影，定影，曝光后，拍照用Quantity One 測定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對大鼠DAI及結(jié)腸質(zhì)量長度比的影響 模型對照組有2只大鼠死亡，結(jié)腸DAI評分、結(jié)腸質(zhì)量長度比顯著高于正常對照組。與模型對照組比較，法舒地爾組DAI評分、結(jié)腸質(zhì)量長度比顯著下降(F值分別為4.406，4.424，P<0.05或P<0.01)，提示法舒地爾可明顯減輕大鼠結(jié)腸炎癥損傷。見表1。

表1 3組大鼠DAI及結(jié)腸質(zhì)量長度比比較

Tab.1 Comparison of DAI and quality-length ratio of colon among three groups of rats±s

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group,*1P<0.01；compared with model control group,*2P<0.05

2.2 法舒地爾對結(jié)腸大體形態(tài)及組織病理學(xué)影響 大體形態(tài)觀察：正常對照組大鼠結(jié)腸均勻細(xì)長，顏色呈嫩粉色且色澤均一；模型對照組大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫、糜爛，腸壁增厚，伴有潰瘍，且形成巨結(jié)腸，黏膜表面壞死，病變處黏膜呈黑褐色；法舒地爾組腸黏膜充血、水腫、糜爛明顯改善，未見明顯巨結(jié)腸，僅個(gè)別出現(xiàn)小潰瘍愈合后的痕跡。大體形態(tài)評分見表2。

組織病理學(xué)觀察及評分：顯微鏡下放大100倍觀察可見,正常對照組無組織學(xué)損傷表現(xiàn)，黏膜層表面平滑；模型對照組為典型炎癥黏膜表現(xiàn)，腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜、黏膜下層甚至肌層有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤，潰瘍形成，邊緣腺體增生結(jié)構(gòu)異常，其周邊黏膜層及黏膜下層結(jié)構(gòu)紊亂、水腫、血管充血擴(kuò)張，有炎性滲出物。法舒地爾組未見明顯潰瘍，個(gè)別仍可見黏膜層呈不連續(xù)分布，黏膜下層和肌層有炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫及充血(圖1)。半定量結(jié)果顯示，模型對照組評分與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.995，P<0.01)；法舒地爾能顯著減輕TNBS引起的結(jié)腸組織病理變化(F=8.314，P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)評分及組織病理學(xué)評分

Tab.2 Morphology and histopathology scores on three groups of rats 分，±s

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group,*1P<0.01；compared with model control group,*2P<0.05

2.3 法舒地爾對大鼠MPO活性和TNF-α、IL-1β水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠結(jié)腸勻漿中MPO活性和TNF-α、IL-1β含量明顯增高；法舒地爾可降低TNBS引起的大鼠結(jié)腸MPO活性和TNF-α、IL-1β含量(F值分別為7.782，6.403，6.031，P<0.01或P<0.01)。見表3。

2.4 法舒地爾對大鼠結(jié)腸組織Rho激酶表達(dá)的影響 正常對照組、模型對照組和法舒地爾組大鼠結(jié)腸組織中Rho激酶的相對表達(dá)量分別為0.713±0.170，1.083±0.210，0.907±0.260，模型對照組Rho激酶的相對表達(dá)量高于正常對照組(P<0.01)；法舒地爾組Rho激酶的相對表達(dá)量低于模型對照組(F=4.051，P<0.05)。見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.法舒地爾組

表3 3組大鼠結(jié)腸MPO、TNF-α與IL-1β含量比較

Tab.3 Comparison of colonic content of MPO，TNF- α and IL-1β among three groups of rats±s

與正常對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與模型對照組比較，*3P<0.05

Compared with normal control group,*1P<0.05，*2P<0.01；compared with model control group,*3P<0.05

圖2 3組大鼠結(jié)腸Rho激酶表達(dá)

Fig.2 Rho kinase expression in colon of three groups of rats

3 討論

IBD是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性腸道非特異性炎癥疾病，經(jīng)典理論認(rèn)為腸黏膜免疫功能紊亂、感染、遺傳和環(huán)境等因素共同參與了IBD的發(fā)病過程。

Rho激酶在炎癥反應(yīng)中具有相當(dāng)重要的作用[10]，Rho激酶抑制藥在臨床中主要用于腦梗死等疾病[11]。同時(shí)，抑制Rho激酶可改善微循環(huán)，加快結(jié)腸黏膜修復(fù)，降低炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以降低大鼠DAI、結(jié)腸組織病變評分和結(jié)腸質(zhì)量長度比，改善組織病理狀態(tài)。表明法舒地爾可以改善TNBS誘導(dǎo)的UC的病變程度。MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的酶之一，與急性炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。法舒地爾組MPO活性均較模型對照組明顯下降，表明法舒地爾可減輕腸道中性粒細(xì)胞浸潤的急性炎癥反應(yīng)。

在IBD的發(fā)生過程中，釋放大量促炎因子，特別是TNF-α和IL-1β為其中的關(guān)鍵因子，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境中炎性級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。TNF-α作為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中啟動遞質(zhì)，主要由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，細(xì)胞因子之間形成網(wǎng)絡(luò)，擴(kuò)大炎癥連鎖反應(yīng)造成腸黏膜損傷，參與IBD炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。IL-1β被公認(rèn)為是介導(dǎo)UC發(fā)病的細(xì)胞因子之一[12]。IL-1β可通過激活T、B細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，促進(jìn)IL-2受體表達(dá)和其他細(xì)胞因子協(xié)同作用，促使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化和脫顆粒，同時(shí)促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放前列腺素、血栓素、血小板活化因子等，從而增加上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rho激酶抑制藥法舒地爾可以降低TNBS引起的炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放，降低TNBS引起的大鼠結(jié)腸的炎癥反應(yīng)。

Rho激酶增加或活性增高參與多種血管損傷病理過程；在血流動力學(xué)紊亂及炎癥發(fā)生過程中起重要作用；是參與細(xì)胞移動、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、中性粒細(xì)胞增多及血液高黏度的關(guān)鍵成分。降低Rho激酶活性，可抑制中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的浸潤，降低炎癥反應(yīng)。同時(shí)，抑制Rho激酶可以緩解血管收縮、血液高黏滯度及內(nèi)皮損傷等引起的血流動力學(xué)障礙，改善微循環(huán)。 鹽酸法舒地爾及其活性代謝產(chǎn)物羥化法舒地爾可有效抑制Rho激酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rho激酶抑制藥法舒地爾在下調(diào)Rho激酶表達(dá)的同時(shí)，降低TNBS引起的炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放。

本研究通過Rho激酶抑制藥法舒地爾干預(yù)TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以改善組織病變狀態(tài)，下調(diào)Rho激酶表達(dá)，減少炎癥因子的釋放。由此可見，法舒地爾可能成為治療UC的有效藥物，Rho激酶抑制藥可能是治療IBD的新方向。

[1] VAN DER MAREL S，MAJOWICZ A，VAN DEVENTER S，et al.Gene and cell therapy based treatment strategies for inflammatory bowel diseases[J].World J Gastrointest Pathophysiol，2011，2(6):114-122.

[2]PAPA A，SCALDAFERRI F，DANESE S，et al.Vascular involvement in inflammatory bowel disease:pathogenesis and clinical aspects[J].Dig Dis，2008，26(2):149-155.

[3] HATOUM O A，BINION D G，GUTTERMAN D D.Paradox of simultaneous intestinal ischaemia and hyperaemia in inflammatory bowel disease[J].Eur J Clin Invest，2005，35(10):599-609.

[4] HOROWITZ S，BINION D G，NELSON V M，et al.Incre-ased arginase activity and endothelial dysfunction in human inflammatory bowel disease[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292(5):G1323-G1336.

[5] CHATURVEDI L S，MARSH H M，BASSON M D.Role of RhoA and its effectors ROCK and mDia1 in the modulation of deformation-induced FAK，ERK，p38，and MLC motogenic signals in human Caco-2 intestinal epithelial cells[J].Am J Physiol Cell Physiol，2011，301(5):C1224-C1238.

[6] KONO T，OMIYA Y，HIRA Y，et al.Daikenchuto (TU-100) ameliorates colon microvascular dysfunction via endogenous adrenomedullin in Crohn's disease rat model[J].J Gastroenterol，2011，46(10):1187-1196.

[7] MIHAESCU A，SANTEN S，JEPPSSON B，et al.p38 Mito-gen-activated protein kinase signalling regulates vascular inflammation and epithelial barrier dysfunction in an experimental model of radiation-induced colitis[J].Br J Surg，2010，97(2):226-234.

[8] 周燕紅，何小飛，白育庭，等.銀杏葉提取物對大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(12):1605-1609.

[9]KIHARA N，DE LA FUENTE S G，F(xiàn)UJINO K，et al.Vanilloid receptor-1 containing primary sensory neurones mediate dextran sulphate sodium induced colitis in rats[J].Gut，2003，52(5) :713-719.

[10] KATAOKA C，EGNSHIRA K，INOUE S，et al.Important role of Rho-kinase in the pathogenesis of cardiovascular inflammation and remodeling induced by long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats[J].Hypertension，2002，39(2)：245-250.

[11] LI Q，HUANG X J，HE W，et al.Neuroprotective potential of fasudil mesylate in brain ischemia—reperfusion injury of rats[J].Cell Mol Neurobiol,2009 ,29(2):169-180.

[12] 李春雷，陳治水.白介素在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2008，13(2):146-149.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.001

Protective Effect of Fasudil on Inflammatory Bowel Disease of Rats

WANG Yunling1，YUE Yuan2，WU Shuangchan2,DING Hong2

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondPeople'sHospitalofYichangCity,Yichang443000,China; 2.KeyLaboratoryofCombinatorialBiosynthesisandDrugDiscovery,MinistryofEducation,SchoolofPharmaceuticalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430071,China)

Objective To investigate the treatment effect of fasudil on inflammatory bowel disease (IBD) in rats.IBD was induced by using an enema of trinitro-benzene-sulfonic acid (TNBS). Methods A total of 30 female SD rats were randomly divided into normal control group (0.9% sodium chloride for induction and 0.9% sodium chloride for treatment), model control group (TNBS for induction and 0.9% sodium chloride for treatment), and fasudil group (TNBS for induction and fasudil 4.5 mg·kg-1for treatment).The disease activity index(DAI) was estimated 14 days later.The MPO activity, TNF-α content and IL-1β level in the colon were investigated, while Rho kinase expression was detected by Western blot.The pathological changes were detected by HE staining. Results The DAI of the normal control, model control, and fasudil groups were: (0.00±0.00)，(7.76±1.32)，and (3.20±0.98), respectively.MPO activity was (59.32±9.08)，(96.65±16.57)，and (69.58±11.40) U·g-1, respectively.TNF-α was (0.15±0.11)，(0.28±0.22)，and (0.20±0.62) ng·mL-1, respectively.The level of IL-1β was (0.04±0.01)，(0.08±0.02)，and (0.06±0.02) ng·mL-1, respectively.Rho kinase expression was 0.713±0.170，1.083±0.210，and 0.907±0.260, respectively. Conclusion Fasudil excerts protective effects against IBD in rats by lowering the expression of Rho kinase and attenuating the release of inflammatory mediators, suggesting that Rho kinase could be a new therapeutic target for IBD.

Fasudil; Bowel disease, inflammatory; Rat

2014-03-03

2014-04-29

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273523)

望運(yùn)玲(1963-)，女，湖北宜昌人，主管藥師，從事臨床藥學(xué)工作。電話：(0)15171486487，E-mail:906290904@qq.com。

丁虹(1963-)，女，湖北武漢人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)和炎癥性腸病。電話：(0)13667255751，E-mail:dinghong1106@wuhan.edu.cn。

R975；R965

A

1004-0781(2015)05-0565-05